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AcMNPV肌动蛋白核定位基因的亚细胞定位
当前细胞核内肌动蛋白的功能是一个研究热点,核内存在肌动蛋白并参与细胞核内发生的许多生命活动.杆状病毒是迄今唯一报道的利用核内肌动蛋白进行复制增殖的病原微生物,为核内肌动蛋白的结构与功能的研究提供了独特的系统.有报道显示AcMNPV的ie-1,pe38,ac4,he65,ac102和ac152基因与肌动蛋白单体的核转运有关,然而关于这六个基因的亚细胞定位及其在肌动蛋白入核过程中的功能并没有深入的研究.本文首次揭示了这六个基因的亚细胞定位,IE1和AC152是全细胞分布,PE38和AC102也为核质分布,但主要分布在细胞核中,而AC4和HE65定位于细胞质.但AC102和IE1可以分别介导AC4和HE65入核.同时我们发现当使用外源强启动子OpIE2,在转染ie-1或pe38之后表达ac4和he65可以部分招募肌动蛋白单体入核,而时序性共转染这四个基因则可招募多肌动蛋白单体入核.对肌动蛋白核定位基因在细胞中的定位分析为进一步了解杆状病毒介导肌动蛋白入核的分子机理提供支持.
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EV71通过2A蛋白酶切割Nup62而抑制核转运
为了解EV71病毒对细胞核转运机制的影响,本研究构建了具有核定位信号的绿色荧光蛋白表达载体(pG-FP-NLS).将此表达载体转染细胞后,使用EV71病毒感染转染细胞,结果发现EV71病毒可以有效阻止绿色荧光蛋白的核转移.将EV71病毒的2A蛋白酶真核表达载体与pGFP-NLS共转染RD细胞,可以发现2A蛋白酶可阻止具有核定位信号的绿色荧光蛋白的核转移而使绿色荧光蛋白表达于细胞浆.为了进一步研究病毒阻止核转移的机制,病毒感染细胞或通过转染2A蛋白酶真核表达载体进行Nup62的Western blotting检测,结果显示病毒以及2A蛋白酶均可引起Nup62表达下降.证明EV71可通过2A蛋白酶切割Nup62从而抑制核转运.
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曲妥珠单抗抑制辐射诱导下的乳腺癌细胞系SKBR3细胞的Her-2核转运过程研究
目的 观察曲妥珠单抗对乳腺癌SKBR3细胞中Her-2的入核过程和核内DNA损伤修复的影响,探讨曲妥珠单抗的放疗增敏机制.方法 克隆形成实验检测曲妥珠单抗对辐射后细胞存活分数(SF)的影响,荧光共聚焦观察曲妥珠单抗对DNA双链断裂(DSB)损伤标志物γ H2AX表达和Her-2核转运过程的影响,免疫印迹法检测曲妥珠单抗对辐射诱导细胞的胞核内Her-2蛋白、DNA依赖蛋白激酶( DNA-PK)功能亚单位DNA-PKcs的表达的改变.结果 细胞克隆形成实验中,曲妥珠单抗干预组接受2 Gy时SF( SF2)为0.321±0.022,单纯照射组为0.547±0.046(P=0.000)；辐射后γ H2AX的荧光灰度表达提高,曲妥珠单抗干预组为85.40±25.63,单纯照射组为18.53±44.32( P=0.000)；Her-2蛋白入核灰度表达降低,单纯照射组为52.80±19.74,曲妥珠单抗组为21.41±10.55( P=0.000)；免疫印迹实验表明曲妥珠单抗干预组辐射后早期核内DNA-PKcs及Her-2的表达下降.结论 曲妥珠单抗能够抑制辐射诱导的Her-2入核过程,并减少核内Her-2和DNA-PKcs的表达,从而可能提高辐射后早期的DSB损伤.
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以病毒RNA核转运为靶点的抗HIV-1药物筛选模型的建立及应用
目前.临床使用的抗AIDS一线药物主要是HIV逆转录酶抑制剂和蛋白质酶抑制剂.但是,由于这类药物价格昂贵、严重的副作用、毒性、耐药性等问题U益严重,发展新作用机制的抗HIV-1药物已成当务之急.因此,本课题以HIV-1病毒RNA核转运关键蛋白Rev为靶点,建立了新型抗HIV药物筛选模型,以期寻找具有新作用机制的抗病毒药物.在筛选模型中,选择了由HIV-1病毒偏爱性密码子所编码的GFP(GFP_(HIV))作为报告基因,用于快速简便地分析样品对Rev依赖的RNA核转运的影响.选取抑制剂来普霉索B作为模型的阳性对照对本模型进行了初步评价,计算出Z'因子为0.822 0.上述结果初步证明了该模型可用于新型抗HIV药物的筛选.对3 000个化合物进行初筛,阳性率为9.3%,复筛阳性率为7.3%.通过抗病毒活性的测定实验以及对阳性化合物进行免疫印迹检测,后发现IMB7C7这个化合物以病毒RNA核转运为靶点,是具有较好效果的特异性抑制剂.
