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异种器官移植中PERV病原安全性的研究进展
猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)是指以前病毒DNA形式整合进宿主细胞基因组中,并随细胞染色体复制而复制的反转录病毒.由于PERV在体外可以感染人的多种细胞,这引起了人们对猪-人异种移植病原安全性的广泛关注.本文从PERV的生物学特性、基因组的结构与功能及其病原安全性等几个方面综述了近年来的研究进展.
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化学诱变剂诱发基因突变分子机理研究
应用一将突变靶基因与哺乳细胞基因组DNA相分离的实验体系,证明化学诱变剂诱发的基因突变可发生在损伤碱基以外的正常序列中(非定标性突变),并有突变谱特征和突变好发的序列特异性.它的发生依存于化学诱变剂诱发的基因表达改变,应用mRNA差异显示和反义技术分离到两个基因表达序列标识,其相关基因表达被阻断后可分别促进和抑制化学诱变剂诱发的非定标性突变.用体外DNA复制技术证明其发生基础是由于化学诱变剂引发细胞DNA复制保真度的下降,而细胞错配修复功能未发现异常,但DNA聚合酶酶谱发生改变.还证明它的发生可因细胞应激信号通路激活剂所促进,在化学诱变剂作用后有蛋白磷酸化谱和蛋白酪氨酸残基磷酸化谱的改变以及应激激活蛋白激酶的激活和cAMP浓度升高.细胞信号转导通路的激活参与了非定标性突变的发生.
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细胞周期调节因子ATM、Chk2和p53在乳腺浸润性导管癌中的表达及其临床病理意义
共济失调-毛细血管扩张突变基因(ATM)是重要的细胞周期检测点激酶,参与激活、调控多种细胞周期调节因子和DNA损伤的修复[1].细胞周期检查点激酶2(Chk2)是细胞周期检测点中关键的效应蛋白酶,在维护基因组稳定性及准确传代过程中起重要作用[2].细胞DNA损伤或DNA复制受阻可激活ATM,ATM磷酸化使Chk2激活,而Chk2能磷酸化p53的丝氨酸Ser20位点而保持P53的稳定,ATM也可通过调节p53而诱导凋亡.细胞基因组的稳定性依赖于DNA的损伤修复和细胞周期检测点调控间的相互作用[3].我们就细胞周期调节因子ATM、Chk2和p53基因在乳腺癌中的表达情况及其临床病理关系进行探讨.
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Pinpoint显微切割术分离切片DNA用于分子病理学研究
恶性肿瘤的分子病理学和分子遗传学研究的进展常受到肿瘤组织成分多样性和取材准确性的影响[1,2].原发肿瘤组织通常由肿瘤细胞和非肿瘤细胞混合构成.瘤体内除癌细胞外,还有基质细胞,如:成纤维细胞、内皮细胞等,白细胞以及原器官组织成分[1].大多数肿瘤活检标本都是非肿瘤细胞和肿瘤细胞的混合物,各种成分的多少取决于肿瘤类型、瘤体内的取材部位及既往的处治结果[2].来源于非肿瘤细胞基因组的DNA将影响分子生物学研究结果,其程度决定于肿瘤细胞和非肿瘤细胞基因组DNA的比值和所用方法的敏感性[1].
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显微切割技术联合聚合酶链反应在淋巴瘤诊断中的应用
霍奇金病(HD)的分型比较明确,并因其含有典型的R-S细胞而比较容易诊断,但非霍奇金淋巴瘤(NHL)的诊断,特别是与淋巴细胞反应性增生的鉴别诊断, 一直是临床病理诊断工作中的难点。免疫组织化学染色技术是区分B细胞和 T细胞淋巴瘤的重要手段,但该技术在多数情况下并不能鉴别淋巴细胞的良性和恶性增生。90年代,随着聚合酶链反应(PCR)技术的问世和发展,分析免疫球蛋白重链(IgH)基因和T细胞受体(TCR)基因重排,为鉴别淋巴细胞单克隆增生以及微小残留病灶检测和发现早期转移提供了一种有效的方法,对指导临床治疗和判断预后也有重要意义,已广泛应用于临床工作。但由于淋巴瘤组织,除了淋巴瘤细胞以外,还包括反应性增生的B细胞或T细胞,以及基质细胞等非肿瘤细胞,这些非瘤组织细胞的基因组DNA会掩盖瘤细胞基因组DNA的扩增,从而导致PCR假阴性结果。
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转基因小鼠研究进展
转基因动物是指用实验的方法将外源基因导入早期胚胎细胞,使之整合于细胞基因组中而建立的动物品系.早建立成功的转基因动物是转基因小鼠(transgenic mice).由于转基因小鼠的建立比其它大型转基因哺乳动物的建立要省时、省力,因此转基因小鼠作为生命科学研究的一个新体系已经得到越来越广泛的应用.
