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上海地区2004-2008年流行性感冒病毒亚型分布及血凝素基因进化研究
目的 了解上海地区近几年的流行性感冒(简称流感)病毒型与亚型分布及甲亚型流感病毒血凝素(HA)基因的进化.方法 采集2004-2008年上海地区5个流感监测哨点流感样患者和聚集性流感暴发患者的962份咽拭子标本进行流感病毒分离鉴定,确定病毒型及亚型.对上海市不同年份、不同区域的甲型流感病毒散发、聚集性暴发分离株进行HA基因全片段测序,并与近几年世界卫生组织(WHO)疫苗推荐株进行比对分析,绘制基因进化树.结果 A/H3N2是近几年季节性流感的主要亚型,占阳性标本构成比为54.9%(162/295),但在2005年末至2006年夏季流行强度低,仅占阳性标本构成比分别为0%(0/16)和23.5%(8/34);A/H1N1在2005-2006年3个流行季节活跃,占阳性标本构成比分别达到21.4%(12/56)、43.8%(7/16)、76.5%(26/34),近2年分离株明显减少,占阳性标本构成比仅分别为0%(0/44)和5.0%(7/139);B型在2004年至2005年季节性流感中活动强度较高,占阳性标本构成比分别为42.9%(24/56)和56.2%(9/16),在2006-2007年季节性流感中未分离到,2008年流行强度又有增加,占阳性标本构成比为34.5%(48/139).2005-2008年,A/H1N1 HA基因进化树显示,同一年份HA基因成簇分布,序列相近;2004-2008年,A/H3N2 HA基因进化树显示,虽然同一年份序列相近,但相近序列进化枝插有相近年份的分离株,并且同一年份存有变异较大的序列.A/H1N1、A/H3N2流行株的序列与当年WHO的疫苗推荐株序列相似.结论 各年份流感流行的型与亚型分布不同,A/H3N2是近几年季节性流感的主要亚型.同一年份的A/H1N1、A/H3N2 HA基因序列成簇分布,但在A/H3N2同一年份的进化枝中插有相近年份的分离株序列,并且存在变异较大的序列.近年,WHO疫苗推荐株HA序列与当年流行株序列相近.
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2008-2012年武汉市儿童流行性感冒病毒及呼吸道合胞病毒流行特征
目的 了解2008-2012年武汉市14岁及以下流行性感冒(简称流感)样症状患儿流感病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)的感染情况及病毒流行特征.方法 于2008年7月至2012年6月在武汉市某医院门诊和急诊患者中,选择14岁以下的流感样病例作为研究对象,共2854例.研究对象各采集1份咽拭子标本,共采集2854份.从流感样病例咽拭子标本中提取病毒核酸,应用实时荧光定量逆转录PCR (RT-PCR)对流感病毒和RSV进行核酸检测和亚型鉴定,分析两种病毒感染的时间和年龄特征.结果 2854例患儿检测流感病毒阳性758例,阳性率为26.6％.其中,甲型流感病毒阳性547例(19.2％)、乙型流感病毒阳性211例(7.4％).流感病毒每年流行呈双峰特征,即夏季峰和冬春季峰.6～ 14岁组患儿流感病毒检测阳性率为48.0％(275/573),明显高于3～5岁组[26.6％ (213/801)]和3岁以下组[18.3％ (270/1480)],差异有统计学意义(x2=187.432,P＜0.01).患儿中RSV检测阳性219例,阳性率为7.7％,其中,RSV-A阳性108例,RSV-B阳性112例,混合感染1例.RSV流行呈明显的季节性,发病主要集中在秋、冬、春季,占全部发病病例的96.8％(212/219),每年流行情况波动较大.RSV-A、RSV-B交替流行,交替周期为2年,2008年9月至2009年5月及2009年12月至2010年3月以RSV-B感染为主,分别占76.6％(36/47)和96.9％(62/64)；2010年11月至2011年3月及2011年9月至2012年4月以RSV-A感染为主,分别占92.5％(37/40)和100.0％(48/48).