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miR-489和肿瘤关系的研究进展
随着医学的发展,尤其是近年来人们在生物体内发现了非编码单链小分子 RNA ,即 microRNA (miRNA),其内源长度为20~23个核苷酸,miRNA被RNA聚合酶Ⅱ催化形成原始转录产物 pri-miRNA ,经历2 次连续的剪切后 pri-miRNA 转化为成熟的miRNAs[1,2]:首先pri-miRNA在细胞核内被 RNA 聚合酶Ⅲ的Drosha-DGCR8 剪切成 70~100nt 的茎环结构(pre-miRNA),然后在转运蛋白 exportin-5 的作用下,pre-miRNA 由细胞核转运至细胞质中,然后被Dicer酶剪切形成20~25nt的成熟miRNAs.
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Trastuzumab对放射诱导下HER-2的入核及DNA损伤的影响
目的:通过观察HER-2单克隆抗体trastuzumab对BT474细胞中HER-2的入核效应和对核内DNA损伤修复的影响,来探讨HER-2直接入核通路上trastuzumab放疗增敏机制.方法:将BT474细胞随机分成单纯照射组和trastuzumab干预组,通过克隆形成实验来观察各剂量下放射后两组BT474细胞的存活分数的差异,共聚焦显微镜下观测trastuzumab对放射后HER-2核转运和DNA DSB标志物γH2AX表达的影响,免疫印迹实验检测trastuzumab对放射后早期BT474细胞核内HER-2蛋白、DNA-PKcs的表达影响.结果:与单纯照射组相比,trastuzumab干预组可降低放射后各剂量下BT474细胞的存活分数(SF),共聚焦显微镜可观察到trastuzumab推迟了照射后HER-2蛋白由细胞膜进入核内的过程,并增加放射后12 h时间点的γH2AX表达,Western blot实验结果显示trastuzumab干预下调了放射后早期核内DNA-PKcs和HER-2的表达.结论:trastuzumab能够通过减少HER-2的入核,并进一步下调DNA-PKcs活性,抑制放射诱导下BT474的早期DSB修复.
关键词： HER-2 Trastuzumab 辐射 核转运 -
TGF-β调控的miRNA在肾间质纤维化中研究?
微核糖核酸( microRNA)是短的非编码的内源性RNA,结合到其靶mRNAs,并组装到相应的 RNA 诱导的沉默复合物( RISC)中。 miRNA的生物合成包括多个步骤。首先, miRNA在细胞核通过RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ转录为具有发夹径环结构的初级miRNA( PRI-MIR)。初级miRNA( PRI-MIR)被RNaseⅢ型核酸内切酶Drosha及其辅酶DGCR8剪切成双链短miRNA前体( Pre-miR)[1]。三磷酸鸟苷( GTP)和输出蛋白5能够将Pre-miR从细胞核转运到细胞质中[2]。细胞质中Pre-miR被另一种RNaseⅢ型核酸内切酶Dicer及其辅助因子剪切加工成为20~22个核苷酸左右的有活性的、成熟的miRNA[3]。并组装到RNA诱导的沉默复合体( RISC)上,并由RISC介导其与靶mRNAs结合,通过抑制靶mRNAs的翻译或降解靶mRNAs起作用。因此,miRNA能够通过mRNA的降解,翻译抑制或转录后抑制来调控基因的表达。
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HIV Vpr蛋白与细胞凋亡的关系及其作用
vpr基因是HIV的辅助基因之一,编码一个96氨基酸的Vpr辅助蛋白.在病毒侵犯宿主细胞的过程中,Vpr蛋白发挥着重要的作用.它参与病毒整合前复合体的核转运,激活病毒的转录过程,诱导感染细胞周期的G2/M期停滞,促进感染细胞凋亡.这些生物活性提示Vpr能与感染细胞内的生化路径相互作用,调节HIV-1的复制和发病.Vpr有多种作用,其中促细胞凋亡活性受vpr基因变异位点的影响,如单个的L64P的变异就能显著增强其活性.Vpr部分或完全缺陷与感染者病程进展缓慢有关.Vpr主要通过线粒体及caspase途径诱导细胞凋亡,但目前Vpr在疾病的发病及进展过程的作用尚未完全弄清.本文主要讨论vpr基因在病毒感染过程中的作用,尤其是诱导细胞凋亡的作用以及对将来通过抑制vpr来抗病毒治疗的展望.
