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人C组轮状病毒VP8*蛋白与组织血型抗原的结合特征
目的 研究人C组轮状病毒SZ272 VP8*蛋白与组织血型抗原的结合特征.方法 利用原核表达系统表达并纯化人C组轮状病毒SZ272的VP8*蛋白,通过唾液结合实验分析SZ272 GST-VP8*融合蛋白与A、AB、B、O和O-(非分泌)型唾液的相互作用;通过寡糖结合实验分析SZ272 GST-VP8*融合蛋白与不同的组织血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)寡糖的结合情况.结果 电泳结果显示,有GST-VP8*融合蛋白目的条带,约为52×103 Da,与预期大小相符.唾液结合实验显示,SZ272 GST-VP8*融合蛋白与A和AB型唾液结合,而与B、O及非分泌(O-)型唾液不结合;寡糖结合实验显示,SZ272 GST-VP8*融合蛋白特异性地与A型HBGAs相结合.结论 A型组织血型抗原可能是人C组轮状病毒的潜在受体,为进一步研究C组轮状病毒的感染机制提供了基础和依据.
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河南省哨点医院5岁以下儿童腹泻病例A组轮状病毒感染状况、临床特征及病原学研究
目的：分析2008—2015年河南省哨点医院5岁以下（1~59月龄）腹泻儿童A组轮状病毒的感染情况及临床和基因型别变迁特征。方法以2008—2015年河南省郑州市和开封市两家儿童医院内5岁以下（1~59月龄）住院腹泻儿童为研究对象。并于研究对象发病3 d或入院24 h内采集其粪便样本(每份3~5 ml)，共收集2541份，同时收集患者流行病学信息（月龄、性别等人口学信息及临床症状）。采用双抗体夹心ELISA法检测A组轮状病毒，阳性样本抽提病毒RNA，采用巢式多重RT-PCR进行G/P基因分型。采用χ2检验比较不同特征患者感染情况。结果2541份样本共检出A组轮状病毒785份，阳性率为30.9%。2008—2015年每年的10月份阳性率均较高，平均阳性率为54.8%（345/629）；每年的7月份阳性率均较低，平均阳性率为5.0%（5/101）。男童A组轮状病毒感染率为30.6%（451/1476），低于女童[31.4%（334/1065）]（χ2=0.18，P=0.664）；感染者主要为4~12月龄患者（61.3%，481/785），各月龄儿童感染率差异有统计学意义（χ2=196.69，P<0.001）；城市儿童阳性率为26.0%（258/992），低于农村[34.0%（527/1549）]（χ2=18.19，P<0.001）。785株A组轮状病毒G分型以G1、G2、G3、G9为主，分别占13.5%（106）、11.1%（87）、29.7%（233）、57.5%（451）；P分型以P[4]、P[8]为主，分别占11.3%（89）、84.7%（665）；型别组合以G9P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G1P[8]为主，分别占52.9%（415）、9.7%（76）、17.3%（136）、11.3%（89）；G1[8]、G3P[8]逐年递减，G9P[8]逐年递增，已成为河南省A组轮状病毒优势型别。从临床体征看，594例（75.7%）阳性病例体温为<37℃，135例（17.2%）体温为37.0~37.5℃，16例（2.0%）体温为37.6~38.0℃，40例（5.1%）体温为>38℃；166例（21.1%）腹泻次数为0~3次，515例（65.6%）为4~6次，63例（8.0%）为7~9次，41例（5.2%）为10~15次；682例（86.9%）未发生呕吐，92例（11.8%）发生1~2次呕吐，47例（6.0%）发生3次呕吐，3例（0.4%）发生4次及以上呕吐；682例（86.9%）未发生脱水现象，95例（12.1%）发生1%~5%的轻度脱水现象，8例（1.0%）发生5%以上的中重度脱水现象。结论河南省哨点医院5岁以下（1~59月龄）腹泻儿童A组轮状病毒感染率较高；在秋季和春季时儿童感染率较高，且存在混合感染病例；病原体可分为多种基因型别，G9P[8]为主要优势型别；大部分感染病例无发热、呕吐、脱水症状，出现发热、腹泻、呕吐、脱水等临床症状的病例多以轻症为主。
