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乙型肝炎病毒B基因亚型(Ba,Bj)半巢式PCR检测方法的建立
目的 建立一种灵敏特异且简便易行的乙型肝炎病毒(HBV)B基因Ba和Bj亚型分型方法.方法 用DNAStar软件比较分析GenBank中登录的B基因型HBV(HBV/B)和C基因型HBV(HBV/C)的基因序列,分别设计出HBV/B型特异性引物HB及Ba和Bj基因亚型特异性引物BA和BJ.第一轮PCR反应以HBV/B型特异性引物HB作为上游引物,以日本学者Sugauchi等设计的引物HBAS-4V作为下游引物(外引物);第二轮PCR反应同样以HB作为上游引物,亚型特异性引物BA和BJ作为下游引物(内引物),在同一个反应管中进行.根据PCR产物片段的大小判定B基因亚型.随机选取实验室内经型特异性引物PCR法鉴定为HBV/B(56份)及经preS/S区序列测定证实为HBV/C(15份)的HBV慢性感染者血清标本共71份,以研究设计的引物进行半巢式PCR反应,检测Ba和Bj基因亚型,并以载有HBV Bj亚型基因组的质粒作为Bj亚型的阳性对照.然后随机选取15份B型样本的第一轮PCR产物直接测序,利用Blast和DNAStar软件将测序结果与GenBank中登录的Ba及Bj亚型序列进行同源性分析,验证该半巢式PCR法的准确性.结果 56份HBV/B血清标本经该半巢式PCR法检测,均为Ba亚型,随机选取的15份B型PCR产物直接测序,结果均为Ba亚型,与研究中应用的半巢式PCR方法检测结果一致.15份HBV/C的血清标本检测结果均为阴性.结论 建立了HBV Ba和Bj亚型半巢式PCR法.该方法灵敏、特异、简便、易行,可用于临床和流行病学大样本检测.
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半巢式聚合酶链反应一次加样法检测血液HBV DNA
目的消除巢式聚合酶链反应(nested PCR)检测乙型肝炎病毒(HBV)实验中2次加样带来交叉污染的机会,提高PCR特异性和敏感性.方法通过设计内部、外部引物的不同长度和不同反应浓度,改变退火温度,建立半巢式PCR一次加样法检测HBV DNA.3个PCR引物同时加入反应管进行2次PCR反应,在一个反应管内完成巢式PCR.结果该法可检出4个分子的目的基因片段.在16例ELISA和常规PCR检测HBV阴性的血清标本中,半巢式PCR一次加样法检出2例阳性.结论该方法简便、敏感、特异.与ELISA同时应用,可提高临床标本HBV阳性检出率,减少假阴性,这对减少输血等引起的HBV传播具有积极意义.
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外套细胞淋巴瘤bcl-1/IgH基因重排的检测与序列分析
目的:寻找一种敏感、特异而又快捷的方法检测外套细胞淋巴瘤中bcl-1/IgH基因重排,并分析bcl-1/IgH基因重排产物的序列,以了解bcl-1/IgH基因重排发生的确切机理.方法:对28例经临床确诊的外套细胞淋巴瘤的新鲜冰冻组织,通过半巢式PCR检测bcl-1/IgH基因重排,并对bcl-1/IgH基因重排产物进行克隆和序列分析.结果:通过半巢式PCR测到有bcl-1/IgH基因重排者计17/28例.而采用一步法PCR仅9例有此基因重排,两者相比,差异显著(χ2=4.59,P<0.05).对bcl-1/IgH基因重排产物进行序列分析后发现,bcl-1/IgH基因重排产物为74～162 bp大小,融合基因连接区为6～24 bp大小.在断裂点集中的65 bp范围内,找到10个不同的断裂点,其中5个未见文献报道.对JH基因序列的分析,发现bcl-1/IgH基因重排时,JH1,JH3,JH4,JH5和JH6都可能参与重排,其中,以JH4多见,而JH2则没有涉及.结论:该半巢式PCR方法是检测外套细胞淋巴瘤中bcl-1/IgH基因重排的一种敏感而特异的方法,对外套淋巴细胞淋巴瘤的明确诊断和治疗都有一定的指导意义,而对bcl-1/IgH基因重排的序列分析,则将为外套细胞淋巴瘤的的发病机理研究提供理论依据.
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快速检测细菌并革兰分型的半巢式聚合酶链反应及其初步应用
目的以半巢式聚合酶链反应(PCR)检测细菌及作革兰阴、阳性分型,并与细菌培养法比较.方法以细菌16S rRNA基因为靶序列,采用一对通用引物(pm1, pm3)和一条革兰阴性型特异性引物(pm2),以半巢式PCR方法扩增实验室保留菌株的DNA并作出革兰染色分型;以人类外周血白细胞基因组DNA、HBV-DNA阳性血清以及白假丝酵母菌为对照,检测此方法的特异性;采用倍比稀释菌液作敏感性实验;与细菌培养法比较,验证此方法检测临床标本的敏感性. 结果对17个实验室保留菌株进行检测,以通用引物对作第1次PCR均得到371 bp长度的DNA片段;再以革兰阴性菌特异引物对(pm2, pm3)作第2次PCR,9种阴性菌均得到353bp的DNA片段,而8种阳性菌未被扩增.特异性实验表明,此通用引物与人类基因组DNA、真菌及病毒无交叉反应.敏感性实验表明,采用半巢式PCR可检测出3个CFU的细菌.对120份临床标本检测,半巢式PCR检测阳性率(29.2%)显著高于细菌培养法检测阳性率(17.5%). 结论此半巢式PCR检测细菌方法,具有特异、敏感、快速的特点,并能对细菌进行革兰阴性、阳性分型,可用于临床感染性疾病的初步诊断.
