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乙型肝炎DNA疫苗系列质粒的构建及其在SP2/0细胞中的表达
近年来兴起的核酸疫苗对某些病毒感染同时具有预防和治疗作用。我们构建了一系列能表达乙型肝炎病毒大、中、小蛋白的疫苗质粒,并研究了其在SP2/0细胞中的表达情况。一、材料与方法1. S、MS、LS蛋白编码基因片段的获取:以含有adr亚型HBV全基因组pBHB4质粒为模板,用3对人工合成的引物SF/SR、S2F/SR、S1F/SR分别扩增编码小蛋白S(nt28-708)、中蛋白MS(nt3077-708)和大蛋白LS(nt2719-708)的DNA片段。引物SF、S2F和S1F分别互补于S、前S2和前S1基因起始区域,SR则互补于S基因相应的终止区。2. S1S重组基因片段的获取:采用重叠扩增PCR法对S1S2S基因进行剪切和重组,即获得不含S2的S1S重组基因片段。3. 重组质粒的构建及鉴定:将上述获得的S、S1S、S2S及S1S2S基因片段分别插入质粒pSG5UTPL/Flag载体的SV40启动子下游和质粒pRc/CMV载体的CMV启动子下游。将以上8个重组质粒转化大肠杆菌XL Blue 1,经菌落PCR鉴定技术筛选含相应插入片段的阳性克隆,然后抽提、扩增、纯化并酶切鉴定,以373A型核酸自动分析仪测定所插入片段的核酸序列。4. 重组质粒在SP2/0细胞中的表达:将纯化的质粒转染SP2/0细胞并筛选、建立长期转染细胞株。分别收集部分转染细胞,超声破碎后收集上清液,以Western-Blot检测相应蛋白质在SP2/0细胞中的表达情况。
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人β防御素-2与前列腺癌特异性膜抗原嵌合蛋白真核表达质粒构建及其诱导的小鼠特异性免疫应答
探索人β防御素2(hBD-2)和前列腺特异性膜抗原(PS-MA)共表达重组核酸疫苗对前列腺癌的免疫治疗.研究以pcDNA3.1为载体,构建重组质粒pcDNA3.1/PSMA和pcDNA3.1/hBD-2-PSMA,通过RT-PCR和免疫组化检测其表达.并免疫小鼠,进行血清中抗体检测,CD4+、CD8+T淋巴细胞数目测定及CTL特异性杀伤作用检测.结果显示构建的质粒转染COS-7细胞后能表达目的基因,免疫小鼠后能在体内持久表达,可以诱导产生特异性抗体,能有效的刺激T细胞增生,诱导特异性CTL反应.当以hBD-2作为免疫佐剂时,CTL活性增强.本研究成功的构建了含PSMA的表达质粒,免疫小鼠可以诱导出有效的体液和细胞免疫,为前列腺癌的免疫治疗奠定了一定的实验基础.
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疟疾DNA疫苗的研究进展
近年来,由于疟原虫及其媒蚊出现抗药性,疟疾重新泛滥,已证明蚊媒控制策略不能根除热带疟疾[1],抗疟形势面临严峻挑战,其防制策略必须转向个体防护研究.识别和分离疟原虫抗原的分子工具的发展,促使疟疾研究者们设法构建疫苗以抗疟感染,而DNA疫苗尤其是多基因DNA疫苗[2]是一种划时代新技术,被誉为第三次疫苗革命,已用于抵抗多种病原体研究[3].核酸疫苗(Nucleic acid vaccine)是从基因治疗研究领域发展起来的一种全新疫苗,包括所有DNA或RNA疫苗以及合成核酸疫苗,但目前主要以DNA疫苗为主,故又称DNA疫苗.它直接把带有目的抗原基因的重组质粒转染或注射入细胞内,使之在细胞中持续表达天然抗原,经加工处理,与主要组织相容性复合体(MHC)形成复合物,并提呈到细胞表面,诱导特异性细胞毒性T细胞(CTL)及体液免疫应答[4].自1992年首先描述疟疾DNA疫苗以来,发展很快,本文就此研究状况综述如下.
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脂质体载体法将外源性野生型p53转染SHG44细胞及验证
目的 验证脂质体法将wt-p53有效转染SHG44细胞. 方法 G418筛选,DNA分子班点杂交. 结果 用脂质体法将wt-p53质粒转染SHG44细胞,G418筛选,24 d形成新生细胞克隆,呈集落状;以wt-p53 cDNA为探针进行斑点杂交,放射自显影,wt-p53 pLXSN/SHG44细胞为阳性杂交信号,而亲代SHG44细胞及转染pLXSN的 SHG44细胞为阴性信号,说明wt-p53基因已成功地转导入SHG44细胞中. 结论 斑点分子杂交显示,基因转染成功,初步证实脂质体介导法能有效地将外源性p53基因转导入SHG44细胞.
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四环素调控HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶表达细胞系的建立
目的 建立双稳定表达HCV NS3/4A蛋白酶的HepG2细胞系.方法 将pTET-ON质粒转染HepG2细胞后用G418压力选择,利用Tet反应性质粒pTER21uc筛选高表达、低背景的TET-ON稳定转染的细胞.HindⅢ单切pMD18T-NS3/4A,平端化后再用BamHⅠ单切,然后与用BamHⅠ与EcoRⅤ双切的pTER2hyg质粒连接,转化菌株JM109感受态细胞,获得重组质粒pTER2hyg-NS3/4A,经PCR鉴定及序列测定.将pTER2hyg-NS3/4A用脂质体法转染TET-ON稳定转染HepG2细胞,经持续潮霉素压力选择和克隆化获稳定转染的细胞系,用实时荧光RT-PCR筛选出高水平表达NS3/4A的细胞株,并用Western blot验证.结果 成功建立了双稳定的可诱导表达NS3/4A蛋白酶的HepG2细胞株.结论 本研究构建的细胞株为建立以细胞为基础的抗HCV药物筛选系统提供了有效的筛选细胞系.
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反向遗传操作重拯甲型流行性感冒病毒A/PR/8/34(H1N1)
目的建立并完善流感病毒的反向遗传操作系统.方法将截断的人源RNA多聚酶Ⅰ的启动子与鼠源RNA多聚酶Ⅰ终止子序列嵌套在RNA多聚酶Ⅱ的启动子与终止序列之间,构建成质粒载体系统.将甲型流行性感冒病毒A/PR/8/34(H1N1)全基因组8个基因节段的互补DNA(cDNA)克隆入该系统,共转染共培养的293T(人胚肾细胞)和MDCK(狗肾传代细胞)细胞.利用细胞的酶系统重拯出具有感染活性的流感病毒颗粒.在MDCK细胞上滴定病毒滴度.结果构建了流感病毒的Pol Ⅰ-PolⅡ质粒系统.8个质粒介导的DNA转染系统在转染后30h上清经滴定病毒产量为8×10 3pfu/ml.结论完善了流感病毒的反向遗传操作系统.应用该系统在体外完全利用病毒的cDNA在无辅助病毒的情况下cDNA成功包装出具有感染活性的流感病毒.