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轮状病毒SA11衣壳蛋白VP7的毕赤酵母重组表达及IgY的制备
目的 真核重组表达轮状病毒(rotavirus,RV)SA11株VP7衣壳蛋白并制备、纯化其卵黄抗体(IgY).方法 将SA11标准株在MAl04细胞中增殖,收集病毒液.从病毒液中提取RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增获得SA11株衣壳蛋白VP7的长度为978 bp的编码基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体上,进行测序.将重组体哑克隆到分泌表达载体pPICZαB中,再将重组体转化人大肠杆菌Top10中,用BstXI线性化酶切重组质粒后电转入毕赤酵母X-33中,进行测序.转染成功的菌落再用甲醇诱导表达,亲和层析法纯化重组蛋白抗原,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blotting)鉴定,用重组蛋白免疫罗曼母鸡,收集鸡蛋,Western blotting鉴定、纯化IsY.结果 细胞增殖液中提取的RNA银染可见11个条带,成功构建了含pPICZαB-SA11 VP7的毕赤酵母X-33,毕赤酵母X-33分泌的融合蛋白被收集、纯化.毕赤酵母X-33表达的SA11 VP7的衣壳蛋白经Western blotting验证与预测蛋白相对分子质量40 200相符.从鸡蛋中提取的鸡的IgY验证为抗VP7的抗体.纯度可达到95%,1个鸡蛋能产10.2 mg的IgY.结论 抗重组RV SA11衣壳蛋白VP7和IgY的成功制备为疫苗和诊断试剂的开发奠定了基础.
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2013-2014年湖北省哨点医院A组轮状病毒G和P基因型遗传变异分析
人轮状病毒是引起婴幼儿腹泻常见的病原体之一，轮状病毒广泛分布于世界各地。人轮状病毒分A、B、C三组，其中A群组轮状病毒（rotavirus A，RVA）是引起婴幼儿腹泻主要的病原体，严重影响儿童的健康[1]。轮状病毒于1973年由澳大利亚学者R.F. Bishop发现，归类为呼肠孤病毒科轮状病毒属(rotavirus，RV)[1-2]。其基因组由11个片段组成的双链RNA，分别编码6个结构蛋白(VP1~VP4，VP6， VP7)和5个非结构蛋白(NSP1~NSP5)。按照衣壳蛋白VP6的抗原特异性不同，可将RV分为A、B、C、D、E、F、G等7个组。与人类关系密切的是A组RV，其中VP4和VP7是重要的外壳蛋白，根据VP4和VP7的差异可将A组RV分为P型和G型。目前已发现27个P型和19个G型，常见的型别为G1～G4和P4和P8，而常见G、P组合为G1P[8]， G2P[4]，G3P[8]，G4P[8]和G9P[8][2]。本研究采用2013—2014年间湖北省襄阳、恩施腹泻监测哨点医院收集的腹泻粪便标本进行轮状病毒核酸检测和G、P分型，并分析该地区RV感染的流行病学特点。
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增强型绿色荧光蛋白基因与轮状病毒VP6基因融合表达载体的构建及表达
目的 构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与轮状病毒(RV)VP6基因融合表达载体,研究融合蛋白表达及在细胞中的分布.方法 提取A组人RV TB-Chen株VP6基因,用PCR扩增VP6编码cDNA片段.将此基因片段与真核表达载体pEGFP-C1携带的EGFP融合;运用脂质体的方法,将获得的重组质粒转染到MA104细胞中,在荧光显微镜下观察蛋白的表达及其在细胞中的分布情况.结果 成功构建了融合表达质粒；转染细胞后,融合蛋白可在MA104细胞中表达且主要分布在胞质中.结论 RV VP6可与EGFP融合表达,融合蛋白在细胞质中呈均匀的分布,与RV感染细胞中合成的VP6蛋白的分布有较大的差别.