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猪附红细胞体半巢式PCR诊断方法的建立
目的 为能够更加准确、敏感的检测出猪附红细胞体(Mycoplasma suis,M.suis),本试验建立一种新的诊断方法-半巢式聚合酶链反应( hemi-nested Polymerase Chain Reaction ,hemi-nested PCR).方法 利用Oligo 6.0和Primer 5.0软件设计筛选出合适的PCR引物,经酶切分析和半巢式PCR进一步鉴定后进行序列测定.同时与普通PCR诊断方法进行比较.结果 测得的猪附红细胞体基因序列与GenBank中发表的猪附红细胞体基因序列(AJ504999)同源性为100%.特异性试验结果表明本实验设计的PCR引物不能从弓形虫、链球菌、大肠杆菌、猪肺炎支原体和猪伪狂犬病病毒的基因组DNA中扩增出条带.通过敏感性试验,半巢式PCR诊断方法低能够检测出0.12fg的标准模板DNA.通过与普通PCR比较,证明本试验建立的半巢式PCR更具敏感性和实用性.结论 本试验建立的半巢式PCR诊断方法具有特异、敏感、实用等特点,为猪附红细胞体的检测提供了一种可靠的诊断方法.
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河北地区TT病毒感染与不同型别病毒性肝病的关系
目的 分析健康人群及肝病患者TTV感染状况. 方法 采用TTV(N22)区核苷酸序列设计引物,建立半巢式聚合酶链反应(Semi-nested PCR)方法,对309例7种不同人群血清检测TTV DNA. 结果 TTV在非甲-非戊型肝炎、肝硬化患者、丙型肝炎、急性甲型肝炎、急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎和健康人群中感染率分别为75.00%(15/20)、75.00%(27/36)、61.90%(13/21)、58.06%(18/31)、52.78%(38/72)、45.61%(26/57)和38.89%(28/72).肝硬化患者及非甲-非戊型肝炎感染率明显高于健康人群(P＜0.01),也明显高于急、慢性乙型肝炎患者(P＜0.05).21～30岁年龄组TTV感染率(39.06%)显著低于51～60岁年龄组感染率(68.75%)(P＜0.01),其他年龄间无差异.急性甲型肝炎、急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎与丙型肝炎之间无统计学意义,性别之间亦无统计学意义. 结论 TTV在河北地区健康人群及肝病患者中有较高的感染率,TTV感染与不明原因ALT升高有一定的关系.
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半巢式聚合酶链反应在浆膜腔细菌感染诊断中的初步应用
目的 观察革兰分型半巢式聚合酶链反应(PCR)在浆膜腔细菌感染诊断中的应用价值.方法 对30例浆膜腔积液标本,以细菌16SrRNA基因为靶序列,采用一对通用引物和一条革兰阴性菌特异性引物,以半巢式PCR方法进行检测,并同时作细菌培养.结果 以通用引物对30例标本作第1次PCR,11例扩增出371 bp长度的DNA片段,阳性率为36.7%;对阳性PCR产物再以革兰阴性菌特异性引物作第2次PCR,9例扩增出353 bp的DNA片段即为革兰阴性菌.对此30例标本作细菌培养,阳性率为16.7%,低于PCR扩增法.5例标本细菌分离结果与半巢式PCR革兰分型结果相同.结论 革兰分型半巢式PCR方法能够灵敏地检测细菌并作出革兰阴性、阳性分型,对于浆膜腔感染的早期诊断具有较好的应用价值.
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瘦素受体基因多态性与2型糖尿病及肥胖的关系
目的探讨瘦素受体(leptin receptor,LR)基因多态性与2型糖尿病和肥胖的关系,并验证用口腔脱落细胞取代静脉血制备DNA模板的可能性.方法应用半巢式聚合酶链反应, 结合限制性酶切片段长度多态性,检测237名中国湖北汉族人的LR基因外显子20的基因多态性,分析其与肥胖及2型糖尿病各临床变量之间的关系.结果被测对象LR外显子20存在明显的基因多态性,在所有检测对象中,+2927位核苷酸的等位基因均为A;而+3057位核苷酸G→A变异频率为75%.糖尿病组和正常糖耐量组+3057位基因变异频率比较差异有显著性(81.3% vs 68.4%,P＜0.05).多因素Logistic回归分析发现:+3057位G→A变异与2型糖尿病患者体重指数、腰围/臀围、舒张压、甘油三酯、总胆固醇正相关(P＜0.05),与高密度脂蛋白负相关(P＜0.01). 结论 LR第+3057位核苷酸基因多态性可能通过影响机体局部体脂分布和脂质代谢、调节胰岛素敏感性等参与2型糖尿病的发生.
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DYS385检测方法的改进
目的建立检测DYS385的新方法.方法比较基因数据库(GDB)中推荐的引物和Schneider所设计的引物扩增DYS385的效果;在此基础上,以GDB推荐的引物作为外引物,Schneider所设计的引物作为内引物,通过调整内、外引物的浓度,优化扩增条件,建立DYS385的半巢式PCR体系.结果与常规方法相比,采用Schneider所设计的引物扩增DYS385,扩增片段缩短112bp,电泳分离的效果好,灵敏度提高2倍,达500pg;建立的半巢式扩增方法,能特异性扩增短片段,灵敏度提高20倍,达50pg.结论建立的DYS385半巢式扩增方法具有更高的特异性和灵敏度,适合法医学应用.