但随着年龄的增长,RSV-A和RSV-B阳性率不断下降(RSV-A:x2=36.223,P ＜0.01；RSV-B:x2=36.281,P＜0.01),其中,RSV-A在＜1、1、2、3、4、5 ～9、10～ 14岁年龄组阳性率分别为7.0％ (26/373) 、5.9％ (39/662) 、4.0％ (18/445) 、3.2％ (13/406)、1.3％(3/236)、1.4％(7/517)、0.9％ (2/215)；RSV-B在各年龄组的阳性率分别为6.4％(24/373) 、6.0％(40/662)、4.5％(20/445)、4.4％(18/406)、1.3％(3/236)、1.0％(5/517) 、0.9％(2/215).0～3岁组RSV阳性197例,占RSV阳性患者总数的90.0％(197/219).2009年11月甲型H1N1流感暴发流行时,RSV阳性率为3.0％ (3/100),低于2008、2010、2011年同月份RSV检测阳性率[分别为18.2％ (6/33)、10.8％ (10/93) 、10.0％ (4/40)],差异有统计学意义(x2=8.450,P＜0.05)；2011年1月甲型H1N1流感暴发流行时,RSV阳性率为5.7％(3/53),低于2009、2010、2012年同月份RSV检测阳性率[分别为21.7％(5/23) 、28.6％(22/77)、16.0％(8/50)],差异有统计学意义(x2=11.233,P＜0.05)；2011年9月,流感夏季峰缺失时,RSV检测阳性率为25.0％(10/40),高于2008、2009、2010年同月份RSV检测阳性率[分别为11.4％ (4/35) 、1.7％ (2/118)、0.0％ (0/109)],差异有统计学意义(x2=32.521,P ＜0.01).结论 流感病毒和RSV是武汉地区流感样患儿重要的病原,两种病毒流行的季节性、年龄分布等特征各不相同,流感病毒对RSV的流行存在着一定的抑制作用.
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环介导等温扩增技术在流感病毒检测中的应用
流感病毒是引起人类流感的病原体之一,属于正黏病毒科,分为甲型、乙型和丙型流感病毒,其中甲型和乙型流感病毒对人类具有流行病学意义.流感病毒感染可导致一系列呼吸道疾病,临床症状从轻微的上呼吸道症状至急性呼吸窘迫综合征和多器官功能衰竭,甚至死亡[1].流感大流行传播迅速,波及范围广,发病率和死亡率高,严重威胁着人类健康.1918年的H1N1"西班牙流感"、1957年H2N2"亚洲流感"和1968年H3N2"香港流感"三次流感大流行导致全球超过5000万人死亡.近暴发的2009年新甲型H1N1流感大流行,全球估计有数亿人感染,约2万确诊死亡病例[2].因此流感病毒的早期快速检测技术对于流感的防控及治疗具有重要的意义.
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人流感病毒核蛋白的重组表达及其抗原性分析
目的 探索用原核表达的人甲3型流感病毒核蛋白(NP)免疫小鼠所获得的抗重组蛋白抗体检测甲型流感病毒的可行性.方法 用Clustal X, Antheprot等软件,对IFV-A3 NP进行分析,确定保守区并分析其抗原性.RT-PCR获得NP基因,分3段克隆NP基因到PET-28(c),并在B121中诱导表达.经Ni-Agarose亲和层析柱纯化后,免疫BALB/c鼠制备抗重组蛋白抗体.用Western Blot和免疫组化法检测抗重组蛋白抗体与病毒抗原的反应性.结果 重组质粒在BL21中高效表达,表达量为15-20 m9/L菌液.Western Blot检测显示,抗NP1、NP2、NP3多克隆抗体(1:2000)均对流感病毒NP具有反应性.免疫组化检测也显示,抗NP1、NP2、NP3多克隆抗体对IFV-A3、-Al感染的MDCK细胞有特异性染色,抗体滴度从1:640到1:1280.结论 重组表达的NP能够诱导产生高效价多克隆抗体,所产生的抗体与IFV-A3、A1具有交叉免疫反应性.通过生物信息学分析预测抗原性并制备多克隆抗体是可行的,并可望用于流感病毒感染的早期快速诊断的研究中.
