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福氏痢疾杆菌2b血清型菌株基因组中SfII和SfX前噬菌体整合位点及排列方式研究
目的 研究福氏痢疾杆菌2b血清型菌株中SfII和SfX前噬菌体整合位点及排列方式.方法 根据2b血清型菌株基因组中SFII和SfX前噬菌体可能的整合位点及排列方式,设计引物,对50株2b血清型菌株进行PCR扩增,并对扩增产物测序,根据扩增和测序结果判断噬菌体的整合位点和排列方式.结果 在2b血清型菌株中,SfII和SfX前噬菌体前后相连,整合于宿主菌染色体proA和yaiC基因间的thrW tRNA基因上;以SfII在前,SfX在后,或SfX在前,SfII在后两种方式排列;而以后一种方式为主,在共50株检测菌株中,有49株为此方式.结论 福氏痢疾杆菌血清型相关噬菌体的整合位点及排列方式,对研究福氏痢疾杆菌血清型转换及血清型相关噬菌体的整合机制具有重要意义.
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优化反向PCR法对hTF转基因小鼠整合位点旁侧序列分析
自1982年世界上首次通过转基因动物技术获得"巨鼠"[1]以来,转基因动物的研究发展迅速.随着多种转基因动物的成功获得,研究者设想利用动物表达外源基因,以动物个体作为一个反应器来生产有价值的蛋白质.
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乙型肝炎病毒DNA整合的机制及后果
乙型肝炎病毒(HBV)的感染,与肝细胞癌(HCC)的发生发展密切相关.关于HBV DNA与肝细胞基因组DNA之间的整合,在HCC的发病过程中具有十分重要的意义.经过30 a的积累,形成了一整套研究HBV DNA整合有效的研究技术.参与整合的HBV DNA片段大小不等,主要包括乙型肝炎病毒编码反式调节蛋白的基因区段,如X基因和羧基末端截短的表面抗原中蛋白的编码基因等.关于HBV DNA整合位点也没有明确的特异性位点.HBV DNA与肝细胞基因组DNA整合之后,引起了肝细胞染色体的不稳定性,甚至导致染色体的异常转位.整合的HBV DNA可通过调节基因序列启动指导细胞恶性转化的相关基因,同时HBV DNA整合的基因片段编码的反式激活蛋白可激活细胞生长及恶性转化的基因,导致正常肝细胞的恶性转化.与HBV DNA基因整合相关蛋白的研究还处于初级阶段,包括15AB结合蛋白、小鼠上游结合因子结合蛋白、DNA结合蛋白A、整合序列结合蛋白3以及转录因子阴和阳1蛋白有关.关于HBV DNA整合机制和后果的研究,必将进一步阐明HCC发生的分子生物学机制,为探索新型的治疗技术和治疗方法奠定基础.
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建立反向PCR检测HIV-1整合位点的方法
高效抗反转录病毒治疗(highly active anti-retmviral therapy,HAART)可降低艾滋病的发病率和死亡率,使感染者血浆中HIV-1 RNA降至常规方法检测不到的水平[1-2],但用敏感度高的方法仍可检测到病毒基因和低水平的病毒复制,这是因为存在HIV-1潜伏库,含有整合HIV DNA的静止性CD4+T细胞是主要的HIV-1潜伏库[3-5].
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用荧光原位杂交技术检测hEPO转基因山羊染色体上外源基因的整合状况
目的对采用受精卵显微注射方法获得的3头hEPO转基因山羊进行检测和整合状况分析.方法用荧光原位杂交的方法,以正常羊及正常人染色体标本为对照,通过生物素标记的探针与转基因羊染色体标本进行杂交.结果经信号放大及DAPI染色后,3头转基因羊分别在不同染色体上各有一对明显的荧光信号,而对照组无信号.结论hEPO基因在转基因山羊染色体上的整合是单位点整合,分别整合在不同的染色体上.
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噬菌体整合酶--基因转移的工具酶
噬菌体整合酶是整合位点序列特异性的酶类.由于这一特性,它可用于向染色体定位特异性地导入目的基因,在遗传工程、基因治疗、转基因动物等领域极具应用前景.本文综述噬菌体整合酶的发现与分类、结构与功能及其应用前景.
