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再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞转化生长因子β1及Smad3表达下调的发病学意义
目的 研究骨髓间充质干细胞(MSC)中转化生长因子β1(TGF-β1)与Smad3的表达下调与再生障碍性贫血(再障)发生的可能关系.方法 取20例重型再障患者骨髓MSC,分离制备出Flk1+CD34-MSC后进行以下试验:①体外定向诱导MSC向脂肪细胞分化,倒置显微镜观察成脂分化情况,油红O染色法鉴定脂肪细胞,用实时荧光定量PCR检测分化过程中脂蛋白酯酶(LPL)基因的表达;②用蛋白质印迹法检测MSC中TGF-β1及Smad3的表达,用ELISA检测MSC分泌TGF-β1的能力;③观察不同剂量(0、5、10、15、20 ng/ml)TGF-β1对再障患者骨髓MSC成脂分化和增殖的影响.以7名健康成人的骨髓MSC相应检测为对照.结果 再障患者骨髓MSC经4 d培养后即分化为脂肪细胞,而健康成人骨髓MSC中仅见少量细胞出现脂肪滴.再障患者MSC培养4和8 d时LPL基因表达水平分别为0.091±0.028、0.142±0.033,均高于健康成人骨髓MSC(分别为0.021±0.011及0.049±0.010,均P＜0.01);而TGF-β1及Smad3表达水平明显低于健康成人骨髓MSC,TGF-β1分泌水平(3.4 μg/L±0.9 μg/L)也明显低于健康成人骨髓MSC(11.6 μg/L±1.2 μg/L,P＜0.01).在向脂肪细胞分化过程中,仅加入5 ng/ml的TGF-β1即可明显抑制再障患者骨髓MSC向脂肪细胞定向诱导分化,同时促进其增殖.结论 再障患者骨髓MSC中TGF-β1及Smad3表达水平的显著下调可能参与了再障的部分发病环节.
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血清素促进成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白的合成
目的探讨血清素对成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白合成的影响。方法用不同浓度（50、100、200和400 ng／L）的血清素处理人成骨细胞，即时定量PCR（ RT-PCR）观察成骨细胞中Ⅰ型胶原蛋白和赖氨酰氧化酶（ LOX）含量的变化。用LOX siRNA干扰LOX蛋白的表达后，用Western blot法检测干扰效果，用酶联免疫吸附实验检测Ⅰ型胶原蛋白含量的变化。用RT-PCR检测血清素处理成骨细胞后Smad2蛋白、Smad3蛋白表达量的变化和Smad3基因敲除对LOX蛋白表达的影响。结果血清素上调成骨细胞中Ⅰ型胶原蛋白和LOX的表达水平，LOX siRNA可显著抑制Ⅰ型胶原蛋白的表达。此外，血清素上调了成骨细胞中Smad2蛋白和Smad3蛋白的表达，干扰Smad3基因的转录，抑制LOX蛋白的表达。结论血清素通过Smad信号通路上调LOX的表达，并促进成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白的合成。
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依那普利、缬沙坦对实验性大鼠肝纤维化的影响
目的：通过依那普利、缬沙坦对肝纤维化大鼠转化生长因子β1（TGFβ1）/Smad3及结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响，探讨两药物对肝纤维化的治疗作用。方法制备四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠模型，60 d造模成功后分别给予依那普利、缬沙坦灌胃15 d。对各组大鼠肝组织进行HE及Masson染色，Western blotting检测TGFβ1/Smad3、CTGF蛋白表达，Real-time PCR检测TGFβ1/Smad3及CTGF mRNA表达。结果依那普利、缬沙坦可明显减轻大鼠肝组织纤维化程度，TGFβ1/Smad3、CTGF蛋白（0.51±0.10、0.49±0.11 vs.0.60±0.09；0.72±0.09、0.69±0.07 vs.0.98±0.13；0.51±0.05、0.47±0.13 vs.0.61±0.05，P均＜0.05）及mRNA（2.77±0.83、2.97±0.48 vs.4.07±0.97；4.15±0.98、4.17±0.98 vs.6.06±0.85；5.82±1.21、5.34±1.24 vs.7.63±1.25，P均＜0.05）表达较模型组降低。结论依那普利、缬沙坦对大鼠肝纤维化具有抑制作用，为探索新的治疗药物提供了实验依据。
