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艾灸血浆对离体人胃黏膜上皮细胞损伤的保护作用及其线粒体细胞凋亡通路机制
目的:探讨艾灸血浆对胃黏膜细胞调亡的影响,揭示艾灸对胃黏膜细胞的保护作用及其信号转导机制.方法:24名健康人随机等分为艾灸穴位组和艾灸非穴位组,分别艾灸中脘、关元和足三里穴及非穴位对照点各10d.将人体胃黏膜上皮(GES-1)细胞分为空白组、模型组、艾灸穴位血浆组、艾灸非穴位血浆组,采用含8%乙醇的培养液造成GES-1细胞损伤模型,分别加以预先提取的灸前人体血浆、艾灸穴位和非穴位血浆.流式细胞技术检测细胞凋亡率;Western-blot法检测细胞内热休克蛋白70 (HSP 70)、第二个线粒体来源的胱氨酸酶激活物(Smac),凋亡诱导因子(AIF)的表达;细胞免疫化学法检测半胱氛酸天冬酸蛋白酶-3、9(Caspase-3、9)的表达.结果:模型组与空白组比较,细胞凋亡率明显增加,HSP 70、Smac、AIF、Caspase-3、Caspase-9 表达均上调(均P<0.01);艾灸穴位血浆组与模型组比较,凋亡率明显下降(P<0.01),HSP 70表达进一步提高(P<0.01),Smac、AIF、Caspase-3、Caspase-9 表达下调(均P<0.01);艾灸非穴位血装组与模型组比较,凋亡率、Smac表达下降,Caspase-3、Caspase-9表达也下调(均P<0.01),但高于艾灸穴位血浆组(P<0.05,P<0.01).结论:艾灸中脘、关元和足三里穴位后提取的人体血浆能抑制GES-1细胞凋亡,其信号转导通路可能是:促进细胞内HSP 70合成,通过线粒体凋亡通路,抑制Smac、AIF表达,同时阻断其与Caspase-9的结合,减少Caspase-3含量,抑制细胞凋亡.
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参附注射液对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠凋亡诱导因子表达的影响
目的:研究参附注射液对新生大鼠脑缺氧缺血后脑皮层凋亡诱导因子(AIF)棱转位和AIF mRNA的影响,探讨参附注射液抑制凋亡的机制.方法:新生7d SD大鼠随机分为假手术组(S)、生理盐水对照组(C)、参附治疗组(SF).每组按照观测的时间点不同分为3h、6h、12h、24h、3d、7d 6个亚组.用Rice法制备新生大鼠HIBD模型.检测不同时间点胞核中AIF、AIFmRNA动态变化及脑皮层组织的凋亡细胞.结果:(1)AIF:C组AIF在胞核内的转位从HI后3h开始增加,24h达到高峰后开始逐渐下降.SF组24h、3d、7d胞棱中的AIF表达较C组减少,2组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；(2) AIFmRNA:C组从HI后3h开始增加,24h达到高峰后下降,SF组各时间点均较C组减少(P＜0.05).(3)Tund:HI后3h C组和SF组脑皮层凋亡细胞开始增多,24h达到高峰后下降；SF组在HI后24h、3d、7d均明显低于C组(P＜0.05).结论:参附注射液能够通过抑制AIF的棱转位和基因转录来抑制凋亡,从而起到对HIBD新生大鼠的保护作用.
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选择性线粒体分裂抑制剂抑制大鼠急性脊髓损伤后的细胞凋亡
目的 检测mdivi-1预处理对大鼠急性脊髓损伤(ASCI)后线粒体膜电位,凋亡诱导因子(AIF)释放及细胞凋亡的影响.方法 大鼠随机分为:假手术组(Sham组)、单纯脊髓损伤组(SCI组)、二甲基亚砜预处理组(DMSO组),mdivi-1预处理组(mdivi-1组).采用Allen's方法制备ASCI模型.JC-1标记法检测线粒体膜电位(MMP),Western blot方法检测线粒体及细胞核内AIF,TUNEL法检测细胞凋亡.结果 与Sham组相比,SCI组线粒体中AIF先降低后升高,低点是8h(P＜0.01),而细胞核中AIF却呈相反趋势(P＜0.01),术后8 h MMP明显降低(P＜0.01),凋亡细胞数目明显增多(P＜0.01).与SCI 8 h组相比,mdivi-1组MMP明显升高(P＜0.01),线粒体中AIF明显增多(P＜0.01),细胞核中AIF明显降低(P＜0.01),凋亡细胞数目明显减少(P＜0.01).结论 Mdivi-1具有保护大鼠ASCI后MMP,抑制线粒体中AIF的释放和细胞凋亡的作用.