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p53结合蛋白对细胞周期阻滞与细胞凋亡调控的研究进展
p53基因是人体内重要的肿瘤抑制基因,位于人类染色体17p13.1,含有11个外显子,编码的野生型p53蛋白由393个氨基酸残基组成,包含N-末端的转录激活结构域、生长抑制结构域、序列特异的DNA结合结构域(DNA binding domain,DBD)、核定位信号(nuclear localization signal,NLS)、四聚体化结构域和C-末端非专一DNA调节结构域.p53在监视细胞基因组损伤及维持基因组的稳定性中发挥重要作用.当紫外线、电离辐射、氧化应激及癌基因表达等刺激因素引起细胞内DNA损伤时,p53蛋白迅速聚集活化,并作为序列特异性转录因子对一系列靶基因进行调控.
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逆转录病毒载体介导反义K-ras基因治疗胰腺癌的实验研究
目的:分离及克隆胰腺癌细胞基因组中K-ras基因片段,构建含反义K-ras癌基因逆转录病毒载体并探讨其对胰腺癌细胞增生、凋亡的影响及可能的分子机制.方法:设计2对PCR引物,分别在上下游引物中引进BamHI和EcoRI位点,以胰腺癌细胞株BxPC-3、PC-3基因组DNA为模板扩增K-ras基因外显子1、4及侧翼序列,将目的基因克隆入逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒,经PT-67细胞包装后获得重组逆转录病毒.将该重组逆转录病毒转染上述细胞,经G418筛选获得稳定细胞,应用MTT、流式细胞仪和免疫组化法分别研究其增生、凋亡和对胰腺癌p21蛋白表达;建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型,观察反义K-ras基因体内治疗效果.结果:成功构建含反义K-ras基因的重组逆转录病毒载体.反义K-ras基因抑制胰腺癌细胞增生,诱导细胞凋亡、下调K-rasmRNA和P21蛋白表达,并抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的生长.结论:反义K-ras基因可使胰腺癌细胞增生受到抑制,并可诱导细胞凋亡和下调K-rasmRNA和P21蛋白表达.
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原代猪肝细胞PERV检测及其意义
目的:探讨猪肝细胞内源性逆转录病毒(PERV)检测方法及意义.方法:采用体外二步灌流法获取猪肝细胞,使用特异性引物对其前病毒序列进行观察;以未逆转录PCR为对照,采用RT-PCR方法检测原代猪肝细胞PERV携带及释放情况,并用套式RT-PCR对扩增产物进行鉴定.结果:原代猪肝细胞基因组中可检测到PERV前病毒序列,肝细胞中亦可检测到特异性的PERV RNA序列.在缺乏有丝分裂原刺激的情况下,猪肝细胞普通培养的不同时段均可检测到病毒释放,并可持续至细胞死亡.结论:中国实验小型猪肝细胞携带PERV病毒序列,猪肝细胞普通培养时可释放该病毒,其感染性及生物安全性尚需进一步研究.
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乙型肝炎病毒DNA整合的机制及后果
乙型肝炎病毒(HBV)的感染,与肝细胞癌(HCC)的发生发展密切相关.关于HBV DNA与肝细胞基因组DNA之间的整合,在HCC的发病过程中具有十分重要的意义.经过30 a的积累,形成了一整套研究HBV DNA整合有效的研究技术.参与整合的HBV DNA片段大小不等,主要包括乙型肝炎病毒编码反式调节蛋白的基因区段,如X基因和羧基末端截短的表面抗原中蛋白的编码基因等.关于HBV DNA整合位点也没有明确的特异性位点.HBV DNA与肝细胞基因组DNA整合之后,引起了肝细胞染色体的不稳定性,甚至导致染色体的异常转位.整合的HBV DNA可通过调节基因序列启动指导细胞恶性转化的相关基因,同时HBV DNA整合的基因片段编码的反式激活蛋白可激活细胞生长及恶性转化的基因,导致正常肝细胞的恶性转化.与HBV DNA基因整合相关蛋白的研究还处于初级阶段,包括15AB结合蛋白、小鼠上游结合因子结合蛋白、DNA结合蛋白A、整合序列结合蛋白3以及转录因子阴和阳1蛋白有关.关于HBV DNA整合机制和后果的研究,必将进一步阐明HCC发生的分子生物学机制,为探索新型的治疗技术和治疗方法奠定基础.