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硫氧还蛋白通过Smad3/AP-1通路抑制人血管内皮细胞黏附蛋白的表达
目的 研究硫氧还蛋白(Trx)在动脉粥样硬化中对血管内皮细胞保护作用的分子机制. 方法 应用腺病毒感染的方法在原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中建立过表达硫氧还蛋白及其对照的细胞模型.以致动脉粥样硬化重要危险因子氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)为刺激剂.应用免疫印迹及间接免疫荧光法检测Trx,黏附分子(ICAM-1,VCAM-1)及其上游信号分子(Smad3,AP-1)的蛋白表达及细胞定位.应用胰岛素还原法检测Trx的活性,应用荧光探针DCFHDA进行细胞内活性氧检测. 结果 和对照组相比过表达Trx组Trx表达量明显提高,活性检测显示Ad-Trx的活性上调率为(26.2±3.3)％,细胞内活性氧(ROS)检测提示过表达Trx显著抑制细胞内ROS的产生.和对照组相比在基础及氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激下过表达Trx组明显下调了内皮细胞黏附分子的表达(P＜0.05),显著提高了内皮细胞中Smad3的磷酸化(P＜0.05).而应用Smad3磷酸化特异性的抑制剂SIS3预处理细胞反转了Trx对黏附蛋白的抑制作用.SIS3预处理细胞进一步上调了oxLDL刺激下AP-1亚基c-Fos的核蛋白表达. 结论 Trx抑制内皮细胞黏附分子表达的作用可能是通过上调Smad3蛋白的磷酸化及抑制核转录因子AP-1亚基c-Fos的核表达来调节的.
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转化生长因子β/Smad信号传导系统在子宫内膜异位症盆腔粘连患者腹膜中的表达及其意义
目的 探讨转化生长因子(TGF)β/Smad信号传导系统在子宫内膜异位症(内异症)盆腔粘连患者腹膜中的表达变化及其意义.方法 选择2009年12月至2010年3月就诊于北京协和医院、由同一妇科医师行腹腔镜手术的育龄妇女20例,其中内异症患者11例[内异症组,其中3例曾经接受过促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)治疗],非内异症且无盆腔粘连的卵巢良性肿瘤患者9例为对照组.术中留取患者侧盆壁、远离病灶、肉眼观察形态基本正常的腹膜组织.应用HE染色、Masson染色法观察两组患者腹膜显微结构;应用免疫组化、实时定量(RT) PCR技术检测TGF-β1、3和Smad 3、7在两组患者腹膜中的表达情况;分析GnRH-a对TGF-β1、3和Smad 3、7蛋白表达的影响.结果 (1)腹膜显微结构:与对照组比较,内异症组患者腹膜间皮细胞核增大、细胞下结缔组织层明显增厚、纤维分布紊乱、成纤维细胞及炎性细胞数量明显增多;(2) TGF-β1、3表达水平:内异症组患者腹膜TGF-β1、3的表达水平分别为0.170±0.020、0.110±0.010,高于对照组的0.070±0.010、0.050±0.020;GnRH-a下调TGF-β1表达水平(0.130±o.030),而上调TGF-β3表达水平(0.490 ±0.090);(3) Smad 3、7表达水平:内异症组患者腹膜Smad 3、7的表达水平分别为0.140±0.020、0.110±0.020,高于对照组的0.024±0.004和0.014±0.007;GnRH-a显著升高Smad 7(o.040±0.020)水平,但调节Smad 3水平的效果不明显.结论 内异症患者腹膜显微结构发生了改变,腹膜TGF-β、Smad蛋白及基因表达水平升高,GnRH-a能够调节TGF-β、Smad蛋白表达.