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原花青素二聚体B2对大鼠滑膜细胞NF-κB核转运及炎症因子表达的影响
目的 通过观察原花青素二聚体B2(procyanidins dimer B2,PCB2)对大鼠滑膜细胞NF-κB核转运及相关炎症因子表达的影响,探讨其抗炎的分子机制.方法 免疫荧光法观察NF-κB/p65在细胞中的定位,RT-PCR检测PCB2对诱导细胞的COX-2 mRNA表达,Western blot分析COX-2蛋白含量变化,ELISA测定各处理组细胞上清液中IL-1β、VEGF的含量变化.结果 TNF-α(10 μg·L-1)诱导RSC-364细胞NF-κB从细胞质转运至细胞核,50 μmol·L-1 PCB2明显抑制NF-κB/P65核转运;PCB2剂量依赖性抑制COX-2基因和蛋白的表达;PCB2下调了TNF-α诱导的IL-1β、VEGF的水平.结论 PCB2能有效抑制COX-2、IL-1β及VEGF的表达,其机制可能与抑制TNF-α诱导的NF-κB核转运,抑制NF-κB活化有关.
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呼吸道合胞病毒M蛋白核转运
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是有包膜单股负链RNA病毒,是世界范围内婴幼儿主要呼吸道病原体,也是重度免疫抑制者或老年人发病致死的主要原因.RSV M蛋白是RSV非糖基化内膜结构蛋白,其核转运及调节在感染细胞的病毒组装方面起重要作用.M蛋白由IMP识别NLS序列介导核转入,通过与细胞核成分结合而存留在细胞核中,由Crm-1识别NES序列介导核转出,可能通过磷酸化调节其核转运.关于M蛋白核转运的研究,国内尚无相关文献,国外已基本研究出M蛋白核转运所需的介导因素.M蛋白核转运的研究对于利用此机理开发抗RSV复制的药物有利,此过程的机理仍需进一步研究.本文对M蛋白的核转运及其调节进行综述.
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由Kap-β家族成员介导的独特的入核及出核路径
发生于核孔复合物的蛋白质的入核及出核转运(nuclear pore complexes,NPCs)是由转运因子(transport factors)与NPC处的核孔蛋白之间的相互作用介导的.含有经典的核定位序列(nuclear localization sequences,NLSs)的蛋白质的入核是由一个异二聚体蛋白复合物介导的,这一复合物包括Kap-α和Kap-β1,并由Kap-β1使NLSs定位于NPC.Ra nGTP,RanGDP结合蛋白--P10,以及RanGTP结合蛋白--RanBP1都参与了使NLSs 经NPCs入核的过程.近,一条由Kap-β家族成员介导的独特的入核及出核路径已被发现 .Kap-β2介导mRNA结合蛋白的入核,而Kap-β3和β4则介导一套核糖体蛋白的入核.另外两个Kap-β家族的成员:CRM1和CAS则分别介导富含亮氨酸的载有核输出信号(muc lear-export signals,NESs)的蛋白质和Kap-α的再出核."CRM1-NES-RanGTP”三聚体复合物在RanGAP的参与下被RanBP1解聚,即使RanBP1自身包括富含亮氨酸的NES.这个大家族中具有潜在性结合"货物”能力的很多新转运因子仍需进一步鉴定.Kap-β家族成员的共同特点是与RanGTP结合的能力及在NPCs处直接与核孔蛋白结合的能力.RanGTP对于出核复合物移动至NPC的胞浆面十分重要,在这一转运过程的终阶段,RanBP1(也可能是RanBP2) 参与了出核复合物从NPC上解离的过程.在离体情况下Kap-β1与RanBP1及RanGTP或RanG DP结合形成的"Kap-β1-RanGTP-RanBP1”三聚体,能抵制由RanBP1引发的解离及由R anGAP1引发的GTP水解.
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核转运抑制肽表达载体的构建及对HeLa细胞增殖、迁移的影响
目的 构建核转运抑制肽与红色荧光蛋白(RFP)的融合表达载体,探讨该融合蛋白在HeLa细胞中的表达、定位以及对细胞增殖、迁移的影响.方法 分别合成编码两种核转运抑制肽Bimax1和Bimax2的多核苷酸,退火后插入红色荧光蛋白表达载体pDs-Red-C1;质粒转化大肠杆菌DH-5α,挑取阳性菌进行DNA测序;利用脂质体转染法将重组载体pDs-Red-Bimax1、pDs-Red-Bimax2及空白载体转入HeLa细胞中,荧光显微镜观察红色荧光的表达与定位;MTT实验和细胞迁移实验检测融合蛋白表达对细胞增殖、迁移的影响.结果 DNA测序显示,两种核转运抑制肽Bimax1和Bimax2成功插入红色荧光蛋白表达载体;转染真核细胞后Bimax1和Bimax2引导红色荧光蛋白在细胞核表达;同时,融合蛋白RFP-Bimax1和RFP-Bimax2对HeLa细胞的增殖、迁移有抑制作用.结论 成功构建核转运特异性抑制肽与红色荧光蛋白融合表达的载体,融合蛋白在细胞核局限表达并能抑制肿瘤细胞的增殖、迁移.
