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用荧光原位杂交技术检测hEPO转基因山羊染色体上外源基因的整合状况
目的对采用受精卵显微注射方法获得的3头hEPO转基因山羊进行检测和整合状况分析.方法用荧光原位杂交的方法,以正常羊及正常人染色体标本为对照,通过生物素标记的探针与转基因羊染色体标本进行杂交.结果经信号放大及DAPI染色后,3头转基因羊分别在不同染色体上各有一对明显的荧光信号,而对照组无信号.结论hEPO基因在转基因山羊染色体上的整合是单位点整合,分别整合在不同的染色体上.
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人促红细胞生成素基因修饰人羊膜间充质干细胞蛛网膜下腔移植对脑损伤的影响
背景：有研究表明促红细胞生成素是一种调节骨髓造血功能的糖蛋白，不仅具有调节中枢神经系统发育作用，还可以营养神经及保护神经，但实验结果证实促红细胞生成素基因修饰人羊膜间充质干细胞移植成为治疗脑损伤的新途径。
目的：观察促红细胞生成素修饰的人羊膜间充质干细胞蛛网膜下腔移植对脑损伤大鼠神经损伤后功能恢复的影响。
方法：体外培养人羊膜间充质干细胞，构建真核表达质粒 pcDNA3.1促红细胞生成素，并转染入人羊膜间充质干细胞。用Western blot检测人羊膜间充质干细胞在转染前后人促红细胞生成素蛋白的表达。构建大脑中动脉闭塞模型大鼠，用促红细胞生成素修饰的人羊膜间充质干细胞尾静脉移植，并设模型组和人羊膜间充质干细胞组作对比。
结果与结论：①转染结果鉴定：Western blot结果显示，转染人促红细胞生成素基因的人羊膜间充质干细胞体外能表达人促红细胞生成素；②行为学变化、生长相关蛋白43及水通道蛋白9表达：神经功能评分，RT-PCR和Western blot检测结果显示，人促红细胞生成素基因+人羊膜间充质干细胞组改良的神经功能缺损评分、脑组织生长相关蛋白43及水通道蛋白9基因及蛋白的表达明显小于其他2组(P<0.05)；③细胞存活情况：人促红细胞生成素+人羊膜间充质干细胞组 CM-Dil 的阳性细胞数多(P <0.05)，人羊膜间充质干细胞组次之(P<0.05)，脑损伤组少(P<0.05)。④结果证实，促红细胞生成素基因修饰人羊膜间充质干细胞移植可降低脑损伤区周围生长相关蛋白43及水通道蛋白9基因及蛋白的表达，抑制神经细胞的凋亡，促进神经功能恢复。 -
密码替换后人促红素基因在大肠杆菌中的高效表达及工程菌的发酵
目的研究人工合成的hEPO基因在大肠杆菌中高效表达及工程菌高密度发酵条件.方法将hEPO基因中大部分大肠杆菌稀有密码子替换成使用频率较高的密码子,人工合成hEPO全基因,然后将其插入表达载体PBV220中,转化大肠杆菌DH5α,挑选构建正确的PBV220-hEPO/DH5α菌落,经升温诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物;观察改变培养基、培养时间、pH及溶氧量等条件对表达产物的影响.结果经酶切分析,DNA测序鉴定,人工合成的hEPO基因已正确构建到表达载体中.通过高密度发酵培养,终菌体密度达A500=30(相当于菌体35g/L),hEPO表达量达30%左右.结论人工合成的hEPO基因在大肠杆菌中得到高效表达,并确定了该工程菌高密度发酵的适宜条件.
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人促红细胞生成素在CHO细胞上的表达
为了获得人促红细胞生成素(EPO)的高效表达,以EPO gDNA 为基础构建了两个真核表达载体pDE、pCE,将它们分别经脂质体转染CHO-dhfr-细胞,其48h瞬时表达量分别为27.5ng/ml与88.90ng/ml.然后用氨甲喋呤(MTX)对转染细胞进行加压并挑选细胞克隆,共获得3株高效表达EPO的工程细胞株A,B,C,其中A来自质粒pCE,B和C来自pDE,在2×10-6mol/L的MTX的压力下,它们48h的高表达水平分别为A:8.7μg/ml,B:10.76μg/ml,C:16.44μg/ml.经网织红细胞法测得它们均具有体内生物活性.
关键词： 人促红细胞生成素 真核表达 CHO-dhfr-细胞 -
不同剂量rhEPO静注治疗早产儿脑损伤对比观察
目的：比较不同剂量重组人促红细胞生成素( rhEPO)静注治疗早产儿脑损伤的效果。方法157例脑损伤早产儿随机分为A组38例、B组40例、C组36例、D组43例,各组均采用常规治疗,A、B、C组在此基础上分别静注1000、750、500 U/kg的rhEPO。采用ELISA法检测血清IL-6、中枢神经特异性蛋白B( S100B)、人促红细胞生成素( EPO),于纠正胎龄40周时行新生儿行为神经测定( NBNA),采用婴幼儿智能发育量表评估纠正胎龄3、6、9个月智力发育指数( MDI)及运动发育指数( PDI),采用常规检测方法检测治疗前后血常规、肝肾功能指标。结果与同组治疗前及D组比较,A组和B组血清IL-6、S100B水平降低,A、B、C组血清EPO水平升高；与C组比较,A组和B组血清IL-6、S100B水平降低,EPO水平升高；与B组比较,A组血清EPO水平升高；P均<0.05。与C、D组比较,A组和B组NBNA评分及3、6、9个月MDI、PDI增加；与B组比较,A组6个月MDI及6、9个月PDI增加；P均<0.05。各组血常规、肝功能指标组内及组间较,P均>0.05。结论 rhEPO静注治疗早产儿脑损伤效果较好,且以1000 U/kg rhEPO效果佳。
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人EPO基因重组腺病毒载体的构建及表达
目的:制备表达人促红细胞生成素基因(hEPO)的重组腺病毒.方法:将hEPO基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带hEPO基因的重组腺病毒载体.获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞,包装、扩增出重组腺病毒,氯化铯梯度离心法进行纯化,PCR和电镜负染鉴定重组腺病毒,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并检测重组腺病毒的滴度.继而用纯化的重组腺病毒感染HeLa细胞,测定转染效率,以Western blot检测hEPO蛋白的表达.结果:成功构建了携带hEPO基因的重组腺病毒载体pAd-hEPO,PCR、透射电镜和绿色荧光鉴定证实病毒包装成功,并且具有感染力,病毒的滴度可达1.8 × 10~(10) pfu/mL.Western blot检测表明RAd-hEPO感染的HeLa细胞中hEPO基因能够有效表达.结论:制备的BAd-hEPO可成功表达hEPO基因,为后续开展BAd-hEPO治疗缺血性心脏病的研究奠定基础.