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密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒G1VP7和G3VP7基因的表达量
目的 通过密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒G1VP7和G3VP7基因的表达量.方法 人工合成按照人的优势密码子优化的人轮状病毒G1VP7和G3VP7基因,包装重组腺病毒后,与未优化的相同基因的重组腺病毒用Western Blot方法比较其表达量.结果 密码子优化的人轮状病毒G1VP7和G3VP7基因,与未优化的相同基因的重组腺病毒比较,其蛋白表达量大大提高.结论 密码子优化确实提高了重组腺病毒中人轮状病毒G1VP7和G3VP7基因的表达量,可望满足腺病毒载体疫苗的研发需要.
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密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒VP6基因表达量的研究
目的 通过密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒VP6基因的表达量.方法 人工合成按照人的优势密码子优化的人轮状病毒VP6基因,包装重组腺病毒后,与未优化的相同基因的重组腺病毒用免疫荧光和Western Blot方法比较其表达量.结果 密码子优化的人轮状病毒VP6基因,与未优化的相同基因的重组腺病毒比较,其蛋白表达量大大提高.结论 密码子优化确实提高了重组腺病毒中人轮状病毒VP6基因的表达量,可望满足腺病毒载体疫苗的研发需要.
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2010-2012年北京地区儿童轮状病毒腹泻的流行病学研究
目的 调查北京友谊医院就诊儿童轮状病毒腹泻的流行状况.方法 收集北京友谊医院2010年1月至2012年1月底门诊及住院的腹泻患儿的粪便标本972例,采用胶体金免疫层析法快速检测A组RV抗原.结果 在972例中轮状病毒阳性者为370例,阳性检出率38.1％；男女比例为2.14∶1.2岁以下患儿占轮状病毒腹泻发病率的91.4％.该病高发病率主要集中在较寒冷的季节,即每年的10月至次年的3月,而且从11月到12月为高峰期,但全年各月均有发生,春夏季节的发病率在腹泻患儿中也占有相当的比例(11.1％至41.7％不等).结论 轮状病毒是北京地区婴幼儿感染性腹泻的主要病原体.由其引起的腹泻发病率在＜ 24月龄组的腹泻患儿中所占的比例大；且以秋冬季节为高发期.因此,即便在春夏季节也应加强对该病的监测与防治,以期在进入年底高发期时能降低其发病率,并为该病进一步的流行病学调查收集和提供更多的动态性资料.
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河北省卢龙地区猪与人G9型A组轮状病毒进化关系研究
目的 了解河北省卢龙地区猪与人G9型A组轮状病毒(GARV)主要基因的分子特征及进化关系.方法 选取1株2008年河北卢龙地区G9型GARV阳性的腹泻仔猪粪便标本LLP48及4株2009年至2011年卢龙地区G9型GARV阳性的5岁以下住院腹泻患儿粪便标本进行主要基因片段的扩增,测序后对获得的基因序列通过MEGA、DNAStar等生物软件进行序列比对、同源性分析和系统进化分析.结果 卢龙猪GARV LLP48与4株卢龙人GARV编码的VP7、VP6、NSP2和NSP4基因具有高度同源性,核苷酸和氨基酸同源性分别是89.4％～94％和94.8％ ～98.2％;VP4片段的核苷酸(氨基酸)同源性较低,为71.4％～71.6％(68.2％～69.0％).系统进化分析表明,LLP48编码的VP7、VP6、NSP2和NSP4基因与人来源的毒株关系密切,而VP4基因与猪来源的毒株关系密切.结论 卢龙猪GARV LLP48可能是猪的VP4与人的VP7、VP6、NSP2和NSP4自然重组.