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2型糖尿病肾病患者尿中smad3蛋白的水平变化和意义
目的 探讨2型糖尿病患者尿中smad3蛋白水平变化在糖尿病肾病(DN)中的意义及其与DN进展的相关性.方法 选取上海交通大学附属第六人民医院内分泌代谢科2010年5月至2011年8月收治的282例2型糖尿病患者和100名健康对照者,并根据尿标本白蛋白与肌酐比率(UACR),将患者分为正常白蛋白尿组(NA组)110例、微量白蛋白尿组(MA组)114例、大量白蛋白尿组即DN组58例.采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测尿中smad3水平.同时测定人体参数及相关生化指标包括年龄、血压、体质指数(BMI)、血糖、血脂、尿白蛋白/肌酐(UACR)、肾小球滤过率估计值(eGFR)、糖化血红蛋白等,糖尿病视网膜病变(DR)根据免散瞳眼底照相结果进行评估,将58例DN患者分为不伴DR组(25例)和伴DR组(33例).结果 (1)2型糖尿病组尿smad3的水平显著高于对照组[489 (273,1193)比311(179,497) ng/mmol Cr,P＜0.01].(2)按照UACR将2型糖尿病组再分为3组比较尿smad3水平,MA组与NA组相比、DN组与NA组相比、DN组与MA组相比,差异均有统计学意义[552(316,1338)比317(200,594)、1035(503,3035)比317(200,594)、1035(503,3035)比552(316,1338),均P＜0.01].(3) Pearson相关分析表明尿smad3水平与年龄、收缩压、糖化血红蛋白、尿素氮、肌酐、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、eGFR及UACR显著相关,多元回归分析发现UACR是尿smad3的独立决定因子(β=0.754,P＜0.01).(4) DN合并DR组尿smad3水平显著高于未合并DR组[1905(806,4303)比595(331,1183),P＜0.01]；DN合并DR组UACR水平与未合并DR组相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 2型DN患者尿中smad3水平显著增加,并与ACR显著相关,提示尿smad3有可能作为诊断DN的一个标志物,并可预测DN的严重程度.
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TGF-β、Smad信号通路蛋白及α-SMA在糖尿病肾病患者肾组织中的表达和意义
目的：检测转化生长因子（TGF）-β、Smad信号通路蛋白和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在糖尿病肾病（DN）患者肾活检组织中的表达，探讨DN的发病机制。方法收集DN肾组织标本28例（DN组）；非DM行肾切除的正常肾组织10例为对照组。应用免疫组化方法检测TGF-β1、TGF-β受体（R）Ⅰ、TGF-βRⅡ、Smad2/3、α-SMA在肾组织中的表达。结果（1）TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2/3在DN组和对照组中均有表达，前者高于后者， DN组早期光镜下肾组织未见明显异常时即有明显的高表达，而随着疾病的进展未见表达增高的现象。肾小球、肾小管出现纤维化后并不表达上述因子。（2）对照组的α-SMA仅表达于肾血管、肾小球和肾小管，而肾间质未见α-SMA表达，而DN组α-SMA在上述组织中均有表达。结论 TGF-β及Smad信号转导通路参与了DN的发病，DN可能与免疫复合物性肾小球肾炎具有相似的发病机制。
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肺组织Akt1和Smad3在大鼠肝肺综合征形成中的作用
目的 探讨肺组织丝氨酸苏氨酸蛋白激酶-1(Akt1)、Smad3在大鼠肝肺综合征形成中的作用.方法 健康雄性SD大鼠72只,3～4月龄,体重200～ 250 g,采用随机数字表法,将其分为3组(n=24):正常对照组(C组)、假手术组(S组)、胆总管结扎组(CBDL组).S组打开腹腔暴露胆总管后关腹,CBDL组结扎并剪断胆总管后关腹.于术后第1、3和5周(T13)时,随机取8只大鼠,抽取腹主动脉血样后处死取肺脏.腹主动脉血样行血气分析,用RT-PCR法和Western blot法检测肺组织Akt1、Smad3的mRNA及蛋白表达水平；肺组织切片HE染色后观察肺组织微血管的病理学结果.结果 与C组和S组比较,CBDL组T2.3时肺组织Akt1、Smad3的mRNA及其蛋白表达上调,T3时肺泡-动脉血氧分压差增大(P＜0.05).CBDL组T3时肺组织微血管明显扩张.结论 大鼠肺组织Akt1、Smad3表达上调参与了肝肺综合征的形成.
