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染色体R显带分析、双色荧光原位杂交及实时荧光定量PCR对于急性早幼粒细胞性白血病诊断价值的评价
目的:评价染色体R显带技术(RT)、双色荧光原位杂交(D-FISH)和荧光定量PCR (RT-PCR)对急性早幼粒细胞白血病(APL)的诊断价值.方法:采用三种方法分析340例疑诊为APL患者的细胞遗传学特征或PML/RARa融合基因,以MICM综合诊断作为APL的诊断“标准”,并与三者联合检测比较,评价RT、D-FISH和RT-PCR三者的诊断价值.结果:对于APL的诊断,RT、D-FISH以及RT-PCR三者的敏感度分别为81.3％ (78/96),95.0％ (91/96)和96.9％ (93/96),RT漏检18例,D-FISH的检测结果判断5例假阳性,2例假阴性,RT-PCR的检测结果存在4例假阳性,3例假阴性.三者联合检测的敏感度为99.97％,特异度为100％.结论:三种检测方法单独应用于APL的诊断均存在一定的弊端,三者联合运用有利于提高临床诊断率,同时减少误诊率和漏诊率.
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骨髓涂片双色荧光原位杂交检测急性早幼粒细胞白血病的PML/RARα基因重排
为了探讨双色荧光原位杂交(D-FISH)技术在骨髓涂片(BMS)上检测PML/RARα基因重排对急性早幼粒细胞白血病(APL)的诊断价值,采用光谱绿(Spectrum Green)和光谱桔红(Spectrum Orange)分别标记PML和RARα两种基因探针对27例临床拟诊为APL的患者进行BMS-D-FISH检测,并与常规细胞遗传学(CCG)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测结果作比较.结果表明:18例初诊患者中,CCG检出t(15;17)者14例,他们的BMS-D-FISH和RT-PCR均证实有PML/RARα基因重排,从而肯定了对APL的诊断;而CCG未检见t(15;17)易位的4例中有1例显示阳性的BMS-D-FISH和RT-PCR结果,证实该例有隐匿易位存在,其余3例的两种检测均是阴性,因而他们被重新诊断为AML而不是APL;9例缓解患者中,CCG查出1例部分缓解患者有t(15;17)易位,其BMS-D-FISH和RT-PCR均为阳性,而8例完全缓解患者(6例伴正常核型,2例未作CCG检测)的BMS-D-FISH和RT-PCR检测显示6例阴性,2例阳性,提示该2例患者有微小残留病(MRD)存在.结论:BMS-D-FISH是检测APLPML/RARa基因重排的敏感可靠方法,有助于APL确诊及其MRD检测,适合于CCG检测失败、伴有隐匿易位、RT-PCR检测缺乏材料以及需作回顾性研究者.
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双色荧光原位杂交用于慢性粒细胞白血病干扰素治疗效果的监测
为了探讨双色荧光原位杂交(D-FISH)方法对CML病人干扰素治疗后疗效监测的意义,本研究采用D-FISH方法对慢性粒细胞白血病(CML)病人应用干扰素治疗前后骨髓间期核细胞进行bcr/abl融合基因的检测,并与RT-PCR方法检测bcr/abl mRNA及传统细胞遗传学方法检测Ph染色体的结果进行比较.结果显示,22例CML病人D-FISH bcr/abl融合基因在干扰素治疗前均为阳性,其平均检出率在干扰素治疗前后分别为96.4%和58.6%,其中2例治疗前Ph染色体阴性病人,D-FISH bcr/abl融合基因在干扰素治疗前后平均检出率分别为94.0%和70.1%.D-FISH方法检测的22例病人中,4例为部分反应,4例为微小反应,其余14例为无反应.与传统的细胞遗传学方法相比较具有良好的相关性.结论:D-FISH方法直接检测CML病人间期核细胞的bcr/abl融合基因,克服了传统的细胞遗传学只能进行分裂中期核细胞分析及RT-PCR方法不能定量检测的不足,为CML干扰素治疗后克隆缓解程度的评定提供了更方便、可靠的方法.
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胃癌中Her-2/neu过表达与基因扩增及其意义
Her-2/neu基因编码的相对分子质量185 000的蛋白质(P185)能加速细胞运动,促进癌细胞转移.已证实有Her-2/neu基因扩增的乳腺癌患者(约占乳腺癌患者25%)手术后易复发,生存期短并对常用的化疗药物如环磷酰胺、5-氟尿嘧啶等不敏感[1,2].本项研究的目的是通过双色荧光原位杂交(dual color fluorescence in situ hybridization,FISH)技术和免疫组织化学技术检测各类型胃癌细胞中Her-2/neu基因数量及蛋白表达并探讨其临床意义.
