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人类脱嘌呤核酸内切酶的研究进展
各种致癌物和细胞毒性化合物均可引起DNA损伤.一些DNA损伤由太阳紫外线、烟草、不完全确定的饮食因素及环境毒物所引起,大部分DNA损伤则是由超氧化物自由基(ROS)和具有烷化作用的代谢物等引起.DNA修复系统在修复DNA损伤、维持DNA完整中起着不容忽视的作用,而碱基切除修复(BER)则是DNA修复系统中主要的一种修复途径.在BER的第2步反应中,有一种脱嘌呤(AP)核酸内切酶参与,在人类细胞为人类脱嘌呤核酸内切酶1(HAP1,又称Apex、Ape1、Ref1),它是一种多功能蛋白质,可参与许多与细胞重要功能有关的反应.作为DNA修复酶,它作用于AP位点,是BER的重要酶类;作为氧化还原因子,它在转录因子活性降低时维持转录的进行,是维持细胞氧化还原状态的重要物质.
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核酸内切酶改良型彗星实验用于检测遗传毒物致DNA氧化损伤
目的 建立核酸内切酶改良型体外彗星实验方法,并应用该方法检测DNA氧化损伤.方法 分别应用苯并[a]芘[B(a)P,20 μmol/L]、甲基磺酸甲酯[MMS,25 μg/ml]、秋水仙素(COL,5 mg/L)和长春新碱(VCR,0.5 mg/L)处理人支气管上皮(16HBE)细胞.采用噻唑蓝(MTT)实验评估细胞生存率,常规彗星实验和内切酶改良型彗星实验分别检测DNA损伤和氧化损伤,流式细胞术检测细胞内活性氧改变.结果 MTT实验显示,B(a) P、MMS、COL、VCR染毒后可引起较高水平的细胞内活性氧升高,4个组的细胞生存率分别为:(59.69±2.60)%、(54.33±2.81)%、(53.11±4.00)%、(51.43±3.92)%.常规彗星实验及甲酰胺嘧啶-DNA-糖基化(formamidopyrimidine-DNA-glycosylase,FPG)酶彗星实验均检测到B(a)P、MMS、COL、VCR引发的DNA损伤.FPG酶彗星实验中,Olive尾矩改变明显,缓冲液组的B(a) P、MMS、COL、VCR组Olive尾矩分别为22.99±17.33、31.65±18.86、19.86 ±9.56和17.02 ±9.39,FPG酶处理后Olive尾矩分别为34.50±17.29、43.80±10.06、33.10±12.38和28.60±10.53,较缓冲液组分别增加58.94%、38.48%、66.86%和68.21%(t值分别为3.91、3.89、6.66和3.87,P值均<0.05).相关性分析显示,Olive尾矩与细胞内活性氧也有较好的相关性(r=0.77,P<0.05).结论 FPG酶改良型彗星实验可以有效的检测遗传毒物所致的DNA氧化损伤改变.
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细胞凋亡检测方法的研究进展
研究细胞凋亡的方法不断涌现,分析手段日趋完善和成熟。按方法学可将细胞凋亡的检测方法分为形态学、生物化学、免疫化学和分子生物学测定法。现就这方面的进展作一简述。 一、DNA降解分析 细胞凋亡过程中有一系列特征性的形态学、生物化学、细胞学及分子生物学改变。其中重要和特征性的改变是Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶的激活导致染色质DNA在核小体连接部位断裂,形成以180~200 bp为小单位的单体或寡聚体片段。因而细胞凋亡过程中DNA降解所产生的DNA片段大小具有独特的性质,常作为细胞凋亡特异性生化指标而被广泛应用。检测细胞凋亡DNA降解除可通过流式细胞术,还有其他检测手段(表1)。
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地方株HPV16L1基因免疫小鼠诱发的抗体反应
为了检测pcDNA-L1的表达,评价地方株HPV16L1基因诱导的体液免疫反应.我们采用PCR技术从宫颈癌组织中获得HPV16L1基因,以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析,再将L1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建重组pcDNA-L1,转染Cos-7细胞,通过IFA试验验证L1蛋白的表达.