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应用噬菌体表面展示技术筛选流感病毒H3N2抗原模拟表位
目的 筛选特异性流感病毒H3N2抗原模拟表位,为开展新的流感病毒疫苗研究探索新的途径.方法 应用噬菌体表面展示技术,以抗-H3N2的单克隆抗体作为固相筛选分子,对人工合成的噬菌体随机肽库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程,在第5轮筛选后,随机挑取48个克隆,经噬菌体酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定并进行交叉反应实验以及竞争抑制性实验,后对所选克隆进行DNA序列分析,以确定H3N2抗原的模拟表位.结果 经噬菌体富集后,从随机筛选的48个克隆中得到21个阳性克隆,经ELISA鉴定及交叉反应实验、竞争抑制性实验后,确定氨基酸序列XTXPYXX为H3N2的模拟表位.结论 用噬菌体7肽库筛选得到H3N2的模拟表位,为开展用流感病毒模拟表位探索新的防治方法研究奠定了基础.
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H1N1亚型流感病毒NA基因在昆虫杆状病毒系统中的表达及鉴定
目的 构建含有H1N1亚型流感病毒NA基因的重组杆状病毒.方法 用PCR方法扩增甲型H1N1亚型流感病毒(A/PR8/34)全长神经氨酸酶基因,并将其连接于pFastBacdual载体,构建杆状病毒转移载体pFBD-NA.转化含有Bacmid的DH10B感受态细胞后,获得重组穿梭载体rBacmid-NA.将其转染昆虫细胞sf9,获得重组病毒rBac-NA.提取重组杆状病毒rBac-NA的DNA并使用PCR方法检测；采用间接免疫荧光,SDS-PAGE,Western Blot鉴定以及ELISA方法检测所表达的NA蛋白.结果 经PCR鉴定所构建质粒rBacmid-NA正确；使用间接免疫荧光检测可见特异性绿色荧光位于感染细胞的表面,Western Bolt检测可与小鼠抗PR8株多克隆抗体和兔抗甲型流感病毒NA多克隆抗体发生特异性免疫反应；经ELISA检测,NA蛋白可被鼠抗流感病毒(PR8)多克隆抗体特异性识别.结论 上述结果证明,我们获得了表达流感病毒NA蛋白的重组杆状病毒,为进一步研究NA蛋白的功能和新型流感疫苗的开发奠定了基础.
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H1N1亚型流感假病毒评价中和抗体的研究
目的 采用流感假病毒检测高致病性流感病毒中和抗体,以评价人群保护力.方法 构建H1N1亚型流感假病毒作为病毒抗原,同时采用血抑试验和细胞病变中和试验方法,检测NIBSC标准血清、单克隆抗体(McAb)、羊抗血清以及人群样本血清中的抗体滴度,并与天然完整病毒相比较.结果 在两种检测方法中,假病毒与天然完整病毒检测McAb、NIBSC标准血清和羊抗血清的抗体滴度结果接近,差异无统计学意义(P＞0.05).检测采自2013年的300份人群血清H1N1亚型流感病毒抗体的阳性率,人群中假病毒与天然完整病毒检测结果呈显著的高度正相关关系(P＜0.001),相关系数为0.96.人群中抗H1N1抗体阳性率达54.7％,抗体滴度25.70 (22.39,29.51).结论 假病毒可用于流感中和抗体的评价.
