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弓形虫微线体蛋白1部分基因的克隆、测序及表达
目的构建弓形虫ZS2株pWR450-1-微线体蛋白1(MIC1)原核表达重组质粒,对MIC1基因进行序列测定,并在不同大肠杆菌中表达.方法用PCR技术从弓形虫ZS2株的基因组DNA中扩增编码MIC1的基因片段,酶切,连接,重组入pWR450-1表达载体,再经含氨苄培养基筛选、酶切、PCR鉴定,进行序列测序后转化大肠杆菌TG-1、JM109(DE3)和DH5α.在不同菌体浓度及不同剂量异丙基-β-D-硫代半乳糖诱导下,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定MIC1融合蛋白的表达.结果从ZS2株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段,克隆后获得pWR450-1/MIC1重组质粒,测序结果表明,MIC1这部分基因与弓形虫RH株相应基因序列完全一致,高度保守.该基因可在不同大肠杆菌中表达相对分子质量约70 000的融合蛋白.结论构建了弓形虫ZS2株pWR450-1-MIC1重组质粒,为研究MIC1的结构与功能奠定了基础.
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编码弓形虫表面抗原P30、P22复合基因真核表达载体的构建
目的构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒, 为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备. 方法用弓形虫RH株腹腔接种小鼠,收集腹水,酚/氯仿法抽提弓形虫基因组DNA;用PCR技术从基因组DNA中扩增编码表面抗原P30、P22的基因片段,分别重组入pMD18-T载体中.将pMD18-T载体中的P30、P22基因片段分别酶切,定向克隆入pUC18克隆载体中, pUC18-P30-P22中的P30-P22片段经酶切、纯化后,亚克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,用酶切、PCR及测序的方法对重组子进行鉴定. 结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的P30及P22片段;大小均与预测值相符;克隆pUC18-P30-P22重组质粒的酶切片段分别与P30、P22基因大小一致;经亚克隆、筛选鉴定获得了pcDNA3.1-P30-P22重组质粒,所测P30、P22基因序列与文献报道一致.结论成功构建弓形虫pUC18-P30-P22重组质粒和pcDNA3.1-P30-P22重组质粒,为研制弓形虫DNA疫苗奠定了基础.
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肿瘤患者弓形虫感染调查
弓形虫属于一种机会性致病原虫,对免疫缺陷、免疫功能低下及免疫抑制患者有潜在的威胁.现已证明,不少肿瘤患者细胞免疫功能低于正常人,且在抗肿瘤治疗过程中,化疗及放射治疗,使患者免疫功能进一步降低,因而对机会性感染的病原体特别易感.本实验采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对112例临床确诊恶性肿瘤患者和78例健康体检者进行了弓形虫循环抗原(CAg)、抗弓形虫抗体IgM、IgG检测,了解肿瘤患者弓形虫感染状况,探讨弓形虫感染与该人群的相关性,结果报告如下.
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1307例育龄妇女血清TORCH抗体定量检测结果分析
目的 了解昆明地区育龄妇女弓形虫(TOX)、风疹病毒(RV)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒( HSV),总称为TORCH的感染状况，为预防妊娠TORCH感染、降低新生儿出生缺陷发生率提供参考资料。方法 采用德国virion/serion酶联免疫吸附试验(ELISA)定量试剂，对1307例育龄妇女血清TORCH感染特异性IgM及IgG抗体进行检测，并对其结果进行分析。结果 1307例育龄妇女TORCH感染特异性IgM抗体总阳性率为1.45％，其中TOX：2.83％；RV：2.37％；CMV：0.46％；HSV：2.45％。特异性IgG抗体总阳性率为63.60％，其中TOX：3.98％；RV：72.30％；CMV：97.78％；HSV：80.34％。不同孕期妇女TORCH感染特异性抗体检出率差异无统计学意义。结论 本次调查中，1307例育龄妇女存在一定比例的TORCH现症感染，建议妊娠妇女尽可能进行TORCH筛查，以便尽早采取相应措施，避免由TORCH感染导致出生缺陷发生。
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新生儿TORCH感染的血清学检测与临床分析
目的对新生儿进行TORCH感染的血清学检查及临床表现分析.方法用ELASA法检测血清中TORCH(弓形体、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒)IgM.结果2000年1月至2003年1月本院新生儿重症监护室(NICU)共收治新生儿1 554例,其中48例为TORCH感染,巨细胞病毒感染率高占52.1%;风疹病毒感染占33.3%;单纯疱疹病毒感染占14.6%.未发现弓形体抗体阳性的患儿.结论新生儿TORCH感染可造成多器官损伤,主要为听力异常、高胆红素血症和肝功能异常、神经系统损伤、心肌损伤、血小板减少、先天性心脏病.计划免疫、母亲孕期筛查、新生儿早期筛查、干预治疗非常重要.