关键词： 肝肺综合征 肺 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶 Smad3蛋白质 -
靶向大鼠Smad3基因的siRNA筛选及其shRNA重组慢病毒的构建
目的 设计并筛选针对大鼠Smad3基因的siRNA,构建靶向Smad3基因的shRNA重组慢病毒.方法 针对大鼠Smad3基因设计并合成6对siRNA(siRNA001～006)及1对无关对照siRNA,转染大鼠肝细胞株BRL-3A,应用Western Blot检测各siRNA对SMAD3蛋白表达的抑制作用,挑选抑制效率高的siRNA.依据所得的序列合成并克隆到pLL3.7载体中,与包装质粒pRSVrev、pMDLg-pRRE和VSV-G共转染293FT细胞获得靶向Smad3的慢病毒.通过流式细胞仪绿色荧光蛋白(GFP)荧光计数来检测病毒滴度.结果 Western Blot检测证实siRNA001、siRNA005、siRNA006对SMAD3蛋白表达的抑制作用明显,抑制率分别可达83.36%、86.99%及64.88%.而对照siRNA无明显作用.酶切和测序结果显示Smad3 shRNA及对照shRNA重组载体质粒pLL3.7shRNA构建成功.将构建的质粒进行慢病毒包装可产生有感染活性的慢病毒颗粒.结论 筛选出针对大鼠Smad3基因有明显抑制作用的3对siRNA,并成功构建表达相应shRNA的4种重组慢病毒,为研究调控Smad3的表达对肝再生或肝纤维化的影响提供了实验条件.
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姜黄素对大鼠肠纤维化的作用及其机制研究
目的 探讨姜黄素在三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠结肠纤维化中的抗纤维化作用和机制.方法 SD大鼠40只随机分组,模型组(10只)、治疗组(10只)和对照组(10只)分别于第1、8、15、22和29天予TNBS 10 mg、15 mg、20 mg、25 mg和30 mg灌肠,另取10只大鼠给予50%乙醇灌肠,作为阴性对照(正常组).从实验周期第1天起,治疗组大鼠每日予姜黄素30 mg/kg腹腔注射,对照组每日予0.9%NaCl腹腔注射,模型组和正常组不予处理.采用HE染色及Masson胶原三色染色观察大鼠结肠组织损伤和纤维化变化,采用ELISA法检测结肠黏膜中Th1/Th2型细胞因子IL-2、TNF-α、IL-4、IL-17的含量,采用荧光定量PCR法检测结肠黏膜中肠纤维化相关细胞因子如转化生长因子(TGF)-β1、结缔组织生长因子(CTGF)、Smad3、胶原Ⅰ、ⅢmRNA的表达.结果 模型组与对照组大鼠结肠组织大体损伤评分[(6.14±1.07)分,(6.17±1.47)分]及组织损伤评分[(8.42±1.40)分,(8.17±1.47)分]、胶原面积比(36.59%±4.07%,37.18%±4.05%)较正常组[分别为(2.13±0.64)分,(2.25±1.28)分和25.43%±5.39%]明显升高(均P＜0.05).模型组与对照组大鼠黏膜组织中IL-2[(378.25±29.90)ng/L,(410.06±64.74)ng/L]、TNF-α[(87.11±23.85)ng/L,(100.41±12.59)ng/L)]、IL-17[(47.80±5.62)ng/L,(41.45±2.12)ng/L]含量及TGF-β1(4.71%±2.71%,4.12%±3.01%)、CTGF(10.33%±6.99%,11.46%±4.72%)、Smad3(9.35%±7.32%,10.11%±3.80%)、胶原Ⅰ(1.52%±1.11%,1.57%±1.35%)、胶原Ⅲ(3.04%±1.33%,3.03%±3.53%)mRNA表达量较正常组[分别为(179.74±20.73)ng/L,(35.47±7.13)ng/L,(14.48±7.52)ng/L和0.90%±1.13%,0.53%±0.47%,0.62%±0.44%,0.16%±0.09%,0.18%±0.10%]均明显升高(均P＜0.05).而治疗组大鼠结肠组织大体损伤评分[(4.00±1.07)分]及组织损伤评分[(5.13±1.46)分]、胶原面积比(30.01%±7.56%),IL-2[(223.91±28.04)ng/L]、TNF-α[(44.19±4.77)ng/L]、IL-17[(14.89±4.31)ng/L]含量和TGF-β1(0.85%±0.76%)、CTGF(1.56%±1.13%)、Smad3(3.62%±3.03%)、胶原Ⅰ(0.40%±0.31%)、胶原Ⅲ(0.60%±1.02%)mRNA表达量较模型组及对照组明显降低(P＜0.05),与正常组无明显差异(P＞0.05).结论 姜黄素可通过降低细胞因子的过度表达,减轻大鼠结肠炎症,从而抑制过度"损伤-修复"所致的组织纤维化.