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腺病毒介导的AIF及其突变体对K562细胞凋亡的影响
目的 构建凋亡诱导因子(Ad-AIF)及其突变体的重组腺病毒(Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF),观察其对白血病K562细胞凋亡的影响.方法 扩增AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF片段,分别克隆至pAd-Track-CMV-HA质粒中,经过PCR、双酶切和测序鉴定后,分别与pAd-Easy1质粒重组得到腺病毒质粒,经包装和扩增后得到腺病毒,以无外源序列的腺病毒作为空载腺病毒.Western blot验证重组腺病毒在K562细胞中的表达,免疫共沉淀检测AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF是否与HSP70相结合,Hoechst33258染色和流式细胞术检测AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF对K562细胞凋亡的影响.结果 重组腺病毒构建成功,能够在K562细胞中表达;AIF和DMLS-AIF与HSP70相结合,DHBD-AIF不结合HSP70;Ad-DHBD-AIF引起K562细胞染色质凝集,而Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF处理的K562细胞染色质分布均匀;Ad-DHBD-AIF引起K562细胞凋亡数明显高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF(P＜0.05).结论 成功构建了腺病毒Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF,其中Ad-DHBD-AIF对K562细胞的凋亡影响明显高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF,为K562细胞凋亡受阻的进一步研究奠定了基础.
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Id2从核迁移到细胞质后通过调节凋亡诱导因子表达促进骨骼肌细胞分化
目的 探讨Id2在骨骼肌再生中的作用机制.方法 用绿色荧光蛋白(GFP)-Id2-C2表达载体转染C2C12成肌细胞,对转染组和非转染组进行H2O2处理和2%马血清处理,用RT-PCR法观察两组细胞Id2基因表达的差异;Western blotting观察两组细胞的成肌分化相关蛋白的表达情况;免疫荧光显微镜观察正常组、纤维损伤组以及去神经支配组大鼠的骨骼肌中Id2和凋亡诱导因子(AIF)蛋白的表达情况.结果 与非转染组相比,Id2转染组细胞成肌分化明显增强.免疫荧光染色法显示,50μmol/L H2O2能增加核Id2蛋白的表达.在氧化应激条件下,Id2能抑制成肌调节因子(MyoD)而活化肌浆蛋白(myogenin).2%马血清能引起大多数Id2从细胞核迁移到细胞质,从而抑制活性氧(ROS)诱导的线粒体AIF表达.免疫荧光分析显示,去神经支配组大鼠的骨骼肌中细胞内的Id2和AIF蛋白表达增多.结论 Id2从细胞核迁移到细胞质后能促进骨骼肌细胞分化,其作用与AIF表达水平相关.
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重组人促红素对家兔心肺复苏后早期心脏功能影响的实验研究
目的 通过观察心肺复苏后家兔血流动力学和心肌细胞凋亡的改变,探讨重组人促红素(rhEPO)对复苏后心功能的影响及可能机制.方法 采用体外致颤法建立家兔心肺复苏模型,18只家兔随机分为3组:手术对照组(A组):仅麻醉、手术、气管捕管,但不致颤;肾上腺素组(B组):复苏时使用标准剂量肾上腺素(30μg/kg);肾上腺素+rhEPO组(C组):在B组基础上,自主循环恢复(ROSC)后给予rhEPO(5 000IU/kg).动态记录室颤前,ROSC即刻、15min、30min、60min和120min的左室舒张末压(LVEDP)、左室内压上升和下降大速率(peak+dp/dt),实验后处死家兔,观察各组心肌凋亡及凋亡诱导因子(AIF)表达,同时观察心肌超微结构.结果 ①与A组比较,B、C两组复苏成功后LVEDP明显增高(P<0.05或P<0.01),复苏后60min,两组LVEDP呈下降趋势,C组虽较B组明显,但直到120min时差异有显著性(P=0.003);②与A组比较,B、C两组复苏成功后peak+dp/dt均呈下降趋势(P<0.05或P<0.01),但复苏后60 min,C组出现同升,且持续到120 min时,差异显著(P=0.009);③电镜观察显示B、C两组均见心肌细胞肿胀,线粒体及肌丝等超微结构损伤,尤以B组显著.结论 rhEPO可改善复苏后心功能障碍,对复苏后心脏有保护作用,其机制可能与降低AIF表达,抑制细胞凋亡有关.