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孕前及孕早期TORCH感染检测临床分析
目的 为优生优育、提高人口素质,探讨早期预防和治疗TORCH(T.弓形虫;R.风疹病毒;C.巨细胞病毒;H.单纯疱疹病毒;O.其他病毒)孕期感染,并对阳性患者进行了治疗和优生指导.方法 应用酶联免疫法(ELISA)检测全体对象外周血清中病原体特异性抗体IgM.检测由专人负责,严格按说明书操作.试剂由上海玉兰生物技术研究所提供.结果 阳性总人数319例,总感染率:3.28%,TOX-LgM、RV-LgM、GMV-LsM、HSV(Ⅱ)-LgM感染率分别为0.103%、2.64%、0.309%、0.237%;319例TORCH感染者均按治疗方案接受系统治疗,总转阴率达97.49%.结论 进行TORCH感染检测,做到早期诊断、早期治疗、早期预防很有必要.
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孕产妇四种病原体感染血清学筛查的研究
目的探讨正常孕妇弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒(Torch)感染血清学筛查的意义,妊娠伴胚胎停止发育及产史不良与Torch感染的关系.方法间接荧光法检测血清Torch-IgG抗体和酶免疫捕获法检测Torch-IgM抗体.303例孕妇、27例妊娠伴胚胎停育及192例产史不良妇女进行了弓形虫血清学筛查,进行风疹病毒血清学筛查的分别278,30和214例,巨细胞病毒(CMV)筛查的分别为280,31和228例,单纯疱疹病毒(HSV)筛查的分别为236,25和168例.结果孕妇、妊娠伴胚胎停育和产史不良妇女血清弓形虫IgG/IgM抗体阳性率分别为2.3%/0.33%, 0/0, 1.04%/0;风疹病毒IgG/IgM抗体阳性率分别为93.2%/1.4%, 96.7%/0, 98.6%/0;CMV-IgG/IgM 阳性率分别为88.6%/1.1%, 87.1%/0, 91.2%/0;HSV-IgG/IgM 阳性率分别为93.2%/1.3%, 88.0%/0, 94.6%/0.外院Torch-IgM抗体阳性的31份孕妇血清标本仅确认1份为真正阳性.结论孕妇弓形虫感染率低,常规筛查的价值需要探讨.妊娠前确定风疹的免疫状态对孕妇风疹筛查意义重大.孕妇CMV血清学筛查方案需要进一步研究.初筛Torch-IgM抗体阳性的血清标本应当复查和确认,以避免假阳性.未发现妊娠伴胚胎停止发育以及产史不良与Torch感染存在关联.
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2008至2015年育龄妇女及新生儿 TORCH血清学筛查及临床意义分析
目的：回顾性研究不同人群血清弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和2型特异性IgG和IgM抗体并分析临床意义。方法回顾性研究。收集2008至2015年北京地区妊娠妇女2661例、不育症患者324例、孕史不良患者2492例、近期异常妊娠者623例、胎儿宫内生长异常及新生儿疾病患儿261例、孕前检查人群170名、女性健康体检人群702名。采用商业酶免试剂盒检测弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1和2型IgG和IgM抗体，任何IgM抗体阳性标本使用第2种商业酶免试剂盒进行复检。 PEMS3．1软件用于统计学分析。结果血清弓形虫IgG阳性率0．7％～1．6％，IgM抗体0～1．2％；风疹病毒IgG抗体阳性率85．3％～92．0％，IgM抗体阳性率0．4％～2．7％；巨细胞病毒IgG抗体阳性率89．1％～94．9％，IgM抗体阳性率0．7％～1．7％；单纯疱疹病毒1型IgG抗体阳性率74．8％～86．0％，IgM抗体阳性率0～0．7％；单纯疱疹病毒2型IgG抗体阳性率8．1％～17．4％，IgM抗体阳性率0～4．1％。既往可疑暴露人群（不育症和孕史不良患者）以及近期可疑暴露人群（近期异常妊娠、胎儿宫内生长异常及新生儿疾病患者），其血清TORCH－IgG和IgM抗体阳性率均未见高于妊娠妇女、孕前检查和女性健康体检人群。结论未发现TORCH感染与上述可疑暴露人群存在关联。（中华检验医学杂志，2016，39：281－285）
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临床实验室建立TORCH检验程序的重要性
TORCH检验包括弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒和其他相关病毒等的血清学和核酸检验,是妊娠期感染、器官移植和重症患者检测的重要指标,建立一个合理的检验程序和对结果作出恰当的解释,对于正确应用TORCH检验项目有莺要意义.