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蚀斑减数试验的建立及在体外抗流感病毒药物敏感性试验中的应用
目的 建立PRA以评估奥司他韦(达菲)、金刚烷胺、利巴韦林和板蓝根4种药物的体外抗流感病毒作用.方法 建立PRA,选取临床分离的流感病毒株8株,其中甲型流感病毒3株,乙型流感病毒5株.病毒培养并接种,利用PRA测定奥司他韦、金刚烷胺、利巴韦林和板蓝根4种药物体外对流感病毒的IC_(50)值.结果 8株甲、乙型流感病毒临床分离株的PRA测定结果显示,奥司他韦对甲型流感病毒IC_(50)值为0.064-0.128 mg/L,金刚烷胺为0.5 mg/L,利巴韦林对甲型流感病毒不敏感(IC_(50)>8 mg/L),板蓝根无抗病毒作用;奥司他韦、金刚烷胺、利巴韦林和板蓝根对乙型流感病毒均未发现体外抗病毒作用.结论 奥司他韦和金刚烷胺对甲型流感病毒敏感,利巴韦林不敏感,板蓝根无抗病毒作用,该4种药物未发现体外抗乙型流感病毒作用.
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逆转录-环介导等温扩增方法检测甲型H1N1流感病毒
2009年3月墨西哥暴发"人感染猪流感"疫情,造成人员死亡.研究发现,此次疫情的病原为变异后的甲型H1N1流感病毒,甲型H1N1流感病毒属于正黏病毒科(orthomyxoviridae),甲型流感病毒属(influenza virus A).该毒株包含有猪流感、禽流感和人流感3种流感病毒的基因片段,可以在人间传播.
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H9N2亚型禽流感病毒血凝素抗体乳胶凝集检测方法的建立
禽流感病毒(avian influenza vires,AIV)是一种RNA病毒,属于正黏病毒科(orthomyxoviridae)A型流感病毒属.A型流感病毒根据其表面血凝索(hemagglutinin,HA)与神经胺酸酶(neuraminidase,NA)抗原性的不同可分为若干亚型,目前已发现的A型流感病毒的血凝素有16个亚型(H1～16),神经氨酸酶有9个亚型(N1～9)[1].1997年中国香港暴发H5N1亚型高致病性禽流感,导致18人感染,6人死亡,这引起了人们的疑虑:H9N2亚型禽流感病毒能否跨越种间障碍从而导致人群的感染?1998-1999年,广东省以及香港地区暴发了H9N2亚型禽流感,直接导致多人感染[2-3].2003年11月,香港地区又发生了H9N2亚型禽流感病毒感染人的事件[4].
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应用小瓶离心培养法分离检测2009年1-6月广州市成人流感样病例相关病毒
目的 应用高通量的小瓶离心法快速分离检测广州市成人流感样病例相关病毒,分析广州地区患有ILI的成人呼吸道病毒感染情况,评价其在临床实验室开展快速病毒培养的意义.方法 采集2009年1-6月广州市成人流感样病例患者标本652份,应用小瓶离心法(包括MDCK、HEp-2、LIE-MK_2和MRC-5 4种细胞),离心接种后,通过观察CPE、血凝(HA)、血吸附(HAD)及直接免疫荧光法(IF)等方法进行病毒分离鉴定.结果 652份成人流感样病例标本中共检出阳性161份,5种病毒病原体,病毒培养阳性率为24.69%,其中甲型流感病毒62株(62/161,38.51%),乙型流感病毒88株(88/161,54.65%),副流感病毒8株(8/161,4.96%),腺病毒2株(2/161,1.24%),呼吸道合胞病毒1株(1/161,0.62%).用小瓶离心培养法发出各种病毒培养报告的平均时间分别为:流感病毒2 d、腺病毒3 d、副流感病毒3 d.结论 (1)离心培养法具有快速、灵敏、高通量的特点,对临床实验室诊断病毒具有应用推广价值.(2)在分离的Iu病原体中,流感病毒占主导,乙型流感病毒为优势毒株,自2009年1月延续至6月,并呈逐步增多的态势,出现夏季高峰.