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离子特异性DNA酶在人体重金属含量检测中的应用
20世纪90年代以来,研究人员逐渐发现了多种具有特定生物催化功能的DNA分子,即DNA酶.离子特异性DNA酶是上述DNA中特殊的一类.该酶是具有离子结合特异性的DNA分子片段[1-5],这些片段和某种特定离子结合后可以被活化成为一种核酸内切酶,能够将与之序列互补的核酸链切断[6-9],因此被称为离子特异性DNA酶.目前在分子诊断中一般通过多种方法筛选得到目的离子特异性DNA酶,随后构建相应的离子特异性DNA酶生物传感器(探针)用于离子浓度的检测.
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蜂毒素调节人胃癌细胞线粒体相关蛋白表达
目的:观察蜂毒素(melittin)诱导人胃腺癌细胞凋亡及其对线粒体相关蛋白表达的影响.方法:4 μg/mL melittin诱导SGC-7901细胞不同时间(0、1、2、4 h),观察细胞的形态学改变;免疫荧光法观察活性氧(reactive oxygen species,ROS)、线粒体膜电位(Jc-1)表达;IHC 观察胃癌细胞线粒体释放蛋白细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)、Smac/Diablo、细胞色素C(cytochrome C)、EndoG的表达情况.结果:melittin能明显诱导SGC-7901细胞凋亡;ROS实验显示,melittin组与对照组比较,细胞胞浆出现很强的绿色荧光;MPT实验显示,melittin组显示绿色荧光的细胞数占多数(P<0.05),而阴性对照组,均表现为红色荧光细胞,线粒体相关蛋白检测结果显示,melittin组AIF、cytochrome C、EndoG、Smac/Diablo表达率分别为15.99%±1.66%、42.73%±3.48%、62.34%±2.71%、28.58%±2.09%(P<0.05).结论:melittin可诱导SGC-7901细胞凋亡,线粒体凋亡相关蛋白可能参与并发挥了重要作用.
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大鼠局灶性脑缺血再灌注早期非嘌呤非嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1表达的研究
目的探讨大鼠大脑中动脉阻塞再灌注(MCAO/R)后,DNA修复酶非嘌呤非嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子~1(APE/Ref-1)的表达变化及其意义.方法采用免疫组织化学方法检测APE/Ref-1在缺血再灌注早期损伤脑组织中的变化.结果自再灌注2 h起,损伤侧APE/Ref-1表达阳性细胞数较相应的假手术对照组和正常组显著下降(P<0.01),至48h各手术组间APE/Ref-1表达并无明显差异(P>0.05),72 h时损伤区域APE/Ref-1表达较其他手术组减少(P<0.01);2~48h,损伤侧及损伤对侧相应区域部分APE/Ref-1的表达出现于胞质,72h时损伤对侧恢复为胞核表达,且无细胞减少.结论局灶性大鼠脑缺血再灌注早期,DNA修复酶APE/Ref-1在损伤区域的表达水平降低,并出现该蛋白的胞质滞留现象,说明再灌注早期DNA修复功能下降可能促进缺血再灌注区域细胞的损伤.
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降钙素受体基因多态性与绝经后妇女骨质疏松的相关性探讨
几个多态性的基因通过相互作用调节骨钙的流动,降钙素受体(CTR)基因是其中之一[1].CTR基因有7个潜在的区域在7种组织中表达[2].1997年日本的Nakamura等[3]发现,CTR基因在第1 377个核甘酸表达脯氨酸(CC型)或亮氨酸(TT型),经过限制性核酸内切酶(Alu-Ⅰ)酶切呈限制片段长度多态性,杂合型为TC.本实验采用聚合酶链反应(PCR)限制片段长度多态性(RFLP)技术,检测65例绝经后骨质疏松的老年妇女和238例绝经后非骨质疏松的老年妇女CTR基因型,旨在探讨CTR基因多态性与骨质疏松的相关性.