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如何重新评价与解释围产期TORCH感染筛查
妊娠期TORCH感染代表以病毒及其他微生物引起的一组围产期感染性疾病.在我国20多年前进行血清筛查后,较为明确地认为,TORCH感染对胎、婴儿危害较大,同时已具有较成熟的诊断与治疗手段.因此,必须对乙型病毒性肝炎、梅毒、HIV感染等做早孕期,甚至孕前筛查.对风疹的筛查好在孕前进行,如风疹IgM+则不必处理;如阴性,好在获得免疫力后再妊娠.然而,现不主张对巨细胞病毒感染、弓形虫病、单纯疱疹等病做孕期筛查.因这3种病原体感染所导致胎儿异常,可行孕期超声检查,并进一步行羊水或脐血穿刺查病原体以确诊.
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河南省3084例育龄男女弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒感染状况调查分析
目的 了解目前河南省育龄人群感染弓形虫(Tox)、风疹病毒(RV)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)Ⅰ/Ⅱ型的现状.方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对2011年7-9月来郑州大学第一附属医院进行孕前咨询的3084例育龄男女进行上述病原(TORCH)感染的特异性IgM及IgG抗体检测.依据研究人群的性别及年龄进行分组,并对组间的TORCH特异性抗体阳性率采用x2检验进行统计学分析.结果 育龄人群TORCH IgM抗体总阳性率为5.5％ (170/3084),其中RV IgM抗体阳性率高(2.9％),其次为HSV(1.0％)；在IgG抗体方面,HSV IgG抗体阳性率高(90.4％),其次为CMV IgG(89.7％)、RV IgG(48.1％)和Tox IgG(0.7％).从年龄来看,＞ 30 ～ 40岁组各病原体的IgM抗体阳性率普遍较低；而IgG抗体方面,Tox、CMV及HSV IgG抗体阳性率随着年龄的增长呈现上升趋势,但RV IgG抗体阳性率却随着年龄的增长呈下降趋势.育龄女性人群的CMV和HSV IgG抗体阳性率显著高于男性(x2=83.470和7.026,P＜0.01).结论 河南省育龄人群中存在一定比例的TORCH现症感染及较低的RV IgG阳性率,建议育龄人群孕前进行TORCH筛查.
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生殖道常见病原体感染与稽留流产
流产是指妊娠周数小于28周、胎儿体质量不足1000 g而中止妊娠者,分为自然流产和人工流产.自然流产的发生率高达妊娠总数的10％～15％[1],而稽留流产是自然流产的一种特殊情况,指宫内胚胎或胎儿死亡后未及时排出者,多数为妊娠小于12周的早期流产[2],患者可出现阴道流血或下腹胀痛等流产症状或无任何症状,血绒毛膜促性腺激素(HCG)升高或尿HCG阳性,B超表现为孕囊形态不规则,未见原始心管搏动或枯萎孕囊.若死亡的胚胎组织在宫腔内滞留过久,容易机化黏连导致清宫困难,亦可发生严重的凝血功能障碍,导致弥漫性血管内凝血,致流产大出血等可能.