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多重RT-PCR同时检测8种呼吸道病毒方法的建立
呼吸道病毒分别在2组多重RT-PCR体系中被成功扩增,评估结果显示呼吸道合胞病毒、鼻病毒和冠状病毒229E第一轮多重RT-PCR与普通RT-PCR结果的一致性分别为97.9%、95.8%和95.8%;第二轮多重半巢氏PCR与普通PCR扩增结果一致性分别为48/48、47/48和48/48;其他5种病毒的2轮扩增的结果一致性均为100%.结论 2组多重RT-PCR与普通RT-PCR扩增结果均具有较高的一致性,一种可以同时检测8种常见呼吸道病毒的多重RT-PCR检测方法被初步构建.
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流感样疾病的病原学与治疗及预后的关系
目的 了解北京地区"流感样疾病"的病原谱与抗菌药物治疗及预后的关系.方法 采用前瞻性队列研究方法 ,选取符合卫生部流感样疾病定义的发热门诊患者,留取咽分泌物进行细菌学和病毒学榆测,调查患者的年龄、基础疾病、呼吸道症状、肺外表现和实验室检查,分析治疗和预后的关系.采用SPSS 10.0统计软件进行汇总分析.计量资料采用t榆验或秩和检验,计数资料采用χ2检验,退热时间的影响因素采用Cox回归分析.结果 2006年12月至2007年4月共入选"流感样疾病"患者476例,终资料完整的454例纳入分析.除副流感嗜血杆菌外,流感病毒是主要的致病原(197例,43.4%),其他病原体少见.454例患者的平均年龄为(33 ±13)岁,男:女为1.1:1,1年内有流感疫苗接种史的24例(5.3%),接受抗菌约物治疗的288例(63.4%),无接受奥司他韦或金刚烷胺等抗流感病毒药物的患者.与流感病毒阴性组相比,流感病毒阳性组年龄较大、基础疾病较多,咳嗽、咽痛和全身症状的比例较高,但无统计学意义.流感病毒阳性组表现为流感综合征(体温≥39℃,同时伴有咳嗽、咽痛、头痛或全身肌肉酸痛)的比例显著高于流感病毒阴性组.流感病毒阳性组197例中用抗菌药物治疗的132例(67.0%),抗菌药物治疗组外周血白细胞总数、中性粒细胞比例、血小板计数高于未用抗菌药物组;应用抗菌药物组的医疗费用比不用抗菌药物组约高1倍,但平均退热时间、症状缓解时间及复诊率无统计学意义.Cox回归分析结果 显示,白细胞和中性粒细胞百分比增高是退热时间延长的独立危险因素(OR值分别为1.049和1.014),但抗生素使用不影响退热时间.结论 在冬春季节北京地区"流感样疾病"的主要病原体是流感病毒;对于单纯"流感样疾病",抗菌药物治疗不缩短病程,但费用却大大增加.因此,研究并制定流感样疾病诊断和治疗规范非常必要.
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托高土病毒属对人类致病的现状
2015年2月20日，美国卫生当局宣布发现一种新的致命性蜱传病毒--“波本病毒（ Bourbon virus）”，经美国疾病控制和预防中心鉴定为正黏病毒科托高土病毒属（ Thogotovirus ）的新种，这一发现引起了医学界及媒体的广泛关注［1-2］。
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妊娠合并新发现病毒感染
妊娠期妇女由于机体生理及免疫功能的改变,易受病原体感染,其中大多数为病毒感染.本文就近10多年来新发现的流行病毒,孕妇感染诊断、防治策略和不良母儿结局进行阐述.