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人促红细胞生成素对大鼠急性创面转化生长因子β1/Smad3信号转导通路的影响
目的 探究人促红细胞生成素(hEPO)对大鼠急性创面愈合相关转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad3信号转导通路的影响. 方法 选取72只健康SD大鼠,在大鼠背部制成直径约2.5 cm的圆形急性创面,按随机数字表法将大鼠分为生理盐水对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组18只.4组大鼠每日常规清创后,生理盐水对照组大鼠创面予1 mL生理盐水浸润的纱布外敷,低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠创面每天分别予1 mL 50、100、150 U的hEPO浸润的纱布湿敷,再用6层干纱布包扎固定,每天换药1次.治疗3、7、14 d每组取6只大鼠行大体观察并计算创面愈合率,处死后取创面组织采用免疫组织化学法观察CD31和TGF-β1的表达,蛋白质印迹法检测3只大鼠磷酸化Smad3蛋白的表达.对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验、Bonferroni校正. 结果 (1)治疗3d,4组大鼠创面均有明显的渗出并有结痂.治疗7d,低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠创面均较生理盐水对照组明显缩小.治疗14 d,4组大鼠创面均全部愈合.治疗7d,与生理盐水对照组相比,中剂量组、高剂量组大鼠创面愈合率明显增加(P＜0.01);余时间点,各组大鼠创面愈合率相近(P＞0.05).(2)CD31主要定位在血管上.除低剂量组治疗3、7 d(P＞0.05)外,低剂量组大鼠治疗14 d和中剂量组、高剂量组大鼠治疗3～14d创面组织中CD31表达均明显高于生理盐水对照组(P＜0.01);除治疗3 d(P ＞0.05)外,中剂量组和高剂量组大鼠治疗7、14 d创面组织中CD31表达均明显高于低剂量组(P＜0.01);除治疗3 d(P＞0.05)外,高剂量组大鼠治疗7、14 d创面组织中CD31表达明显高于中剂量组(P＜0.01).(3)除低剂量组治疗3 d(1.9±0.7,P ＞0.05)外,低剂量组大鼠治疗7、14 d(3.3±1.0、3.7±0.7)和中剂量组、高剂量组大鼠治疗3～14d创面组织中TGF-β1表达(3.3±1.0、3.6±1.0、3.9±0.9,3.4±0.7、3.8±0.8、4.2±0.4)均明显高于生理盐水对照组(1.7±0.5、2.7±1.0、3.0±0.9,P＜0.01);除治疗7d(P＞0.05)外,中剂量组和高剂量组大鼠治疗3、14 d创面组织中TGF-β1表达均明显高于低剂量组(P＜0.01);除治疗14 d(P＜0.01)外,高剂量组大鼠治疗3、7d创面组织中TGF-β1表达与中剂量组相近(P＞0.05).(4)除低剂量组治疗3、14 d及中剂量组和高剂量组治疗14 d(P＞0.05)外,3组大鼠余时间点创面组织中磷酸化Smad3蛋白表达明显高于生理盐水对照组(P＜0.01);除治疗14 d(P＞0.05)外,中剂量组和高剂量组大鼠治疗3、7d创面组织中磷酸化Smad3蛋白表达明显高于低剂量组(P＜0.01);除治疗14 d(P ＞0.05)外,高剂量组大鼠治疗3、7d创面组织中磷酸化Smad3蛋白表达明显低于中剂量组(P＜0.01). 结论 外源性hEPO可提高大鼠急性创面CD31、TGF-β1、磷酸化Smad3的表达,促进创面血管新生,激活TGF-β1/Smad3信号转导通路促进创面愈合.
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构建人促红细胞生成素干扰载体
目的 利用干扰RNA技术,构建人促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)新靶点的干扰RNA真核表达载体,沉默转染该载体的胶质瘤细胞中的人促红细胞生成素基因,为EPO在肿瘤、新生儿缺氧、贫血等疾病中的作用机理奠定实验基础.方法 构建EPO干扰RNA的真核表达载体后,用碱基序列测定和双酶切测定,在U251细胞中转染EPO干扰RNA的真核表达载体,查看荧光蛋白表达量.结果 成功构建了新靶点的EPO干扰RNA真核表达载体即PEPO,而且成功转染U251细胞.结论 本实验构建了新靶点EPO干扰RNA真核表达载体.