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分子病理学技术应用原理和适用范围
1 Southern杂交:Southern杂交是1975年由Southem提出,并以其名字命名的一种DNA特定序列定位技术。由于此方法具有特异性强、灵敏度高、应用广泛等优点,已成为DNA分析特别是基因组DNA分析中的常用手段之一[1]。Southern杂交的基本方法是,从组织或培养细胞中获得全部的基因组DNA。以一种或多种限制性核酸内切酶进行消化,通过琼脂糖凝胶电泳按分子量大小分离酶切所得到的片段,然后使这些DNA片段在原位发生变性,并以凝胶转移到另一种固相支持物如硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,同时保持各个DNA片段的相对位置不变。再用已标记的(通常为放射性同位素标记,也可用非放射性标记)DNA或RNA探针与固着于固相支持物上的DNA杂交。经放射自显影或化学显色的方法确定与探针互补的电泳条带的位置,从而达到检测和分析的目的。
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着色性干皮病伴发全颜面多部位皮肤恶性肿瘤一例
着色性干皮病(xeroderma pigmentosum,XP)属常染色体隐性遗传性疾病.人群中患病率较低,约百万分之一.由于其上皮细胞内部分缺乏核酸内切酶,不能修复被紫外线损伤的DNA,因此,本病极易伴发面部皮肤的恶性肿瘤[1].2005年7月,我们收治1例因XP伴发面部皮肤恶性肿瘤的女性患者,病程已20年之久,病变不仅发生于额、颊、外鼻等面部多处暴露的部位,而且鼻腔、上颌窦等多处较隐蔽的黏膜组织也受累及,实属罕见.
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Zn2+、放线菌酮、放线菌素D对喜树碱诱导鼻咽癌细胞凋亡的影响
细胞凋亡的机理和过程是相当复杂的,目前比较公认的看法是, 不论什么因素诱导何种细胞凋亡,终都要通过不同途径激活细胞内的内源性核酸内切酶, 从而引起染色体DNA的断裂,形成DNA片段,凝胶电泳时出现典型的梯形带(ladders).我们的实验证实,拓扑异构酶Ⅰ抑制剂CPT能诱导鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡.本研究拟在CPT体外诱导CNE-2Z细胞凋亡时观察Zn2+、放线菌酮(CHX)及放线菌素D对其凋亡的影响,为更加深入地揭示CPT诱导CNE-2Z细胞凋亡机制提供实验依据.
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DHPLC与SURVEYOR酶法在结核和牛分枝杆菌鉴别中的尝试
目的 牛分枝杆菌与结核分枝杆菌由于99%以上的基因序列相同,从分子生物学角度很难鉴别.本工作从牛分枝杆菌存在pncA基因C169G突变和oxyR基因G285A的不同出发,利用DHPLC和SURVEYOR酶法进行测定,以探讨这两种以异源双链分析为基础的基因突变检测的新方法在这两种分枝杆菌鉴别中的应用.方法 DHPLC法和SURVEYOR酶法分析结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的pncA及oxyR基因.结果 牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的DHPLC图谱和SURVEYOR酶法的电泳图谱显著不同,很容易将两者区分开来. 结论 DHPLC法和SURVEYOR酶法稳定,灵敏,简便,快速,在结核与牛分枝杆菌的鉴别中有一定的作用.
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APE1/Ref-1基因结构及功能的研究进展
APE1/Ref-1(又称APEX1或Ref-1,本文统称APE1),是大肠杆菌Xth(ExoⅢ)哺乳类同源物、细胞对氧化应激主要反应因子,DNA在各种内源性或外源性物质包括化疗药物引起损伤后,APE1通过DNA碱基切除修复通路中脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶发挥重要的作用.当受损的碱基去除后,APE1主要切断脱碱基位点以利于修复功能[1].
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生物工程技术的建立
瑞士的阿尔伯(Arber,W.1929~ )于20世纪60年代初在日内瓦开始研究"细菌被吞噬体感染后,产生的控制和修饰作用",1962年发表了他这方面早的研究论文.1965年,正式提出可能有两种酶使细菌对外来DNA有限制和修饰功能,其中一种被称为限制性核酸内切酶(简称内切酶),另一种被称为修饰酶.这种酶具有切割基因的功能.