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细胞凋亡的线粒体信号通路在大鼠缺血延迟预适应抗心肌细胞凋亡机制中的作用
目的:以细胞凋亡的线粒体途径为切入点,探讨心肌缺血延迟预适应抑制心缺血再灌注(MI/R)后细胞凋亡的可能机制.方法:SD大鼠分为正常对照组、假手术组、缺血再灌注组、延迟缺血预处理组.缺血再灌注组采用经典大鼠冠脉结扎,缺血1h,再灌1h.延迟缺血预处理组采用缺血5min,再灌5min,反复循环3次,24h后缺血1h,再灌1h.流式细胞仪测定心肌细胞凋亡率,进行细胞色素C(CytC)和凋亡诱导因子(AIF)的Western blotting分析及Caspase-3活性测定,并利用免疫组织化学染色法检测大鼠心肌HSP70的表达.结果:与缺血再灌注组相比较,心肌缺血预处理24h后可以减少MI/R后心肌细胞凋亡率,抑制CytC和AIF自线粒体向胞浆的释放及caspase-3的活化,上调HSP70蛋白表达.结论:心肌缺血延迟预适应可以减少MI/R造成的细胞凋亡,机制与其诱导HSP70的生成,抑制细胞凋亡的线粒体信号转导途径有关.
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蜂毒素调节人胃癌细胞线粒体相关蛋白表达
目的:观察蜂毒素(melittin)诱导人胃腺癌细胞凋亡及其对线粒体相关蛋白表达的影响.方法:4 μg/mL melittin诱导SGC-7901细胞不同时间(0、1、2、4 h),观察细胞的形态学改变；免疫荧光法观察活性氧(reactive oxygen species,ROS)、线粒体膜电位(Jc-1)表达；IHC 观察胃癌细胞线粒体释放蛋白细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)、Smac/Diablo、细胞色素C(cytochrome C)、EndoG的表达情况.结果:melittin能明显诱导SGC-7901细胞凋亡;ROS实验显示,melittin组与对照组比较,细胞胞浆出现很强的绿色荧光；MPT实验显示,melittin组显示绿色荧光的细胞数占多数(P＜0.05),而阴性对照组,均表现为红色荧光细胞,线粒体相关蛋白检测结果显示,melittin组AIF、cytochrome C、EndoG、Smac/Diablo表达率分别为15.99％±1.66％、42.73％±3.48％、62.34％±2.71％、28.58％±2.09％(P＜0.05).结论:melittin可诱导SGC-7901细胞凋亡,线粒体凋亡相关蛋白可能参与并发挥了重要作用.
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丹参酮ⅡA抑制波动性高糖诱导的雪旺细胞凋亡的观察
目的 观察丹参酮ⅡA(TanⅡA)对波动性高糖(IHG)所致的雪旺细胞(SC)凋亡的影响.方法 原代培养大鼠SC分为正常糖组(Con,5.6 mmol/L)、稳定性高糖组(HG,50 mmol/L)、IHG组(IHG,5.6～50.0 mmol/L)、渗透压对照组(mannitol)及IHG加不同浓度TanⅡA(0.1、1、10 μmol/L)组.检测线粒体膜电位(MMP)、细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达. 结果 与Con组和HG组比较,IHG组MMP下降[(0.51±0.02) vs (1.42±0.08)vs(0.66±0.02)],细胞凋亡率增高[(5.01±0.26)％w(42.33±2.76)％vs (31.64±3.04)％](P＜0.05或P＜0.01)、线粒体细胞色素c(cyto-c)及凋亡诱导因子(AIF)水平降低,胞浆cyto-c及胞核AIF表达增高(P＜0.01);活化半胱天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)及caspase-3表达增高(P＜0.01).TanⅡA可升高MMP,减少细胞凋亡,抑制cyto-C释放及AIF转位,降低caspase-9及caspase-3的活化. 结论 TanⅡA能抑制SC凋亡,其机制是caspase活性降低,从caspase依赖性及非依赖性途径发挥作用.