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不同滴度轮状病毒对新生小鼠肝胆系统损伤的比较
目的 比较不同滴度轮状病毒(Rhesus rotavirus,RRV)对新生小鼠肝胆系统损伤的差异.方法 新生小鼠出生24 h内,腹腔注射恒河猴轮状病毒(MMU18006病毒株)建立肝胆损伤动物模型;将80只BALB/c新生小鼠随机分成4组,每组20只,实验组分别注射不同滴度轮状病毒悬液,依次为高滴度(1×107 PFU/ml)、中滴度(1×106 PFU/ml)、低滴度实验组(2.5×105 PFU/ml),正常对照组仅注射病毒培养液;观察小鼠体重、黄疸发生时间,于出生后第12天收取标本时,经小鼠胆囊行肝外胆道造影,镜下观察小鼠胆管情况,并收取血清和肝胆组织,分别进行肝功能检测和病理染色分析.结果 与正常小鼠相比,实验组小鼠均有不同程度的皮肤黄疸、体重增加缓慢、生存率下降、肝功能损伤.低滴度组表现较轻且皮肤黄疸、体重及肝功能可恢复正常;与低滴度组相比,高滴度组皮肤黄疸更明显,体重显著性降低且不可逆,生存率低(50％),肝功能指标TBIL、DBIL、TBA、ALT、ALP显著性升高.进一步胆道造影显示高滴度组闭锁率高(80％),低滴度组无闭锁.病理学分析显示高滴度组肝内胆管闭锁,汇管区大量炎症细胞浸润,而低滴度组肝内胆管形态正常,汇管区仅有少量炎症细胞浸润.结论 不同滴度轮状病毒对新生小鼠肝胆系统影响不同:高滴度易引起胆道闭锁,低滴度引起肝炎.
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轮状病毒G血清型和P基因型与腹泻严重程度的关系
目的 了解轮状病毒G血清型和P基因型与腹泻严重程度之间的关系.方法 收集2001年8月至2003年7月4个监测点医院5岁以下住院腹泻儿童的粪便标本和临床信息,对标本进行轮状病毒检测和分型,根据Vesikari 20点评分法对轮状病毒腹泻患儿的严重程度进行评分.结果 当与P[8]基因型结合时,P[8]G1型和P[8]G3型患儿的严重程度评分分别为13分和12分,腹泻天数分别为6 d和5 d,G1型患儿中发热的比例高于G3型(97%与73%),而且发热患儿的高体温G1型也高于G3型(39℃和38.6℃).当与G3血清型结合时,P[4]G3和P[8]G3型腹泻严重程度评分无统计学差异,但P[4]型比P[8]型的腹泻天数长(分别为6.5 d和5 d),而P[8]型呕吐的高次数比P[4]型多(分别为4次和3次).结论 当与P[8]型结合时,G1型腹泻比G3型腹泻严重.当与G3型结合时,P[4]和P[8]型腹泻严重程度评分无差异.
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一起由水污染引起的儿童及成人A组轮状病毒腹泻暴发
目的 确定2006年11月广西大新县大范围腹泻暴发性流行的病原及其分子生物学特点.方法进行流行病学个案调查和粪便标本的实验室检测,用ELISA试剂盒进行A组轮状病毒的检测,对检测阳性标本进行轮状病毒分型并对其中4份检测阳性轮状病毒的vfy7全基因扩增.结果 采集的64份腹泻患者粪便标本中共有30份检测为轮状病毒阳性,总阳性率为46.9%,此次暴发的流行病学和临床特征也符合轮状病毒腹泻特征,RT-PCR进行G/P分型显示为G1P[8]型轮状病毒,VP7氨基酸显示第68位氨基酸改变.结论 G1P[8]型A组轮状病毒是此次腹泻暴发的病原.值得注意的是,此次A组轮状病毒暴发累及儿童和成人.