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133 高LET照射后用核酸内切酶-Ⅲ孵育所致DNA链断裂及羟自由基聚集
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Fas介导的细胞凋亡与乙型丙型肝炎
细胞凋亡(apoptosis),又称细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD),是不同于细胞坏死的另一种细胞死亡形式。二者不仅在形态上具有显著差别,而且内在的发生机制完全不同,受多种基因的分子调控是它有别于细胞坏死的显著特征。在凋亡过程中,由于内源性核酸内切酶的激活,使DNA在核小体连接区断裂,形成以180~200bp整倍数的DNA片段,电泳时出现特征性梯形区带图谱;电镜下观察凋亡的细胞呈现胞体变小,皱缩,染色质浓集,核固缩,进而核碎裂形成被膜包围的凋亡小体(apoptotic bodies),后被周围吞噬细胞吞噬降解。细胞凋亡不仅参与胚胎发育、造血、免疫系统的成熟、机体衰老以及维持正常组织器官细胞数目的恒定与生长平衡,而且与肿瘤、自身免疫性疾病等多种疾病的发生有关。免疫介导的细胞凋亡,特别是Fas系统介导细胞凋亡在慢性乙型肝炎(CHB)、慢性丙型肝炎(CHC)肝细胞损伤过程中起重要作用。本文就Fas系统及其与CHB、CHC细胞损伤关系的研究进展作一综述。
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TGF-β调控的miRNA在肾间质纤维化中研究?
微核糖核酸( microRNA)是短的非编码的内源性RNA,结合到其靶mRNAs,并组装到相应的 RNA 诱导的沉默复合物( RISC)中。 miRNA的生物合成包括多个步骤。首先, miRNA在细胞核通过RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ转录为具有发夹径环结构的初级miRNA( PRI-MIR)。初级miRNA( PRI-MIR)被RNaseⅢ型核酸内切酶Drosha及其辅酶DGCR8剪切成双链短miRNA前体( Pre-miR)[1]。三磷酸鸟苷( GTP)和输出蛋白5能够将Pre-miR从细胞核转运到细胞质中[2]。细胞质中Pre-miR被另一种RNaseⅢ型核酸内切酶Dicer及其辅助因子剪切加工成为20~22个核苷酸左右的有活性的、成熟的miRNA[3]。并组装到RNA诱导的沉默复合体( RISC)上,并由RISC介导其与靶mRNAs结合,通过抑制靶mRNAs的翻译或降解靶mRNAs起作用。因此,miRNA能够通过mRNA的降解,翻译抑制或转录后抑制来调控基因的表达。
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生长因子在细胞凋亡中的作用
细胞凋亡(apoptosis)是各种生理的或非生理性的因素激活细胞自身固有的程序所导致的非坏死性改变,这种死亡的特征是核染色质密度增高并凝聚在核膜周边,形成"核着边"(margination)现象,凋亡小体的形成.其生物化学反应主要是胞质内Ca2+浓度增加,蛋白质发生降解,核酸内切酶被激活,染色质DNA被核酸内切酶在核小体单位之间降解,产生若干寡核苷酸片段,在琼脂糖凝胶电泳上呈现阶梯状DNA区带图谱(DNA ladder).细胞凋亡失衡和许多疾病的发生发展有关,其机制已成为研究的热点.
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1型糖尿病胰岛β细胞凋亡的影响因素
细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD),是指局部环境生理或病理性变化引起的、由自身内部机制调节的一种主动的、按一定程序进行的细胞自发性死亡方式.其形态学特点包括染色体浓集、胞膜皱缩和凋亡小体的形成.其生化特征是核酸内切酶活化,使染色质在核小体间断裂,从而在DNA电泳时形成特征性的梯形带.
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核酸内切酶在DNA断裂损伤检测中的应用研究
利用人体淋巴细胞和Hela细胞并经100μMH2O2诱导DNA损伤,然后分为对照组和实验组,后者补充25μl 1μg/ml的核酸内切酶Ⅲ.结果显示对照组淋巴细胞经4h培养后DNA断裂损伤下降到63.85(专用单位);补充核酸内切酶Ⅲ的实验组DNA断裂损伤明显增加达到161.93(P<0.05).对照组Hela细胞培养4h后DNA断裂损伤为19,而实验组断裂损伤明显高于对照组达到172.1(P<0.01).提示实验组DNA断裂损伤的增高可能包括H2O2所致DNA直接断裂和核酸内切酶Ⅲ切除修复过程中所形成的修复性断裂两部分,反映了DNA总体损伤水平.