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瑞舒伐他汀对脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞凋亡及凋亡诱导因子表达的影响
目的 观察瑞舒伐他汀对大鼠脑缺血再灌注损伤神经细胞凋亡及凋亡诱导因子(AIF)表达的影响,探讨瑞舒伐他汀的神经保护机制.方法 选择健康雄性Wistar大鼠72只,随机分为假手术组、模型组(缺血再灌注损伤)和瑞舒伐他汀组,每组24只,每组又分为脑缺血再灌注后12、24、72h3个时间点,剔除造模过程中死亡的大鼠,每个时间点随机选取6只大鼠.分别取大鼠脑组织,检测神经细胞凋亡数和AIF蛋白阳性细胞数.结果 模型组和瑞舒伐他汀组大鼠再灌注12、24、72 h神经细胞凋亡数和AIF蛋白阳性细胞数表达较假手术组明显增加,而瑞舒伐他汀组神经细胞凋亡数[(47.12±6.15)个vs (67.31±20.12)个,(34.94±8.47)个vs (62.03±8.71)个,(24.02±7.02)个vs (56.63±6.72)个]和AIF蛋白阳性细胞数[(31.01±10.22)个vs (45.12±8.54)个,(22.93±6.97)个vs (37.34±8.38)个,(15.92±6.01)个vs (30.71±4.86)个]较模型组明显降低(P＜0.01).结论 瑞舒伐他汀对脑缺血再灌注损伤有神经保护作用,其作用机制可能与抑制AIF蛋白、对抗细胞凋亡有关.
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复方天麻蜜环菌糖肽片对大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的影响
目的 观察复方天麻蜜环菌糖肽片对大鼠脑缺血再灌注后大脑皮质缺血灶周围区caspase-3蛋白、凋亡诱导因子(AIF)时相表达及对神经细胞凋亡的影响.方法 应用线栓法建立Wistar大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型,氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察梗死灶的分布,应用原位末端标记(TUNEL)和免疫组化技术分别观察模型组、复方天麻蜜环菌糖肽片治疗组和对照组(生理盐水干预组)大脑中动脉栓塞90 min再灌注6 h、24 h、72 h时缺血灶周围脑区caspase-3蛋白、凋亡诱导因子和TUNEL阳性细胞的时相表达.结果 脑缺血再灌注后在缺血灶周围区均出现三者的表达,且表达有几乎一致的规律性.栓塞90 min再灌注24 h、72 h,复方天麻蜜环菌糖肽片治疗组与其他两组比较,caspase-3、凋亡诱导因子阳性细胞和TUNEL染色阳性细胞的数量均明显减少(P＜0.01).结论 AIF、caspase-3参与了局灶性脑缺血后神经细胞的凋亡过程,复方天麻蜜环菌糖肽片可以减少AIF、caspase-3蛋白的表达,减轻迟发性神经元死亡,对缺血性脑组织有保护作用.
