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RYBP基因沉默对HL-60细胞对化疗药物敏感性的影响
目的:用RNA干扰技术探讨白血病HL-60细胞株RYBP基因沉默后对化疗药物敏感性的影响.方法:构建针对RYBP基因的shRNA干扰质粒并建立稳定沉默RYBP基因的白血病HL-60细胞株,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测确认RYBP基因在mRNA和蛋白水平的沉默效果.然后用DNA ladder及Annexin V标记的流式细胞术检测各组HL-60细胞凋亡的情况,用CCK-8法检测各组HL-60细胞对化疗药物阿糖胞苷和柔红霉素的敏感性.结果:成功构建的RYBP shRNA慢病毒载体能够有效沉默HL-60中RYBP基因的表达.在没有加入化疗药物时RYBP shRNA组凋亡率低于空载体对照组(NC组)(P＜0.05);用阿糖胞苷处理时RYBP shRNA组凋亡率和抑制率均低于NC组(P＜0.05);用柔红霉素处理时RYBP shRNA组凋亡率虽然低于NC组,但是抑制率差异不明显.结论:HL-60细胞RYBP基因沉默能抑制细胞的凋亡,明显降低对阿糖胞苷的敏感性,但是对柔红霉素敏感性的改变不明显.
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RYBP基因稳定沉默的HL-60细胞系的构建
目的 利用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术,建立RYBP基因稳定沉默的HL-60细胞系.方法 设计针对RYBP基因的5条短发夹状RNA( shRNA)序列,构建RYBPshRNA慢病毒重组载体,分别包装成慢病毒颗粒,直接感染HL-60细胞,同时设空载体和阴性对照shRNA慢病毒对照组.通过观察绿色荧光蛋白表达以监测感染效率,经嘌呤霉素(终质量浓度8 μg/ml)筛选出稳定感染细胞.Western blot实验初步鉴定出蛋白水平低的RYBPshRNA组,用实时定量聚合酶链反应(PCR)进一步检测该组细胞mRNA表达水平.结果 慢病毒感染的HL-60细胞经嘌呤霉素筛选成功,与对照组比较,5条RYBP shRNA组细胞RYBP表达均有不同程度减低(P＜0.01),其中以shRNA2沉默效果佳,且shRNA2组的RYBP基因mRNA水平降低了95％以上(P＜0.05).结论 慢病毒介导的shRNA2能高效、稳定地沉默RYBP基因的表达,成功构建了RYBP基因稳定沉默的HL-60细胞系.