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实时荧光聚合酶链反应方法在2006年广州地区儿童流行性感冒病毒监测中的应用
目的 应用实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法检测流感病毒,并对2006年广州地区儿童感染流感病毒进行流行病学分析.方法 以流感病毒的NP基因序列为参考,综合分析GenBank上的NP基因序列,使用引物和探针设计软件Primer Express设计A/B型流感病毒及A亚型流感病毒各1对特异性引物和1条TaqMan荧光探针,用于分别检测A/B型流感病毒及A亚型流感病毒,建立实时荧光PCR方法,进行灵敏度和特异性检测.采用实时荧光PCR方法,对来自2006年门诊或住院呼吸道感染患儿的12 301份咽拭子或鼻腔抽洗液样本进行检测,并与病毒分离方法进行对照.结果 实时荧光PCR方法共检出1687份阳性样本,总阳性率为13.71%,其中A型773份(45.8%),全部为H1N1型;B型914份(54.2%).1-4月份检出流感病毒阳性525例,其中B型流感病毒455例(86.7%),A型(H1N1)流感病毒70例(13.3%);5-8月份检出流感病毒阳性1118例,其中B型流感病毒419例(37.5%),A型(H1N1)流感病毒699例(62.5%).病毒培养分离阳性为1380份,均为实时荧光PCR方法阳性,占实时荧光PCR方法阳性者的81.80%.结论 实时荧光PCR方法应用于流感病毒的检测具有简便快捷、特异、敏感的特点,2006年广州地区儿童流行性感冒病毒的流行1-4月份以B型流感病毒为主,5-8月份以H1N1亚型流感病毒为主.
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流感泰得小分子化合物修饰前后细胞摄取的比较
目的 在反义寡核苷酸流感泰得(Flutide, FT)上偶联神经氨酸酶抑制剂奥司他韦,以期通过特定小分子化合物的修饰提高细胞对流感泰得的摄取,进而提高其抗流感的作用.方法 采用3′荧光标记控孔玻璃珠(3′FAM CPG)合成全硫代修饰的流感泰得,并对其5′端进行巯基修饰,与结构改造后的奥司他韦分子进行连接得到流感泰得与奥司他韦偶联物(FTO);修饰前后的反义药物直接转染流感病毒感染的人肺癌上皮A549细胞,通过荧光显微镜观察及流式细胞技术检测FTO与FT的胞内荧光强度来进行反义药物偶联小分子化合物前后胞内摄取量的比较;采用CCK8细胞增殖检测技术进行FT与FTO体外抗流感病毒活性评价.结果 得到一种新的寡核苷酸偶联物FTO;荧光显微镜观察结果显示,细胞给予FTO后荧光强度强于FT;流式细胞检测结果表明,修饰后的FTO胞内平均荧光值明显高于修饰前的FT,其中给药12 h时,病毒感染细胞+FTO(BFTO)组的平均荧光值比病毒感染细胞+FT(BFT)组增加了(102.3±56.0)%,正常细胞+FTO(ZFTO)组的平均荧光值比正常细胞+FT(ZFT)组增加了(89.4±44.7)%;给药24 h后BFTO组的平均荧光值比BFT组增加了(115.2±28.4)%,ZFTO组的平均荧光值比ZFT组增加了(102.9±12.1)%,(P＜0.05);体外抗流感病毒活性评价显示,FTO与FT的IC50值分别为(1.57±0.08)μmol/L与(4.44±0.11)μmol/L.结论 流感泰得采用奥司他韦修饰后有助于提高其在细胞内的摄取量以及抗流感病毒活性.
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部分营区新兵流感样病例快速检测和治疗
冬春季节是急性呼吸道病毒性感染的高发期,笔者分别两次到驻京部队5个新兵营应用流感(Flu)A、B型快速诊断试纸条检测了有急性呼吸道感染症状以及与这些有症状的战士同住一室的人,并给予有症状者发放药物治疗感冒.报告如下.
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流感病毒诊断方法的研究进展
流行性感冒病毒属于正黏病毒科,是一类带包膜、分节段的单股负链RNA病毒,可分为甲、乙、丙三型.其中甲型和乙型流感病毒基因组均含有8个RNA片段,分别编码PB1,PB2,PA,HA,NA,NP,Ml,M2,NS1,NS2(NEP)共10种蛋白;
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流感病毒的致病机理研究进展
流感病毒属于正黏病毒科流感病毒属.具有多种形态,可呈杆状或丝状,一般为球形.