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用FISH法检测肺癌印片标本中性染色体数目的异常(简报)
遗传物质的不稳定性是人类恶性肿瘤的特征之一,它既可表现在核苷酸水平上微卫星序列的不稳定,也可表现在染色体水平上的数目和结构异常.研究表明,在人类各种肿瘤中均有相关染色体数目的变化(增多或减少),其中包括性染色体数目的改变,据报道在非何杰金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、前列腺癌、卵巢颗粒细胞瘤、直肠癌等肿瘤中都有性染色体数目异常的现象,说明性染色体数目的异常在人类许多肿瘤中是一种较常见的现象.然而在肺癌中尚未见有类似的报道,本工作采用本室建立的双色荧光原位杂交(FISH)技术检测16例肺癌印片标本中X染色体和Y染色体数目的变化.
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提高乳腺癌HER2-双色荧光原位杂交检测质量的探讨
化学治疗是乳腺癌术后重要的治疗方法之一,乳腺癌患者肿瘤HER2扩增对以注射用曲舀珠单抗(赫赛汀)为基础化学治疗的敏感性好,因此,HER2水平的检测对乳腺癌治疗具有重要的指导性意义,不准确的结果会造成不正确的治疗方案,导致患者遭受不必要的化学治疗或者使患者丧失有效的治疗良机.由于乳腺癌HER2-双色荧光原位杂交(FISH)检测存在很多步骤和环节,制作一张高质量的HER2-FISH切片并不是一件容易的事.笔者根据多年的实践经验,总结一些体会,现介绍如下.
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人精子间期核的双色荧光原位杂交
目的建立人精子间期核双色荧光原位杂交(dud-color fluorescence in situhybridization,D-FISH)的实验方法.方法采用双色荧光原位杂交技术对12例正常精子标本进行间期核的原位杂交,并统计精子间期核X、Y染色体的杂交信号颗粒数量.结果在显微镜下可见精子头部有以Bioton标记的pBamX7探针显示1个绿色杂交信号为X染色体精子(X精子),以Digoxigenin标记的pY3.4探针显示1个红色杂交信号为Y染色体精子(Y精子);精子头部有2个荧光杂交信号的精子为染色体数目异常精子(如XX、XY、YY精子);间期核背景经DAPI复染显示蓝色;统计12例正常精子标本总共4800个精子间期核,X精子杂交信号阳性率为48.56%,Y精子杂交信号阳性率为49.73%,总共统计24000个精子,3种双体总杂交率为0.197%.结论本法具有荧光杂交信号直观易分辨、短时间内能大量分析精子数量和实验操作相对简便、结果准确可信等优点.
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介绍一种应用双色荧光复位杂交检测人精子染色体数目异常的技术
研究人类精子染色体常用的方法有两种,一种是用人类精子体外穿透金黄地鼠卵[1],这个方法虽然可以观察到精子的全部染色体组成,但由于这个方法操作复杂,十分耗时,且只适合于可以穿透金黄地鼠卵的精子,因而在临床上受到很大限制,推广起来也很困难.
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用双色荧光原位杂交技术检测罗伯逊易位携带者的精子染色体
目的: 探讨用双色荧光原位杂交技术(D-FISH)检测罗伯逊易位携带者的精子染色体的实验方法和应用价值. 方法: 采用荧光原位杂交(FISH)技术,以Biotin标记的13q14.3特异性探针和以Digoxigenin标记的14q11.1特异性探针对2例罗伯逊易位携带者精子标本进行原位杂交,并统计精子间期核13、14号染色体的杂交信号颗粒数量. 结果: 在显微镜下可见精子头部有以Biotin标记的13q14.3特异性探针显示1个绿色杂交信号,以Digoxigenin标记的14q11.1特异性探针显示1个红色杂交信号,间期核背景经DAPI复染显示蓝色;共统计3 000个精子间期核,显示1个绿色1个红色杂交信号的精子为13q/14q,占39.33%;显示1个绿色2个红色杂交信号为13q/14q,14q, 占11.57%;仅显示1个绿色杂交信号为13q/-,占9.27%;显示2个绿色1个红色杂交信号为13q,13q/14q,占12.87%;仅显示1个红色杂交信号为-/14q,占9.87%;显示2个绿色2个红色杂交信号为13q,13q/14q,14q,占12.26%. 结论: 用双色荧光原位杂交技术检测染色体结构异常患者的精子,可以分析其减数分裂过程中染色体分离规律,在人类生殖如显微授精和植入前胚胎遗传学诊断等方面具有非常广泛的应用价值.