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河北省卢龙地区2008-2009年度轮状病毒流行病学研究
目的 了解河北省轮状病毒腹泻的流行情况.方法 2008年9月至2009年8月收集卢龙县儿童医院及妇幼保健院5岁以下腹泻住院患儿标本共426份,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测轮状病毒抗原,阳性标本用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进行基因分型.结果 426份标本中轮状病毒检出率为47.42%(202/426).对202份轮状病毒阳性标本进行G/P分型,G3型是主要优势株,占57.9%(117/202),其次为混合G型感染(16.3%),G9型(14.9%),G1型(7.9%),G4型(1%),G2型(0.5%),P基因型常见的为P[8]占58.4%,其次为P型混合感染占28.7%,P[4](6.9%),P[9](1%),常见的G/P组合为G3P[8].结论 轮状病毒是卢龙地区儿童腹泻住院的主要病原,G3P[8]为主要流行株,混合型在该地区多发,且G9血清型在该地区已经成为仅次于G3的第二大优势株.
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河北卢龙地区猪C组轮状病毒流行状况和VP6基因多样性分析
目的 了解GCRV在我国卢龙地区猪中流行状况和VP6蛋白编码基因的多样性特点,为猪GCRV的深入研究提供依据.方法 采集2007年冬至2008年春河北卢龙地区腹泻和正常猪粪便标本共793份.采用巢式反转录-聚合酶链反应(Nested RT-PCR)的方法对GCRV进行检测,并对测定序列进行同源性和系统进化分析.结果 在793份粪便标本中,GCRV阳性率为16.65％,卢龙地区猪GCRV毒株间同源性差异较大.核苷酸进化树表明,猪GCRV多样性显著.由氨基酸进化分析可知,同一宿主的GCRV氨基酸序列亲缘关系更近.结论 2007-2008年冬春两季,C组轮状病毒在我国卢龙地区猪中感染率较高.VP6基因多样性广泛存在.实验提供的数据为进一步研究猪GCRV的分子流行特征提供了基础.
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A组轮状病毒广州地方株VP7基因序列的比较分析
目的了解我国轮状病毒G1型广州地方株与标准株及北京G1型地方株VP7基因序列的差异,为我国轮状病毒疫苗的研制提供资料.方法通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得了轮状病毒广州地方株R97-196 VP7全基因的cDNA片段,将其克隆入T-A克隆质粒pUCm-T中,构建成重组质粒pUCmT-VP7,对克隆的VP7基因进行序列测定.结果该地方株的基因核苷酸全长为1 062 nt,读码框架和以往的研究一致,和北京G1型地方株T73的VP7氨基酸序列具有高度同源性(98%),而与不同血清型标准株间则变异较大(73%～81%),氨基酸序列中存在的一些高变区和保守功能区与已报道的研究结果一致.从进化角度分析,与轮状病毒标准株Wa株,相距较远.结论轮状病毒广州地方株R97-196 VP7基因片段属G1型,轮状病毒VP7基因的变异与地域有一定关系.
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太原市5岁以下腹泻住院儿童的病毒病原及其流行特征
目的 了解山西省太原市5岁以下腹泻住院儿童四种主要腹泻病毒的流行情况.方法 收集山西儿童医院2007年10月至2008年11月5岁以下全部住院腹泻患儿的粪便标本,采用ELISA试剂盒来检测轮状病毒;采用聚合酶链反应(PCR)检测腺病毒;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测星状病毒和杯状病毒并对轮状病毒进行分型.结果 346份标本中轮状病毒占40.8%、杯状病毒占7.5%、星状病毒占6.4%、腺病毒占3.2%.对141份轮状病毒阳性标本进行G1P分型,G1型是优势株,P型优势株为P[8].四种病毒主要是感染2岁以下婴幼儿,RV有明显的季节的特征,9-11月份(48.92%)为发病高峰.结论 轮状病毒为主要的病毒病原,G1P[8]型为主要流行株,秋冬季为发病高峰,2岁以下为发病高危人群,混合感染多见.