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光动力疗法对增生性瘢痕成纤维细胞中Smad3蛋白磷酸化的影响
目的 探讨增生性瘢痕成纤维细胞(HSF)经过光敏剂血卟啉单甲醚(HMME)诱导,Smad3蛋白在光动力疗法(PDT)中的磷酸化效应.方法 将原代培养的HSF分为对照组、PDT组、单纯光敏剂(PS)组和单纯(Laser)激光照射组,经Smad3-FITC染色后在荧光显微镜上观察各组细胞内Smad3的荧光强度；收集各组细胞经Western印迹法检测Smad3和磷酸化Smad3蛋白的含量.结果 在荧光显微镜下观察到各组总体荧光强度相近,但与对照组核内荧光聚集较明显相比,PDT组HSF核内荧光微弱；HSF中磷酸化Smad3蛋白经PDT治疗后含量降低,与对照组相比,二者差异有统计学意义(0.92±0.15比0.20±0.02,P＜0.05),PS组和Laser组中磷酸化Smad3蛋白表达,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 PDT能够降低Smad3蛋白磷酸化水平,从而抑制HSF增殖.
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Evi-1基因的生物学作用及致肿瘤机制研究进展
逆转录病毒结合位点-1(Evi-1)基因是首先在小鼠粒细胞白血病发现的逆转录病毒结合位点.在恶性血液系统病变及其他实体肿瘤中高表达,致肿瘤机制主要为通过抑制Smads而抑制转化生长因子-β (TGF-β)信号途径,调节细胞周期,促进血管生成,抑制c-Jun氮末端激酶(JNK)及激活转录因子激活蛋白-1(AP-1)等.
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Lefty蛋白拮抗人肾小管上皮细胞凋亡的研究
目的 探讨Lefty蛋白对转化生长因子β1(TGF-β1)介导的人肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡的影响.方法 采用脂质体将人Lefty质粒转染入离体培养的HK-2细胞,使其稳定表达Lefty蛋白.对正常对照组(A组)和Lefty转染组(B组)细胞给予10 ng/ml TGF-β1刺激后,采用Westernblot法检测各组细胞第6、12、24、48小时磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)表达水平,并同时采用流式细胞术检测各组细胞凋亡程度.结果 TGF-β1刺激后,A组p-Smad2/3表达水平和细胞凋亡程度较刺激前升高(P<0.05),而B组上述指标均低于A组(P<0.05).结论 Lefty蛋白可拮抗TGF-β1/Smad信号转导通路,减轻TGF-β1介导的人肾小管上皮细胞凋亡.
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Smad7,Smad3和Smad2在DEHP诱导的尿道下裂大鼠阴茎中的表达
目的 研究Smads(7,3和2)在邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate, (DEHP)]诱导的尿道下裂大鼠阴茎组织中的表达变化,探讨尿道下裂发生机制. 方法 将SD孕鼠随机分为2组:实验组(将DEHP溶于1.5 mL大豆油中灌胃大鼠)和对照组(以1.5 mL大豆油灌胃大鼠),每组20只,自孕12 d(gestation day,GD12)至19 d(GD19)连续每天定时给药1次.至GD20行剖宫产取出雄性胎鼠,切取阴茎组织,采用实时定量PCR 和免疫组化法分别检测胎鼠阴茎中Smad7, Smad3和Smad2三者mRNA和蛋白质表达水平. 结果 经qPCR检测分析后发现,Samd7,Smad3和Smad2三者mRNA在正常对照组相对于内参GAPDH的表达分别是1.00,0.84和1.14,在DEHP暴露组其相对表达分别是1.87,1.36和1.49,且三者在实验组的表达与正常对照组比较,均升高(P值分别为<0.001,0.041和0.021);观察实验组Smad7和p-Smad2/3蛋白表达水平亦有增加趋势. 结论DEHP诱导的先天性尿道下裂可能与胎鼠阴茎组织中Smads(7,3和2)的过度表达有关.