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联合应用PARP-1与Caspase-3抑制剂对脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡的影响
目的:探讨联合应用多聚腺嘌呤二核苷酸核糖聚合酶-1 (PARP-1)抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide,3-AB)和Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK对脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡的影响.方法:120只成年健康SD大鼠随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)、PARP-1抑制剂组(C组)和联合用药组(D组),每组30只.以Allen's打击法制备大鼠脊髓损伤模型,每组分别于造模后1d、3d、7d取5只大鼠行BBB评分,处死后利用免疫组化方法检测损伤部位脊髓内PARP-1、凋亡诱导因子(AIF)、Caspase-3及Bcl-2的表达;各时间点各组剩余大鼠处死后利用Western blotting检测PARP-1、Caspase-3蛋白表达水平,实时荧光定量PCR检测PARP-1、AIF、Caspase-3及Bcl-2的mRNA水平,采用原位末端标记(TUNEL)法检测神经细胞凋亡情况.结果:造模后1d时B、C、D组大鼠BBB评分均为0分;3d时三组间的评分无统计学差异;7d时D组及C组明显高于B组,且D组高(P＜0.05).免疫组化及Western blotting结果显示,脊髓损伤后1～7d,B组脊髓组织中PARP-1、AIF及Caspase-3表达逐渐增强,Bcl-2表达逐渐减弱(P＜0.05);与B组比较,D组及C组的PARP-1、AIF、Caspase-3表达均显著降低,且D组低(P＜0.05);而D组及C组的Bcl-2表达显著高于B组,且D组高(P＜0.05).实时荧光定量PCR检测各目的基因表达水平与其蛋白水平一致.TUNEL结果显示,B组脊髓损伤后3d凋亡细胞多,7d时数量减少,但仍保持在较高水平(P＜0.05);D组及C组凋亡细胞指数均显著低于B组,且D组低(P＜0.05).结论:联合应用PARP-1抑制剂3-AB和Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK可有效抑制大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡,其机制可能与PARP-1、AIF、Caspase-3的表达抑制及Bcl-2的表达上调有关.
关键词： 脊髓损伤 PARP-1抑制剂 Caspase-3抑制剂 凋亡诱导因子 大鼠 -
大黄素通过非Caspase依赖通路诱导膀胱癌细胞BIU87凋亡的机制
目的 研究大黄素对人膀胱癌细胞BIU87凋亡及凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)和核酸内切酶G( Endonuclease G,Endo G)的mRNA和蛋白表达的影响,探讨大黄素的抗癌机制. 方法 取对数生长期的人膀胱癌细胞株BIU87,分别加入大黄素和Caspase抑制剂Z-VAD-FMK共同培养.实验分为4组:空白对照组、Z-VAD-FMK组、大黄素组、大黄素+Z-VAD-FMK组.采用甲基噻唑(MTT)比色法测定不同浓度大黄素在不同作用时间内对体外培养的BIU87细胞增殖的影响,应用流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR检测各组细胞AIF和Endo G mRNA的表达,蛋白质印迹法检测各组细胞AIF和Endo G蛋白的表达. 结果 MTT检测显示,大黄素的浓度越高、作用时间越长,对肿瘤细胞生长的抑制作用越强.根据IC50值,选择80 μmol/L的大黄素干预72 h作为干预条件.大黄素组细胞凋亡率为(44.57±1.52)％,大黄素+Z-VAD-FMK组为(35.58±1.61)％,差异有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR和蛋白质印迹结果显示,大黄素+Z-VAD-FMK组中AIF mRNA和蛋白为1.74±0.11、2.59±0.13,大黄素组为1.36±0.08、1.89±0.14,空白对照组为0.37±0.02、0.53±0.11,Z-VAD-FMK组为0.42±0.06、0.44 ±0.07,大黄素+Z-VAD-FMK组与其他各组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；大黄素+ Z-VAD-FMK组中Endo G mRNA和蛋白为2.28±0.15、3.31±0.36,大黄素组为1.85±0.13、2.15 ±0.27,空白对照组为0.53±0.07、0.71 0.16,Z-VAD-FMK组为0.61±0.04、0.67±0.22,大黄素+Z-VAD-FMK组与其他各组比较,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 大黄素可上调膀胱癌细胞BIU87中AIF和Endo G的表达,通过启动非Caspase依赖途径诱导细胞凋亡.