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产前母血中检出弓形体、巨细胞病毒及Ⅱ型单纯疱疹病毒者围产儿结局的初步探讨
目的 从围产儿结局探讨产前弓形体、巨细胞病毒及单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA多聚酶链反应(PCR)检测的必要性.方法 采用PCR技术对母血、胎盘组织及(或)脐血进行弓形体、巨细胞病毒及单纯疱疹病毒Ⅱ型病原体检测.结果 1 141例孕妇产前弓形体、巨细胞病毒及单纯疱疹病毒Ⅱ型检测中,97例检出病原体,检出率8.50%,弓形体、巨细胞病毒及单纯疱疹病毒Ⅱ型的检出率分别为4.82%,2.72%及2.28%.围产儿结局不同的两组,其胎盘组织及(或)脐血中病原体的检出率分别为17.65%及60.00%(P＜0.05).结论 孕妇产前弓形体、巨细胞病毒及单纯疱疹病毒Ⅱ型检测很有必要,母血阳性者应将胎盘及其附属物送检;对母血阳性的围产儿,应密切随访.
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实验小鼠弓形虫检测方法的建立和应用
目的建立小鼠弓形虫抗体检测方法.方法制备抗原片和可溶性抗原,免疫小鼠制备阳性对照血清,确定了IFA和ELISA检测方法的适工作条件.根据弓形虫B1基因序列,合成一对寡聚脱氧核糖核苷酸片断,建立PCR检测体系.结果与IHA法相比较,ELISA、IFA的抗体检出率均显著高于IHA,抗体滴度分析,ELISA抗体滴度高于IFA法.对弓形虫感染鼠不同组织进行PCR检测,可检出特异性扩增条带.结论建立的IFA和ELISA检测方法具有灵敏度高、重复性好,结果判定明确等优点,是比较有效的监测方法.建立了弓形虫PCR检测体系,经对弓形虫DNA及病鼠各组织的初步检测,证明本PCR体系具有较高的敏感性和特异性.
关键词： 小鼠 弓形虫属 荧光抗体技术 间接酶联免疫吸附测定 聚合酶链反应 -
先天性心脏病与弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒及单纯疱疹病毒感染的关系
目的 探讨先天性心脏病(先心病)与弓形虫(TOX)、风疹病毒(RV)、巨细胞病毒(CMV)及单纯疱疹病毒(HSV)感染的关系.方法 选取80例先心病患者(先心病组)和32例非先心病者(对照组).采用聚合酶链反应(PCR)荧光定量方法 检测两组受检者心肌组织、血清和白细胞中的TOX、RV、CMV及HSV 4种基因并进行比较.结果 先心病组心肌组织中TOX、RV、CMV、HSV的基因检出率分别为16.2%、18.8%、28.8%和7.5%,对照组分别为0、0、18.8%和6.2%,两组TOX、RV基因检出率间差异有统计学意义(P＜0.05),CMV、HSV基因检出率间差异无统计学意义(P＞0.05).先心病组与对照组心肌组织中CMV、HSV阳性者的CMV[(5.50±1.30)copies/ml和(5.30±0.33)copies/ml]、HSV[(4.51±0.87)copies/ml和(4.32±0.17)copies/ml]基因定量比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);先心病组与对照组白细胞中CMV阳性者的CMV[(5.23±1.20)copies/ml和(5.02±0.79)copies/ml]基因定量比较,差异亦无统计学意义(P＞0.05).结论 先心病的发生与TOX、RV、CMV、HSV感染有关,但与病原体感染的数量无关.
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弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱导的脾淋巴细胞持续性免疫应答
目的 观察弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠后诱导的脾淋巴细胞的免疫应答及持续时间.方法 96只BALB/c小鼠随机分为免疫组和对照组,免疫组以弓形虫复合黏膜疫苗20 μl/只(20μg可溶性速殖子抗原+1μg霍乱毒素)滴鼻免疫2次(间隔2周),对照组以PBS滴鼻.分别于末次滴鼻后第1,2,3,4,6,8,10,12周处死小鼠,脾淋巴细胞计数,免疫细胞化学法检测CD4+、CD8+T细胞亚群水平.结果 免疫组小鼠于第1,2周脾淋巴细胞明显高于对照组(P＜0.01),其中以CD4+T细胞增生为主,第1,2,3,4,6周增生显著(P＜0.01),CD8+T细胞水平在第2,3周也有增生(P＜0.05),CD4+/CD8+比值第6周高于对照组(P＜0.01).结论 弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠可有效诱导脾淋巴细胞增殖性免疫应答,且可持续较长时间.