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乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白研究进展
目前对乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的急性、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的治疗,还没有理想的疗效.利用新型技术对HBV感染肝细胞的相关受体蛋白进行研究,即对HBV表面抗原中蛋白结合蛋白进行筛选是一个重要的研究方向.HBV进入肝细胞之后,其基因组在肝细胞内具有顺式和反式两种调控方式HBV蛋白对肝细胞基因组的反式调节作用影响了肝细胞的基因表达谱,从而对肝细胞的生长、代谢及恶性转化产生重要影响.研究羧基末端截短的表面抗原中蛋白的结合蛋白可能是阐明HBV感染慢性化及引起肝细胞癌的重要分子生物学机制之一.
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基因疫苗的基础研究及应用现状
基因疫苗已成为疫苗研究领域中的热点之一,特别是其研究方向与世界卫生组织儿童免疫长远目标-用一种疫苗预防多种疾病相吻合.从效力到成本的潜在优点已使基因疫苗成为今后疫苗制造的选择,故澳大利亚昆士兰医学所的Waine和McManus在
上论证,基因疫苗为第三次疫苗革命.令人鼓舞的是艾滋病和T细胞淋巴瘤的基因疫苗已进入到了临床前阶段.基因疫苗不仅能预防某些传染病,还可做为治疗用疫苗来治疗一些复杂难治的疾病,例如病毒性肝炎、癌症等.这些均已显示出基因疫苗的巨大潜力和应用前景.但是,基因疫苗的历史毕竟很短,实验结果均来自动物,在用于人体之前还有许多工作必须完成,其中重要的是解决基因疫苗对人体的安全性和效力问题,例如:(1)须用与人类疾病相关的动物模型证实其效果;(2)须用高度敏感的PCR技术等确证所注射的DNA不与宿主细胞基因组DNA整合,这是确保DNA疫苗遗传学安全性的重要指标之一;(3)终还需要近期和长期的临床试验以明确其毒副作用和免疫保护效果.我国已制定了基因转移治疗的管理条例,基因免疫作为预防性基因治疗技术,同样应遵守此条例,这样才有利于基因治疗的健康发展. -
肝炎病毒蛋白对肝细胞基因组转录调节及信号转导机制的影响
乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)是引起慢性病毒性肝炎的主要肝炎病毒类型,而且也是肝细胞癌(HCC)的重要病因.HBV和HCV感染肝细胞之后,表达出肝炎病毒蛋白,HBV和HCV蛋白通过与转录因子蛋白结合,或通过对于肝细胞内信号转导通路的影响,使肝细胞基因组的转录表达产生异常的调节,从而影响HCC的发生.
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病毒性肝炎发病机制中的反式调节机制
病毒性肝炎的发病机制中涉及到复杂的反式调节(transregulation)机制.肝炎病毒的反式调节机制至少包括三方面的含义:一方面是肝炎病毒蛋白对于肝细胞基因组表达调节的反式调节,即肝炎病毒蛋白与肝细胞基因组启动子DNA结合,对于肝细胞基因表达谱产生影响;第二方面是肝细胞蛋白对于肝炎病毒基因表达的反式调节.肝炎病毒属于简单的生物类型,要完成其生活周期,必须借助于肝细胞中的蛋白成分,肝细胞中特有的一些蛋白成分,与肝炎病毒基因组DNA/RNA结合,对于肝炎病毒基因表达进行调节,这也是决定肝炎病毒嗜肝特性的重要的分子生物学机制;第三方面是肝炎病毒蛋白对于肝炎病毒基因组表达的反式调节.这是所有病毒复制和表达调节的一般机制.关于肝炎病毒反式调节机制的研究,主要是阐明肝炎病毒为何在肝细胞中的复制和表达处于佳状态,阐明肝炎病毒的致病机制,有助于据此设计新型的抗肝炎病毒的治疗技术和治疗方法.
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乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒蛋白对亮氨酸拉链蛋白LZIP的调节
乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌(HCC)的发生密切相关.虽然HBV、HCV感染与肝细胞癌之间的关系已经得到确定,但是具体的分子生物学机制还有许多工作要做.其中肝炎病毒编码蛋白对于肝细胞基因组表达的反式调节作用,即肝炎病毒蛋白与肝细胞基因组启动子DNA结合,对于肝细胞基因表达谱产生影响,从而调节肝细胞的生长、代谢、凋亡及恶性转化,在病毒感染致病机制中起着重要作用[1-5].人碱性亮氨酸拉链蛋白LZIP是碱性亮氨酸拉链蛋白家族重要成员之一,在肝炎病毒致肝细胞癌发生过程中发挥重要作用.