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双色FISH检测未培养羊水及培养的外周血染色体标本方法的研究
目的探讨双色荧光原位杂交(dual-color fluorescence in situhybridization,D-FISH)技术在未培养羊水及培养的外周血染色体标本检测方法及实用意义.方法选择18号染色体计数探针,红色标记;21号染色体特异位点探针,绿色标记的双色探针对30例未培养羊水细胞;5例正常者及5例先天愚型患儿外周血培养标本进行D-FISH检测.结果成功的23例羊水标本,出现2绿、2红双色杂交信号率90.91%.改进后双色杂交成功率100%(23/23).5例染色体正常者,4例21三体及1例18三体在间期细胞及染色体上均出现2绿、2红;3绿、2红;3红、2绿杂交信号率分别为94.6%、93.25%、92%.与羊水及外周血培养分析结果一致.结论D-FISH技术不仅能检测培养的外周血标本,对未培养羊水细胞也是一种快速、简便、直观、成功率高的方法,在唐氏筛查中有较好的应用前景.
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双色荧光原位杂交检测苯系物接触者精子7、8号染色体数目畸变
目的检测苯系物接触者精子7、8号染色体数目畸变率.方法用生物素标记7号染色体探针(D7Z1)和地高辛标记8号染色体探针(D8Z1)与精子核进行双色荧光原位杂交,测定精子染色体畸变率.结果车间空气中苯的时间加权浓度为42.29 mg/m3,高于国家卫生标准(6 mg/m3).苯系物接触者尿粘康酸浓度(0.861 mg/g肌酐),高于对照组(0.444 mg/g肌酐).杂交效率99.77%～99.97%,共计数15例苯系物接触者155 721条精子核和12名对照组者123 771条精子核型.接触组二倍体精子率,平均7、8号染色体双体精子率 (分别为0.129%、0.170%和0.078%)均高于对照组(分别为0.055%、0.053%、0.033%).接触组7号、8号染色体缺体精子率(分别为0.165%和0.088%),也分别高于对照组(0.056%、0.029%).总数目畸变精子率接触组为0.745%,高于对照组的0.289%.结论较高浓度的苯系物暴露可引起接触者精子7、8号染色体非整倍体率和二倍体精子率增高.
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伴t(1;7)易位骨髓增生异常综合征的双色荧光原位杂交研究
目的通过对5例伴有t(1;7)易位的骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)患者进行研究,并进一步确定易位染色体着丝粒的组成和来源.方法采用骨髓细胞直接法或短期培养法制备染色体,应用R显带技术进行核型分析.应用荧光素SpectrumRed标记的1号染色体着丝粒特异性α卫星DNA探针和荧光素SpectrumGreen标记的7号染色体着丝粒特异性α卫星DNA探针,对其中3例患者进行双色荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)研究.结果 5例患者均有t(1;7)易位.双色FISH显示其中3例患者t(1;7)易位所致衍生染色体的着丝粒均由红绿两个信号融合而成.结论双色FISH证实MDS患者t(1;7)易位染色体着丝粒由1号和7号染色体着丝粒共同组成.
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慢粒患者经格列卫治疗后细胞遗传学改变:标准Ph易位t(9;22)(q34;q11)变为变异Ph易位t(21;22)(p11;q11)
目的 通过对慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者经格列卫药物治疗后细胞遗传学改变的研究,探讨ABL-BCR的表达缺失与获得性格列卫耐药的关系.方法 应用R显带技术对染色体进行核型分析,并选用BCR/ABL探针,通过双色荧光原位杂交技术进一步确认遗传学分析.结果 患者经格列卫治疗后染色体核型由t(9;22)(q34;q11)变为t(21;22)(p11;q11).双色荧光原位杂交证实此患者核型应为46,XY,t(9;22;21)(q34;q11;p11).结论 变异Ph易位中ABL-BCR的表达缺失与获得性格列卫耐药有关,荧光原位杂交技术在检测变异易位中起重要作用.