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铜绿假单胞菌噬菌体PaP3整合位点的鉴定
目的:确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3在宿主菌基因组中的整合位点.方法:利用在噬菌体PaP3基因组中无酶切位点的Pst Ⅰ对溶原性细菌全基因组进行酶切,获得含有噬菌体PaP3全基因组及部分宿主菌DNA序列的大片段;然后进行第二次酶切,获得噬菌体基因组与宿主菌基因组的交界点序列,并进行克隆、测序,鉴定出杂合位点attR.根据λ噬菌体的整合机制,利用PCR反应扩增出另一杂合位点attL,根据测序结果及Blast检索确定attP与attB的位置和DNA序列.结果:经序列比对发现,attP及attB的核心位点分别位于噬菌体PaP3基因组中的t-RNAPro基因及铜绿假单胞菌PA3基因组中的t-RNALys基因中,其核心位点的DNA序列为21 bp(5'-GGTCGTAGGT-TCGAATCCTAC-3.).在核心位点的两侧存在正向重复序列及反向重复序列.结论:该研究为铜绿假单胞菌噬菌体的整合酶及整合机制的研究奠定了基础.
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Bmi-1基因与PI3K/AKT信号通路关系的研究进展
B细胞特异单克隆鼠白血病病毒整合位点基因(B cell-specific MLV integration site-1,Bmi-1),又被称为干细胞更新因子,是荷兰癌症中心于1991年在寻找能与癌基因c--mTyc相互协同引起转基因小鼠患上淋巴瘤的实验中发现的[1].它的异常表达与人类多种肿瘤的发生、发展过程密切相关[2-4].Ink4a/Aff信号通路一直被认为是Bmi-1基因调控肿瘤细胞的经典通路[5-7].
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乙型肝炎病毒基因的整合及对宿主的影响
乙型肝炎病毒是导致慢性肝炎、肝硬化及肝细胞癌的主要病因[1-2].在原发性肝细胞癌(HCC)组织中HBV DNA的检出率可高达40%～50%,且以整合型为主,乙型肝炎病毒基因整合入肝细胞基因组被认为是肝细胞癌发生过程中的重要步骤.本文将对乙型肝炎病毒不同感染阶段的整合、整合的病毒分子、在宿主细胞基因组上的整合位点及整合机制分别进行阐述.
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慢病毒载体介导的转基因整合位点研究方法
慢病毒载体整合到宿主细胞的染色体上可以长期稳定表达,目前已成为基因治疗和转基因动物载体研究的热点.慢病毒载体整合的位置效应是影响外源基因表达的重要因素,慢病毒载体整合位点的研究是探索外源基因整合机制的手段之一.转基因整合位点研究的方法主要有5种:荧光原位杂交、个体基因组文库筛选法、反向PCR、接头PCR、锚定PCR.近来的研究后发现整合位点之间可能存在一些共同特征.
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Tbx18-Cre基因敲入小鼠Cre基因保真性研究
目的 揭示Tbx18-Cre基因敲入小鼠Cre基因表达的保真性.方法用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)快速检测基因敲入小鼠外源基因Cre的相对拷贝数;Junction PCR验证基因敲入小鼠整合位点Tbx18-Cre的纯合性;利用Tbx18 Cre-/-纯合子小鼠模型验证Cre基因对下游基因的影响;利用Tbx18-Cre/Rosa26R-LacZ示踪模型,通过检测LacZ的表达,验证Cre基因的时空保真性.结果 实时荧光定量PCR验证Tbx18基因敲入小鼠外源基因Cre的相对拷贝数准确,Junction PCR验证其整合位点特异.Tbx18 Cre-/-纯合子小鼠模型能特异性阻断转录因子Tbx18的表达,引起信号下游基因CX40、CX43、CX45的表达明显升高.Tbx18-Cre/Rosa26R-LacZ示踪模型LacZ蛋白表达部位与Tbx18 mRNA表达部位一致.结论 Tbx18-Cre基因敲入小鼠中Cre基因具有高度准确的时空保真性和特异性.