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GSK3β促进TGF-β1诱导的肾小管上皮HK-2细胞纤维化
目的 阐明GSKββ对于肾脏小管间质纤维化的作用.方法 以TGF-β1诱导的体外肾小管间质纤维化模型为研究对象,以GSK3β特异抑制剂LiCl处理细胞和不同GSK3β表达质粒(野生型GSK3β表达质粒GSK3β-WT;第9位点上丝氨酸突变为丙氨酸,由此不能再被磷酸化失活而具有固有活性的GSK3β突变质粒GSK3 β-S9A;第85、86位点上赖氨酸突变为丙氨酸、失去激酶活性的GSK3β突变质粒GSK3β-KD)转染细胞,观察肾脏纤维化的标志性分子纤维连接素蛋白(fibronectin,FN)表达水平的改变,以及对TGF- β/Smad信号通路的作用.结果 LiCl增加HK-2细胞GSK3β的磷酸化,抑制GSK3β的活性,同时降低了细胞基础水平和TGF-β1诱导的FN表达.过表达的GSK3β-WT增强TGF-β1诱导的FN表达,而这种效应在GSK3β-S9A转染细胞更为显著.过表达GSK3β-KD抑制TGF-β1诱导的FN表达.分析对TGF-β/Smad信号通路的作用,LiCl可以抑制TGF-β1诱导的Smad3磷酸化,而对Smad2磷酸化水平无影响.同时,LiCl也不改变Smad3的总蛋白表达.结论 GSK3β通过TGF-β1/Smad3信号通路促HK-2细胞纤维化,抑制GSK3β可以抗纤维化.
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荔枝核总黄酮对肝纤维化大鼠TGF-β1及Smad3、7表达的影响
目的 探讨荔枝核总黄酮(TFL)对胆汁性肝纤维化大鼠肝组织转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad3、7表达的影响及其抗肝纤维化可能的作用机制.方法 将雄性SD大鼠70只随机分为假手术组、模型组、TFL大剂量组[200 mg/(kg·d)]和TFL小剂量组[100 mg/(kg·d)].采用胆总管结扎制备肝纤维化大鼠模型.分别于术后第2、3、4周处死大鼠,留取肝脏组织.HE染色观察大鼠肝组织病理改变;免疫组织化学法检测TGF-β1、Smad3、7在肝组织内的动态表达.结果 假手术组肝组织内TGF-β1、Smad3有少量表达,Smad7呈高表达.与模型组比较,TFL大剂量治疗后大鼠肝组织内纤维化程度降低.随着肝纤维化的形成和发展,第2、3、4周TFL大剂量组大鼠肝组织TGF-β1(3.000±1.309、2.000±1.309、1.800±1.649)、Smad3(2.875±1.458、2.000±1.309、1.833±0.753)与模型组TGF-β1(3.750±1.488、4.333±1.211、5.000±0.817)、Smad3(3.375±0.916、4.000±0.894、4.250±0.500)比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TFL能有效地减轻胆总管结扎所致肝纤维化大鼠肝损伤及肝纤维化程度,其机制可能与抑制TGF-β1、Smad3高表达,上调Smad7表达有关.
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MicroRNA-21在单侧输尿管梗阻大鼠间质纤维化肾脏组织中的表达及意义?