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PUMA和BIM表达与结直肠癌浸润转移及预后的关系
目的 研究BH3-only蛋白家族中p53上调凋亡调控因子(PUMA)和与bcl-2相互作用的细胞死亡调解因子(BIM)在结直肠癌组织中的表达及其与结直肠癌侵袭、转移和预后关系.方法 采用免疫组化染色方法(EnVision),检测PUMA和BIM蛋白在30例正常大肠黏膜、30例大肠腺瘤及142例结直肠癌组织中的表达.分析PUMA、BIM蛋白表达与患者临床病理特征、预后及化疗耐药相关蛋白[P-糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽S转移酶-π(GST-π)]的相关性.结果 PUMA蛋白在结直肠癌组织中的阳性表达率为82.4％,低于其在大肠腺瘤和正常大肠黏膜组织中的阳性表达率(均为96.7％)(x2=3.93、3.93,P＜0.05).BIM蛋白在结直肠癌组织中的阳性表达率为62.7％,明显低于其在大肠腺瘤组织中和正常大肠黏膜的阳性表达率(90.0％和96.7％)(x2 =8.42、13.29,P＜0.01).PUMA蛋白与BIM蛋白在结直肠癌组织中的表达呈正相关(r=0.747,P=0.000).PUMA蛋白的表达与肿瘤的分化程度(x2 =11.87)、浸润深度(x2=11.59)、淋巴结转移(x2=12.82)、TNM分期(x2=33.47)以及P-gp表达(x2=18.30)有关(P＜0.05),而与患者的年龄、性别、肿瘤大小、病理组织学类型以及GST-π表达无关(P＞0.05).BIM蛋白的表达与分化程度(x2=16.19)、淋巴结转移(x2=14.95)、TNM分期(x2=52.66)以及P-gp表达(x2 =10.60)有关(P＜0.05),而与患者的年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度、病理组织学类型以及GST-π表达无关(P＞0.05).PUMA、BIM阳性表达者的术后1、3、5年生存率明显高于阴性表达者(x2=6.10、27.60,P＜0.05).淋巴结转移(RR=0.238)、TNM分期(RR=7.895)、PUMA(RR=1.691)和BIM蛋白的表达(RR =0.440)可作为结直肠癌独立的预后指标(P＜0.05).结论 PUMA、BIM在结直肠癌中的表达与结直肠癌的侵袭、转移和预后明显相关.PUMA和BIM蛋白表达降低的结直肠癌患者病期晚、预后差.
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FasL嵌合蛋白修饰的供者脾脏细胞输注诱导移植免疫耐受的动物研究
目的 探讨FasL嵌合蛋白修饰的供者脾脏细胞输注诱导移植免疫耐受的可行性.方法 采用ProtEx~(TM)源蛋白修饰技术,将FasL嵌合蛋白修饰供者WF大鼠的脾脏细胞,在围手术期分次输注给受者ACI大鼠.施行大鼠异位心脏移植术,按注射细胞的不同处理将实验动物随机分为3组:(1)SA-FasL修饰的供者脾脏细胞组(SA-FasL组,n=23);(2)链霉亲和素蛋白(SA)修饰的供者脾脏细胞对照组(n=20);(3)未修饰的供者脾脏细胞对照组(n=8).围手术期未作任何细胞治疗为空白对照组(n=10).将耐受大鼠脾脏细胞输注给未处理ACI大鼠再行心脏移植.进行混合淋巴细胞反应;将第三方F344大鼠心脏移植给耐受大鼠,观察排斥反应.结果 SA-FasL组移植心脏长期存活率为70%,显著高于其他组(P<0.05).耐受大鼠的脾脏细胞输注能够过继转移免疫耐受;混合淋巴细胞反应与第三方移植后的排斥反应表明形成了供者特异性免疫耐受.结论 FasL嵌合蛋白修饰的供者脾脏细胞输注能够诱导供者特异的免疫耐受,这一简便高效的方法具有潜在的临床应用价值.