关键词： Tbx18-Cre基因敲入小鼠 整合位点 谱系示踪 -
应用接头PCR克隆慢病毒介导的转基因小鼠整合位点旁侧序列
目的 为鉴定慢病毒介导的转基因小鼠中外源基因的整合位点信息,应用接头PCR克隆整合位点旁侧序列.方法 小鼠基因组总DNA酶解后与设计的接头片段连接,根据慢病毒的LTR序列设计巢式PCR引物,克隆转基因小鼠整合位点旁侧序列.结果 成功克隆到转基因小鼠整合位点的旁侧序列,经过测序定位于小鼠染色体上.结论 作为反向PCR的改进,本方法可用于转基因小鼠整合位点旁侧序列的克隆, 为分析整合位点与外源基因表达之间的关系等提供了科学依据.
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HBsAg阳性肝癌细胞基因组中HBx相关整合位点的探讨
目的 探讨HBsAg阳性肝细胞肝癌(HCC)细胞基因组中HBV X基因(HBx)所参与整合的位点.方法 取6例HBsAg阳性HCC患者癌组织,提取基因组DNA;行酶切、连接操作；针对HBx设计引物,行反向PCR扩增;将产物电泳后切胶回收特异性电泳条带,从中回收DNA并克隆至pMD18-T载体,转化、培养后取菌液行基因测序；用Blast工具进行序列比对.结果 反向PCR扩增后,电泳检测可见7条特异性条带；克隆后得到测序结果22个；经序列比对发现3个整合位点,分别定位于19q12、2q32.2、22q12,其中,定位于19q12的基因为CCNE1.结论 在HBsAg阳性HCC细胞基因组中存在HBx的整合;19q12、2q32.2、22q12是HBx参与整合的位点；提示HBV整合的CCNE1基因参与了HBsAg阳性HCC的发生和发展.
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慢病毒载体在人角质形成细胞基因组中的整合位点分析
目的 检测慢病毒载体(lentiviral vector)在人角质形成细胞基因组中的整合位点,初步分析慢病毒载体在表皮细胞基因组中的整合位点分布规律.方法 以本课题组前期研究中构建的慢病毒载体感染的人永生化角质形成细胞系为研究对象,应用连接介导PCR(ligation-mediated PCR,LM-PCR)技术克隆慢病毒载体在其基因组中的整合位点序列,测序克隆片段后经在线工具GTSG-QuickMap在人类基因组上定位,从而得到整合位点.再从整合位点分布与染色体、基因及其转录起始位点的关系来分析慢病毒载体在人角质形成细胞基因组中的整合倾向性.结果 对1 148个阳性转化子DNA测序及定位分析,共得到199个整合位点.与GTSG-QuickMap模拟的随机对照相比,慢病毒载体的整合频率在第4、5、15、16号染色体上、基因转录起始位点上游5 kb至50 kb范围内显示出统计学显著性差异.结论 慢病毒载体倾向于整合在人角质形成细胞基因组中的基因转录起始位点附近区域,而并不倾向于整合在基因内部的整合模式.
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应用双色荧光原位杂交技术对转基因小鼠进行整合位点的染色体定位
目的 建立一种高度灵敏、特异的双色荧光原位杂交(dual-color fluorescence in situ hybridization,D-FISH)技术,对两种双阳性转基因小鼠外源基因进行整合位点的染色体定位.方法 对一只整合单纯疱疹病毒胸苷嘧啶激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-tk)/增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,eGFP)的转基因小鼠以及两只整合RNA干扰载体(RNA interference,RNAi)的β654地中海贫血模型小鼠进行实验,脾脏细胞经培养后获得中期分裂相标本片,各加入适量生物素、地高辛标记探针混合液杂交,分别用罗丹明红色荧光抗体及FFIE绿色荧光抗体进行D-FISH检测.结果 两种转基因小鼠均能在同一个分裂相上同时检测到双色荧光信号.其中,HSV-tk/eGFP双阳性小鼠的分裂相上出现较强的绿色HSV-tk信号和红色eGFP信号,分别定位于染色体2E5-G3及8A2-A4;β654/RNAi双阳性小鼠检测到红色β654荧光信号及绿色RNAi荧光信号.经定位分析,β654均整合在染色体7D3-E2,RNAi病毒载体则是随机整合,其中一只鼠主要整合在1281位点,而另一只鼠主要整合在染色体1E2.3-1F、3A3两个位点.结论 用自行制备的DNA探针建立了高度灵敏、特异的D-FISH技术,同时结合G显带对双阳性转基因小鼠进行染色体基因定位.该技术平台的建立对于转基因动物和基因治疗动物模型的研究具有非常重要的意义.