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2013年11月北京丰台区轮状病毒腹泻流行的实验室分析
目的 了解2013年11月北京市丰台区腹泻中轮状病毒和诺如病毒发病率升高的流行情况及其基因特征 方法 2013年11月在哨点医院门诊随机采集47份腹泻患者便标本、30份环境标本,使用real-time RT-PCR进行轮状病毒(rotavirus)和诺如病毒(norovirus)的筛查;并对轮状病毒阳性标本使用RT-PCR方法扩增VP4和VP7基因,扩增产物进行序列测定.使用Blast、BioEdit及Mega4.0等软件进行序列比对及基因进化分析.结果 47份粪便标本中,37份为轮状病毒检出率为78.7％(37/470,诺如病毒阳性率为14.9％(7/47),轮状病毒和诺如病毒混合感染率为10.6％ (5/47);30份环境标本中,轮状病毒检出率为23.3％ (7/30),未检出诺如病毒.核酸序列比对及进化分析表明此次流行的轮状病毒为G9P[8]a型,与2010-2012年北京地区感染儿童的G9株高度同源.结论 2013年11月北京市丰台区其他感染性腹泻标本中以轮状病毒检出为主,其基因型别为G9P[8]a型,检出率远高于北京市往年水平,提示应加强对轮状病毒进行监测.
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2006-2007年我国五岁以下住院儿童轮状病毒流行病学研究
目的 了解我国五岁以下儿童以医院为基础的轮状病毒性腹泻的流行情况.方法 按照WHO轮状病毒胃肠炎监测标准,监测9家医院,收集从2006年1月至2007年12月五岁以下全部的住院腹泻儿童标本4047份,轮状病毒检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA),毒株分型采用RT-PCR方法.结果 共检测3862份标本,检出阳性标本1700份,轮状病毒感染阳性率44.0%.病毒性腹泻患儿发病呈现季节性分布,主要集中在秋冬季(10月份至1月份).轮状病毒感染95.4%发生在2岁前的婴幼儿.在12～17、9～11、18～23月年龄段为53.2%、50.2%、48.3%.轮状病毒流行株以P[8]G3为主,占58.4%,其次是P[8]G1,占22.0%,P[4]G1占3.0%,P[8]G9占2.4%,2例P[10]G2,1例P[10]G3,出现1例P[8]G5,没有检出G4血清型,世界各地常见的组合P[8]G1、P[4]G2、P[8]G3、P[8]G4占80.8%.结论 轮状病毒感染是引起婴幼儿腹泻主要原因之一,开发应用安全有效的轮状病毒疫苗对减轻轮状病毒疾病负担有重要作用.
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急性轮状病毒腹泻小儿单个核细胞Toll样受体的变化
目的 研究轮状病毒腹泻小儿单个核细胞Toll样受体的变化.方法 收集3岁以下因急性轮状病毒腹泻来复旦大学附属儿科医院就诊的小儿 75例,以荧光定量RT-PCR方法检测外周血单个核细胞TLR 2,3、4、7、8 mRNA的表达情况.结果 起病时间在3 d以内的小儿外周血单个核细胞中TLR 2、3、4、7、8 mRNA的表达水平都有明显升高,P均＜0.05.其中TLR 2、3、8 mRNA表达在发病7 d和14 d时仍高于对照组,P均＜0.05.TLR 4 mRNA的表达在病情较重的患儿比较轻的患儿高,P＜0.05.结论 多种TLR参与了轮状病毒引发的宿主免疫应答反应的启动和调节.
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以Ad41为载体的轮状病毒VP6基因重组腺病毒的遗传稳定性研究
目的 对前期制备的以Ad41为载体的可表达A组轮状病毒VP6基因的非复制型重组腺病毒进行连续传代,观察其遗传稳定性,为进一步研发疫苗做准备.方法 在293TE7细胞上,对本室前期构建的重组腺病毒rvAd41-VP6 (o)连续传代14代,每隔2代通过PCR鉴定VP6(o)基因的插入,通过Western Blot技术鉴定目的蛋白的表达.结果 PCR分析表明,rvAd41-VP6(o)在连续传代的过程中,其基因组中都有特异性的VP6基因稳定整合；Western Blot证实了rvAd41-VP6 (o)可稳定表达VP6,这说明rvAd41-VP6(o)有较好的遗传稳定性.结论 重组腺病毒rvAd41-VP6 (o)在体外具有良好的生物学性质,可用于下一步动物免疫研究.