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大黄素抑制人肝癌裸鼠移植瘤生长机制探讨
目的 研究大黄素对人肝癌细胞株SMMC-7721裸鼠移植瘤细胞凋亡及凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)、核酸内切酶G(endonuclease G,Endo G)表达的影响,探讨大黄素体内抗癌机制.方法 复制裸鼠人肝癌移植瘤模型,带瘤模型裸鼠腹腔注射大黄素.实验随机分为对照组(生理盐水+1％ DMSO)、大黄素低剂量组[25 mg/(kg·d)]、中剂量组[50mg/(kg·d)]和高剂量组[100 mg/(kg·d)],每组各8只.观察裸鼠一般生长情况和肿瘤体积变化,计算肿瘤生长抑制率以及肿瘤生长延迟时间.治疗结束次日处死裸鼠,取病变组织后,TUNEL检测肿瘤组织的凋亡指数,免疫组化检测各组AIF和EndoG表达情况.结果 32只裸鼠均成功建立模型.试验过程中裸鼠一般情况正常,实验结束后各组之间裸鼠体质量差异无统计学意义,P=0.79.治疗结束后,与对照组相比,大黄素低、中、高剂量组均有抑制肿瘤生长作用,大黄素各剂量组的肿瘤生长抑制率呈剂量效应正相关.低剂量组肿瘤生长抑制率为(37.2±1.09)％,中剂量组为(57.7±1.15)％,高剂量组为(72.3±1.21)％,高剂量组显著高于中剂量组,P＜0.01;中剂量组显著高于低剂量组,P=0.019.低剂量组肿瘤生长延迟时间为(1.9±0.6)d,中剂量组为(3.4±0.9)d,高剂量组为(4.6±1.1)d.TUNEL结果显示,对照组肿瘤细胞凋亡指数为(8.23±1.65)％,低剂量组为(34.38±8.73)％,中剂量组为(48.14±9.57)％,高剂量组为(68.71±10.56)％.低剂量组较对照组明显升高,P=0.003;中剂量组较低剂量组明显升高,P=0.023;高剂量组较中剂量组明显升高,P=0.009.免疫组化结果显示,随着大黄素剂量的不断增加,肿瘤组织中AIF和EndoG蛋白表达逐渐增强,低剂量组高于对照组,P值均为0.001;中剂量组高于低剂量组,P值分别为0.015和0.004;高剂量组高于中剂量组,P值分别为0.021和0.013.免疫荧光结果显示,不同剂量大黄素组肿瘤组织中AIF及EndoG的表达位置发生了明显变化,出现由胞质向胞核移位的现象;对照组肿瘤组织中AIF、EndoG的表达位置变化不明显.结论 大黄素可以明显抑制人肝癌SMMC-7721细胞在裸鼠体内的生长;经AIF和EndoG介导的非Caspase依赖线粒体通路诱导细胞凋亡,是大黄素抑制人肝癌SMMC-7721细胞移植瘤生长的机制之一.
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凋亡诱导因子介导顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡
目的 研究凋亡诱导因子(AIF)在顺铂诱导肾小管上皮细胞HK-2凋亡中的作用.方法 采用Western blot法和荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)分别检测不同浓度(0、25、50、100、150、200 μmol/L)和不同时间(0、3、6、9、12 h)顺铂作用下,体外培养HK-2细胞中AIF蛋白和mRNA表达.采用免疫荧光染色检测顺铂作用下HK-2细胞AIF表达分布.采用原位末端标记(TUNEL)法和流式细胞仪检测泛caspase抑制剂和AIF靶向siRNA对顺铂作用下HK-2细胞凋亡的抑制作用.结果 经不同浓度和不同时间顺铂的作用,HK-2细胞胞质AIF(cAIF)、胞核AIF(nAIF)及其mRNA表达均有不同程度增加.从25 μmol/L顺铂作用12 h和50 μmol/L顺铂作用3 h起,cAlF表达均有升高,分别是对照组的2.3倍(P<0.05)和1.7倍(P<0.01).nAIF表达呈一定浓度和时间依赖性,在150 μmol/L顺铂作用12 h和50 μmol/L顺铂作用9 h达到高峰,分别为25 μmol/L组的4.3倍(P<0.005)和3 h组的3.7倍(P<0.05),nAIF表达与多聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶1(PARP-1)剪切片段(cl-PARP)的表达趋势基本一致.AIF mRNA表达在50 μmol/L顺铂作用0-9 h区间呈梯度增加.免疫荧光染色结果显示,经顺铂作用后,部分HK-2细胞发生AIF核转位.泛caspnse抑制剂Z-VAD-FMK和AIF siRNA对顺铂诱导细胞凋亡的抑制率分别为60.1%和39.2%,两者联合应用的抑制作用更加明显.结论 AIF蛋白激活和核转位以及AIF mRNA表达的增加介导了顺铂诱导的肾小管上皮细胞的凋亡,可能为防治顺铂诱导的肾毒性作用提供了新靶点.