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乙型肝炎病毒蛋白反式激活基因的研究
0引言乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生、发展过程密切相关[1-5 ].病毒进入到肝细胞之后,肝炎病毒蛋白在肝细胞内不是孤立存在的,病毒基因组在肝细胞内具有两种调控方式:其一是顺式调节,如启动子及增强子序列,以直接方式影响另外一些基因组的功能,是基因组内部调节方式;其二是反式调节,即基因组中一部分基因片段通过其转录或翻译产物产生对另一部分基因片段表达的调节方式,如病毒基因组表达的反式激活蛋白,以其表达产物的间接方式参与另外一些基因的功能调节,可以对基因组内部的基因片段,甚至可以对另外细胞或病毒的基因组有调控作用.这种病毒蛋白对肝细胞基因组的反式调节作用,影响了肝细胞的基因表达谱,是病毒感染慢性化以及引起感染的肝细胞发生恶性转化的重要的分子生物学机制之一[6-8].
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乙型肝炎病毒基因组结构与功能复杂性的研究进展
编者按关于乙型肝炎病毒(HBV)病毒的受体,HBV DNA与肝细胞基因组DNA之间的整合及其后果,HBV蛋白在肝细胞中与肝细胞蛋白之间的相互结合和相互作用,HBV DNA RNA与肝细胞中蛋白的结合及其调节作用,HBV蛋白对于肝细胞基因表达谱的影响等,目前尚不十分清楚.在HBV DNV克隆化完成之后,立即确定了4个公认的开放读码框架(ORF),但是HBVDNA中是否还会存在其他的ORF,这此,ORF编码的蛋白究竟起什么样的作用,一直是人们怀疑和探索的焦点.
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乙型肝炎、性病和HIV-1感染人群中CCR5,CCR2和SDF1等位基因多态性的研究
目的:研究乙型肝炎、HIV-1感染者和性病患者中CCR5,CCR2和SDF1等位基因的分布及其特点.方法:收集乙型肝炎患者(268例)、艾滋病感染者(130例)和性病(259例)的血液标本共657份,应用QIAGEN全血细胞基因组提取试剂盒,分离纯化人血细胞基因组DNA样品应用PCR或PCR-RFLP分析CCR5,CCR2-641和SDF1-3'A等位基因突变频率和分布特点.结果:在乙型肝炎、性病和HIV-1感染者人群中,CCR5△32的突变频率分别为0.19%、0%和0%.在259例个体性病患者中只有一例男性发生了杂合子突变,而在乙型肝炎和HIV-I感染者人群中没有检测出CCR5△32突变基因.可见,CCR5△32的突变率较低反之,CCR2-641的突变频率较高,与前述三种患者对应的突变频率分别为19.3%、19.6%和20.7%.进而分析发现SDF1-3'A等位基因在乙肝、性病和HIV-I感染人群中的突变率分别为27.8%,27.4%和26.9%.应用X2检测与统计学分析显示在乙肝,性病和HIV-I感染人群中CCR2-641和SDF1-3'A等位基因突变分布之间无连锁关系结论:突变频率很低的CCR5△32基因型在上述3种类型传染病的发病过程中可能不起主要作用;而突变频率较高的CCR2-641和SDF1-3'A基因型的功能及其在上述3种传染病进程中的意义有待进一步研究.
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胰岛素受体基因多态性与缺血性脑血管病的关系
本研究拟在分析脑梗死患者胰岛素受体(INSR)基因突变热区第17、20外显子序列变异的基础上,探讨该基因在脑血管病发病中的作用。 1.资料与方法:缺血性脑卒中患者149例,其中动脉粥样硬化(AS)性血栓性脑梗死(ACI)68例,男46例,女22例,年龄(66.6±9.5)岁;腔隙性脑梗死(LI)81例,男51例,女30例,年龄(66.4±9.8)岁。同时选择年龄、性别匹配的健康体检者62例作为正常对照者(HC),男40例,女22例,年龄(65.3±7.3)岁。对3组间分别以χ2 检验性别(χ2 =0.27,P>0.05)、以F检验年龄(F=2.52,P>0.05)差异未见显著性。以苯酚-氯仿法抽提白细胞基因组DNA;根据Seino等[1]对INSR基因研究,PCR扩增第17、20外显子序列;以8%非变性聚丙酰胺凝胶(Acr∶Bis为49∶1)电泳对扩增产物进行单链构像多态性(SSCP)分析。血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、载脂蛋白(Apo)B和ApoA-Ⅰ等由医院检验科测定。
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干扰素的临床应用评价
干扰素(interferon,IFN)是一种具有广泛生物活性的细胞因子,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用,是由宿主细胞受到病毒感染或干扰素诱生剂等激发后诱导产生的活性糖蛋白,该蛋白在同种细胞上具有广谱抗病毒活性,其活性受细胞基因组的调节和控制。