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经口感染弓形虫对小鼠免疫器官的影响
目的研究经口感染弓形虫对小鼠免疫器官的影响.方法两组小鼠分别灌胃接种含5×104个速殖子的液体0.5ml或相同剂量的PBS,观察小鼠的体况、胸腺、脾、Peyer's patches(PP结)的变化.结果经口接种弓形虫速殖子可致小鼠感染,在第8,10天表现为严重.胸腺重量略有减轻;PP结肿大,但数目变化不显著;脾脏增重,尤其在第8,10天与对照组相比差异显著(P＜0.01).结论5×104个弓形虫速殖子灌胃接种可使小鼠出现一过性临床症状,并可以诱导机体黏膜和系统免疫应答,使免疫器官发生病理改变.
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弓形虫在宿主体内的分布及所致病理变化的研究进展
弓形虫为细胞内寄生原虫,可感染人类以及多种动物,引起人畜共患的寄生虫病.正常人感染弓形虫可因为体内产生免疫保护而呈隐性感染.孕妇感染弓形虫可引起胎儿畸形(无脑儿、脊柱裂)以及新生儿的先天性弓形虫病[1],严重影响优生优育.免疫缺损者感染弓形虫后可导致播散性弓形虫病,如脑炎、肺炎及心肌炎[2-4].研究弓形虫在宿主体内的分布及所致病理变化,对探讨弓形虫的损伤机制极为重要,本文对此进行综述.
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弓形虫感染对大鼠脑组织神经丝mRNA表达和细胞免疫水平的影响
目的 探讨弓形虫感染对大鼠大脑组织神经丝(NF)mRNA表达和细胞免疫水平的影响.方法 将4周龄雄性SD大鼠分成两组(每组10只):弓形虫感染组腹腔感染2×10~(10)个/L弓形虫速殖子悬液2 ml;对照组腹腔注射灭菌生理盐水2 ml.9周后,应用RT-PCR法检测大鼠大脑组织中高相对分子质量NF(NF-H)、中相对分子质量NF(NF-M)和低相对分子质量NF(NF-L)mRNA表达水平:流式细胞术检测大鼠外周血CD3~+、CD4~+、CD8~+T淋巴细胞;酶联免疫吸附试验测定其血清γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素4(IL-4)水平.结果 大鼠弓形虫感染9周后,大脑组织NF-L、NF-H mRNA表达量(0.51±0.06、0.68±0.05)较对照组(0.79±0.03、0.76±0.05)明显下降(t值分别为3.41、2.17,P<0.01或<0.05);NF-M mRNA表达量(0.69±0.02)与对照组(0.72±0.03)比较.差异无统计学意义(t=2.09,P>0.05).弓形虫感染组大鼠的CD4~+T细胞[(32.19±5.01)%]和CD8~+T细胞[(20.06±2.28)%]与对照组[(35.82±3.71)%、(22.06±3.90)%]比较,差异均无统计学意义(t值分别为1.69、1.88,P均>0.05).弓形虫感染组大鼠血清IFN-γ[(6.03±0.16)ng/L]、TNF-α[(18.05±1.93)ng/L]、IL-4[(15.76±1.59)ng/L]水平均高于对照组((4.77±0.13)、(9.54±1.57)、(5.67±0.42)ng/L,t值分别为2.81、2.74、2.63,P均<0.05].结论 弓形虫感染可导致大鼠大脑组织中NF亚单位mRNA表达水平下降,血清IFN-γ、TNF-α、IL-4水平升高.
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弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析
目的构建原核重组表达质粒pET23a-SAG2,并在大肠埃希菌中实现高效表达,以及检测表达产物的抗原性.方法 PCR扩增SAG2编码基因目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠埃希菌DH5α.测序后亚克隆至表达质粒载体pET23a,构建重组表达质粒pET23a-SAG2,转化大肠埃希菌DH5α.筛选阳性克隆,经限制性酶切分析鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹分析表达产物.结果 PCR扩增出约500 bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建的pET23a-SAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pET23a-SAG2重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物约Mr 19000;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性.结论成功构建了pET23a-SAG2表达质粒,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达;表达产物具有良好的抗原性.