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一例环状X染色体嵌合体Turner综合征的双色荧光原位杂交
目的 通过对1例环状X染色体嵌合体的细胞遗传学分析,探讨环状X染色体形成的原因,临床表现与染色体核型的关系.方法 应用染色体G显带技术对环状染色体进行识别,并选用DXZ1和DYZ3探针,通过双色荧光原位杂交技术进一步确认环状染色体来源.结果 患儿染色体核型为45, X[83]/46, X ,r(X) (p22.1q22)[16]/47, X, 2r(X;X) (p22.1q22; p22.1q22)[1].双色荧光原位杂交示ish (DYZ3-) r(x)(DXZ1+).结论 具X染色体大环的染色体核型非常罕见,Turner 综合征患者的临床表型和染色体核型存在依赖性,对于青春前期身材矮小的女性患儿应高度警惕X染色体的异常.
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应用双色荧光原位杂交技术对转基因小鼠进行整合位点的染色体定位
目的 建立一种高度灵敏、特异的双色荧光原位杂交(dual-color fluorescence in situ hybridization,D-FISH)技术,对两种双阳性转基因小鼠外源基因进行整合位点的染色体定位.方法 对一只整合单纯疱疹病毒胸苷嘧啶激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-tk)/增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,eGFP)的转基因小鼠以及两只整合RNA干扰载体(RNA interference,RNAi)的β654地中海贫血模型小鼠进行实验,脾脏细胞经培养后获得中期分裂相标本片,各加入适量生物素、地高辛标记探针混合液杂交,分别用罗丹明红色荧光抗体及FFIE绿色荧光抗体进行D-FISH检测.结果 两种转基因小鼠均能在同一个分裂相上同时检测到双色荧光信号.其中,HSV-tk/eGFP双阳性小鼠的分裂相上出现较强的绿色HSV-tk信号和红色eGFP信号,分别定位于染色体2E5-G3及8A2-A4;β654/RNAi双阳性小鼠检测到红色β654荧光信号及绿色RNAi荧光信号.经定位分析,β654均整合在染色体7D3-E2,RNAi病毒载体则是随机整合,其中一只鼠主要整合在1281位点,而另一只鼠主要整合在染色体1E2.3-1F、3A3两个位点.结论 用自行制备的DNA探针建立了高度灵敏、特异的D-FISH技术,同时结合G显带对双阳性转基因小鼠进行染色体基因定位.该技术平台的建立对于转基因动物和基因治疗动物模型的研究具有非常重要的意义.
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用双色荧光原位杂交检测人精子染色体非整倍体率
目的 检测人精子染色体非整倍体率.方法 采用双色荧光原位杂交(FISH)方法,取少量精标本经洗后制片,用二硫苏糖醇(DTT)和二碘水杨酸锂(LIS)处理,使精子头部染色质去凝集.然后,与生物素标记的α卫星X染色体特异DNA探针(DXZ1)和地高辛标记的α卫星Y染色体特异DNA探针(DYZ3)进行原位杂交.用CY3-链亲和素、山羊抗链亲和素检测X染色体探针杂交信号;用鼠抗地高辛抗体、与荧光素结合的兔抗鼠抗体检测Y染色体探针杂交信号.结果 在Nikon荧光显微镜下可以清楚看到精子头部的杂交信号,头部有1个红色荧光杂交信号的精子为X染色体精子(X精子),有1个绿色荧光杂交信号的精子为Y染色体精子(Y精子).精子头部有2个荧光杂交信号的精子为染色体数目异常精子.若用1条常染色体探针和1条性染色体探针进行FISH,可以区别头部有2个相同颜色荧光杂交信号的精子属非整倍体精子或二倍体精子.结论 双色荧光原位杂交(FISH)方法,可以用于测定接触致突变剂和非整倍体诱导剂后,人精子染色体非整倍体率的变化.
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外周血双色荧光原位杂交方法监测慢性粒细胞性白血病患者干扰素治疗前后bcr／abl融合基因的变化
目的：研究外周血双色荧光原住杂交(D-FISH)在慢性粒细胞性白血病(CML)患者干扰素治疗效果监测方面的应用价值。方法：用D-FISH方法对18例CML患者干扰素治疗前后的外周血36份样本进行bcr／abl融合基因检测，并且与骨髓D-FISH方法检测的结果进行比较。结果：治疗后外周血间期核细胞中bcr／abl融合基因的检出率较治疗前有所下降，并且外周血中的检出率比同一患者骨髓中的检出率要低。结论：D-FISH方法可以简便、灵敏、可靠地对CML患者干扰素治疗前后的外周血进行疗效监测，使得从取材上更加方便。
关键词： 双色荧光原位杂交 慢性粒细胞性白血病 Bcr/abl融合基因