目的：观察 MicroRNA-21(miRNA-21)在单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾脏组织中的表达,初步探讨其在转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad3致大鼠肾间质纤维化(RIF)信号通路中的机制。方法选择20只 SD 雄性大鼠,分为 UUO 组和假手术组(Sham 组),分别于建模后第3天、第7天各采集每组5只大鼠肾脏组织,应用实时荧光定量 PCR(Real-time qPCR)方法检测肾脏组织中 miRNA-21的表达变化,采用 Masson 染色、苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学技术评价肾组织纤维化,使用免疫组织化学检测肾脏组织中 TGF-β1、Smad3、Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达情况。结果建模后第3天和第7天 UUO 组肾脏组织中 miRNA-21与 Sham 组比较均升高(P <0.01),7 d UUO 组肾组织中 miRNA-21与3 d UUO 组相比升高(P <0.01)。建模后3、7 d UUO 组 Masson 染色纤维化评分、TGF-β1、Samd3、α-SMA 及 Col-Ⅰ蛋白阳性表达面积较 Sham 组升高(P <0.01),以上指标7 d UUO 组较3 d UUO 组比较表达增强(P <0.01)。UUO 组肾组织中 miRNA-21的表达与肾间质纤维化评分正相关(r=0.888,P <0.01)；肾组织 miRNA-21与 TGF-β1、Smad3、Col-Ⅰ、α-SMA 蛋白表达呈正相关(r =0.799、0.849、0.882、0.896,P <0.01)。结论UUO 大鼠肾组织中 miRNA-21在建模后表达上调,且间质纤维化程度越重表达越高,TGF-β1/Smad3信号通路可能是通过上调 miRNA-21从而介导大鼠肾间质纤维化。
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人促红细胞生成素对大鼠急性创面转化生长因子β1/Smad3信号转导通路的影响
目的 探究人促红细胞生成素(hEPO)对大鼠急性创面愈合相关转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad3信号转导通路的影响. 方法 选取72只健康SD大鼠,在大鼠背部制成直径约2.5 cm的圆形急性创面,按随机数字表法将大鼠分为生理盐水对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组18只.4组大鼠每日常规清创后,生理盐水对照组大鼠创面予1 mL生理盐水浸润的纱布外敷,低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠创面每天分别予1 mL 50、100、150 U的hEPO浸润的纱布湿敷,再用6层干纱布包扎固定,每天换药1次.治疗3、7、14 d每组取6只大鼠行大体观察并计算创面愈合率,处死后取创面组织采用免疫组织化学法观察CD31和TGF-β1的表达,蛋白质印迹法检测3只大鼠磷酸化Smad3蛋白的表达.对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验、Bonferroni校正. 结果 (1)治疗3d,4组大鼠创面均有明显的渗出并有结痂.治疗7d,低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠创面均较生理盐水对照组明显缩小.治疗14 d,4组大鼠创面均全部愈合.治疗7d,与生理盐水对照组相比,中剂量组、高剂量组大鼠创面愈合率明显增加(P＜0.01);余时间点,各组大鼠创面愈合率相近(P＞0.05).(2)CD31主要定位在血管上.除低剂量组治疗3、7 d(P＞0.05)外,低剂量组大鼠治疗14 d和中剂量组、高剂量组大鼠治疗3～14d创面组织中CD31表达均明显高于生理盐水对照组(P＜0.01);除治疗3 d(P ＞0.05)外,中剂量组和高剂量组大鼠治疗7、14 d创面组织中CD31表达均明显高于低剂量组(P＜0.01);除治疗3 d(P＞0.05)外,高剂量组大鼠治疗7、14 d创面组织中CD31表达明显高于中剂量组(P＜0.01).(3)除低剂量组治疗3 d(1.9±0.7,P ＞0.05)外,低剂量组大鼠治疗7、14 d(3.3±1.0、3.7±0.7)和中剂量组、高剂量组大鼠治疗3～14d创面组织中TGF-β1表达(3.3±1.0、3.6±1.0、3.9±0.9,3.4±0.7、3.8±0.8、4.2±0.4)均明显高于生理盐水对照组(1.7±0.5、2.7±1.0、3.0±0.9,P＜0.01);除治疗7d(P＞0.05)外,中剂量组和高剂量组大鼠治疗3、14 d创面组织中TGF-β1表达均明显高于低剂量组(P＜0.01);除治疗14 d(P＜0.01)外,高剂量组大鼠治疗3、7d创面组织中TGF-β1表达与中剂量组相近(P＞0.05).(4)除低剂量组治疗3、14 d及中剂量组和高剂量组治疗14 d(P＞0.05)外,3组大鼠余时间点创面组织中磷酸化Smad3蛋白表达明显高于生理盐水对照组(P＜0.01);除治疗14 d(P＞0.05)外,中剂量组和高剂量组大鼠治疗3、7d创面组织中磷酸化Smad3蛋白表达明显高于低剂量组(P＜0.01);除治疗14 d(P ＞0.05)外,高剂量组大鼠治疗3、7d创面组织中磷酸化Smad3蛋白表达明显低于中剂量组(P＜0.01). 结论 外源性hEPO可提高大鼠急性创面CD31、TGF-β1、磷酸化Smad3的表达,促进创面血管新生,激活TGF-β1/Smad3信号转导通路促进创面愈合.