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苏木水提物诱导人类卵巢癌细胞SKOV3凋亡机制的研究
目的 研究苏木水提物对人类卵巢癌细胞SKOV3的诱导凋亡机制.方法 采用免疫细胞化学法测定不同质量浓度苏木水提物作用后SKOV3细胞中Caspase-3、Caspase-9及Survivin的表达.结果 随着苏木水提物质量浓度的增加Caspase-3、Caspase-9阳性表达率增加,灰度值降低;Survivin 阳性表达率降低,灰度值升高.苏木水提物质量物浓度为0、25、50、100、200 mg/L时,Caspase-3的阳性表达率依次为5.29%、12.61%、24.60%、100.00%、100.00%;Caspase-9的阳性表达率依次为12.32%、29.17%、57.42%、100.00%、100.00%;Survivin的阳性表达率依次为81.62%、60.53%、36.94%、55.69%、36.92%.结论 苏木水提物通过增加Caspase-3、Caspase-9的表达及抑制Survivin的表达而诱导SKOV3细胞凋亡.
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钙调蛋白抑制剂对N-甲基-D-天冬氨酸诱导的大鼠皮质神经元损伤的保护作用
目的 观察钙调蛋白抑制剂W-7对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的皮质神经元损伤的影响,并探讨其可能的机制. 方法 原代培养SD大鼠(120只)皮质神经元,神经元特异性稀醇化酶(NSE)染色方法确定神经元的比例;添加不同浓度的NMDA,制备细胞损伤模型,MTT法评估细胞生存力;原代大鼠皮质神经元培养后,随机分为对照组、损伤组(NMDA)、不同剂量W-7保护组(25、50、100 μmol/L),MTT法评价细胞生存力;对上述各组进行吖啶橙荧光染色,观察细胞凋亡形态;采用Western Blot方法,测定上述各组神经元的p38MAPK和NF-κBp65表达情况. 结果 ①以NSE抗体标记培养的神经元,阳性神经元的比例为90.86%.②不同浓度的NMDA对培养大鼠皮质神经细胞具有损伤作用,实验结果表明50 μmol/L的NMDA对细胞的损伤以凋亡为主,以此剂量做后续实验.③与对照组比较,损伤组的吸光度(A)值降低,差异有统计学意义,P<0.01;与损伤组比较,W-7各保护组A值均升高(P<0.01或P<0.05),差异有统计学意义.④吖啶橙荧光染色可观察到凋亡细胞,保护组随着W-7剂量的增加凋亡细胞数量减少.⑤Western Blot结果显示,W-7可以使p38MAPK和NF-κB p65表达下降,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01). 结论 W-7可能通过降低p38MAPK和NF-κBp65的途径,对NMDA诱导的神经元损伤起保护作用.
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亚低温对脑出血后非caspase酶依赖性凋亡通路的影响
目的 观察亚低温对脑出血后非caspase依赖性通路中关键蛋白-凋亡诱导因子(apoptosis inducingfactor,AIF)表达的影响.方法 采用自体血注入法建立大鼠脑出血模型.将大鼠随机分为生理盐水组、脑出血组和脑出血+亚低温组.采用免疫组化法检测大鼠脑出血后24、72 h及7d时血肿周围组织中AIF的表达;以Tunnel染色法观察各时间点神经细胞凋亡的变化.结果 与生理盐水组比较,脑出血组Tunnel染色阳性细胞数和AIF表达高于生理盐水组(P＜0.05).同时,在脑出血组可以观察到Tunnel染色阳性细胞数和AIF表达在24 h逐渐增加,72 h达高峰(P＜0.01).亚低温组Tunnel染色阳性细胞数及AIF表达在各个时间点均低于脑出血组(P＜0.05).结论 亚低温可能通过抑制脑出血后非caspase依赖性通路中的关键蛋白AIF的表达来减少神经元凋亡,发挥脑保护作用.
关键词： 亚低温 脑出血 非caspase酶依赖性 凋亡诱导因子
