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叶黄素对食管癌EC9706细胞增殖与分化的影响
叶黄素(lutein)是一种具有抗氧化作用的类胡萝卜素[1].流行病学、体外试验和动物试验研究表明,给予叶黄素可以预防动脉粥样硬化,其抗氧化性能可以抵御游离基在人体内造成的细胞与器官损伤,并可防止因机体衰老引发的心血管硬化、冠心病和肿瘤[2].
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小柴胡汤对人食管癌细胞株Eca-109增殖和凋亡的影响
目的 通过使用中药小柴胡汤作用于人食管癌细胞株Eca-109,研究其抗肿瘤的作用机制;方法 分别采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、Hoechst33342染色法以及流式细胞仪检测法,观察小柴胡汤对Eca-109细胞株的增殖抑制和诱导凋亡作用.结果 经不同溶度小柴胡汤处理后Eca-109细胞株,其生长明显受到抑制.MTT比色法结果说明小柴胡汤对Eca-109细胞株的增殖能起到明显抑制,流式细胞仪检测方法所检测出结果说明Eca-109细胞株的细胞周期G0/G1期细胞明显增多,S期细胞显著减少.结论 本研究证实小柴胡汤在体外具有抗肿瘤作用,与其阻断细胞周期、增殖抑制和凋亡诱导有关.
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苦参碱对人食管癌细胞株Eca-109增殖和凋亡的影响
目的 探讨中药提取物苦参碱单体(Matrine)对人食管癌细胞株Eca-109的诱导凋亡和抑制增殖作用.方法 体外培养人食管癌细胞株(Eca-109),分别给以不同浓度的苦参碱对体外培养的Eca-109细胞株连行干预.以MTT比色法、Hoechst33342染色法以及流式细胞术测定苦参碱对Eca-109细胞株的诱导凋亡及抑制增殖的作用.结果 MTT实验显示苦参碱可以明显抑制Eca-109细胞株的增殖,流式细胞术检测细胞周期显示G2期细胞明显增多,S期细胞显著减少.结论 苦参碱能明显抑制Eca-109细胞株的增殖,促进其凋亡,其作用机制可能与细胞周期阻滞于G2期有关.
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启膈散及其拆方抑制人食管癌细胞裸鼠移植瘤作用的机理研究
为了进一步研究启膈散及其拆方在体内的作用,我们运用裸鼠荷瘤动物模型,对启膈散及其拆方抑制肿瘤生长的作用及PLC-γ1蛋白表达进行了观察.
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小檗碱干预食管癌细胞基因表达及剪切作用研究
目的 观察小檗碱对食管癌细胞生长影响,探讨其作用机制.方法 于37℃,5％CO2培养箱常规培养食管癌细胞株EC-9706和ECa-109,设对照组、小檗碱组(12.5、25、50、100、200mg/L),MTT法检测小檗碱对细胞生长的抑制作用;Trizol法抽提总RNA,基因表达谱芯片检测细胞基因表达,RT-qPCR检测部分差异基因及包含内含子的β-tubulin和Actin表达片段.结果 小檗碱可抑制管癌细胞株EC-9706和ECa-109生长,IC50值分别为12.33、49.63mg/L;小檗碱干预后得到差异基因1 782个,下调基因数占差异基因比率为78.84％.这些基因主要参与剪切子、癌通路、核糖体等信号通路.与对照组比较,小檗碱组SF3B3、SNRPD1、NCBP1mRNA表达降低(P＜0.01),包含内含子的β-tubulin和Actin mRNA表达片段增加(P＜0.01).结论 小檗碱可抑制食管癌细胞生长,干预多个肿瘤相关基因表达,可通过干预剪切体相关基因影响RNA成熟.
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MBP-1过表达对食管癌Eca-109细胞增殖和凋亡的影响
MBP-1又称为c-MYC启动子结合蛋白(c-MYC promoter binding protein),其过表达可抑制多种癌细胞的增殖,但对食管癌细胞的影响尚未见报道.本研究构建了MBP-1的重组真核表达质粒,并将该重组质粒转染食管癌Eca-109细胞,检测MBP-1能否在食管癌细胞中过表达及其对食管癌细胞增殖和凋亡的影响.
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人食管癌细胞核基质的研究
目的研究人食管癌细胞株EC1和EC18的核基质形态及蛋白成分. 方法应用细胞的选择性抽提、DGD包埋-去包埋剂电镜制样观察核基质形态,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向电泳和免疫印迹等分析核基质蛋白成分. 结果抽提后,两种细胞内均存在精细的核基质-核纤层-中间丝网架.低分化的EC1细胞核基质较高分化的EC18更细密.核基质蛋白电泳显示,两株细胞有数种相同的核基质蛋白成分,也有各自的特异性核基质蛋白.在免疫印迹分析中,使用抗人NuMA单克隆抗体检测到两株食管癌细胞中都存在NuMA蛋白. 结论在食管癌细胞中,存在特异的核基质蛋白,核基质-核纤层-中间丝形成一个连续的体系,对维持细胞核的完整性和细胞功能起重要作用.
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氧化砷诱导食管癌细胞凋亡细胞骨架的改变
我们过去用氧化砷(As2O3)诱导食管癌细胞凋亡[1],发现在凋亡早期,细胞核未见明显改变之前有线粒体增生反应,并首先描述了As2O3诱导食管癌细胞的线粒体的形态改变[2].细胞凋亡的形态有细胞变小,皱缩,细胞核变圆,染色质凝集、靠边.我们发现在羊膜上皮细胞自发凋亡过程中张力微丝的消失[3],因此使我们考虑到细胞凋亡时,细胞形态的改变与细胞骨架的改变的关系.我们以As2O3诱导食管癌细胞凋亡,观察细胞形态和细胞张力微丝,肌动蛋白F(F-actin)的变化,以阐明细胞骨架的改变在细胞凋亡形态改变的意义.
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内质网应激在二十二碳六烯酸提高食管癌EC9706细胞顺铂化疗敏感性中的作用
目的 探讨二十二碳六烯酸(DHA)对食管癌细胞EC9706顺铂(DDP)化疗敏感性的影响及其机制.方法 不同药物干预将实验组分为:空白对照组、DHA组、DDP组、DHA+DDP组、DHA+DDP+应激诱导剂衣霉素(TM)组(DHA+DDP+TM组).四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测各组食管癌EC9706细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测各组食管癌EC9706细胞凋亡率;Western blot法检测各组细胞凋亡相关因子(半胱氨酸蛋白酶-3、Bcl-2)和内质网应激相关因子[葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)、磷酸化肌醇需要酶1(IRE-1)]蛋白的表达.结果 MTT检测显示浓度＞25 μmol/L DHA对食管癌细胞EC9706的增殖抑制呈时间和浓度依赖性(P=0.00).DHA预处理增强DDP对EC9706细胞增殖的抑制,促进细胞凋亡.与DDP组相比,DHA+DDP组对EC9706细胞的增殖抑制率明显升高[(60.19±5.05)％比(36.72±3.52)％,P=0.02],凋亡率也明显升高[(54.88±4.94)％比(39.74±4.64)％,P=0.03].Western blot检测显示,与DDP组相比,DHA+DDP组抗凋亡因子Bcl-2明显下降,凋亡因子半胱氨酸蛋白酶,3表达增加,内质网相关因子(GRP78和IRE-1)蛋白表达明显减少(P均=0.01);内质网应激诱导剂TM抵消DHA抑制内质网应激的作用,逆转DHA提高食管癌细胞DDP化疗敏感性的作用(P=0.02).结论 DHA预处理增强DDP对EC9706细胞增殖的抑制,促进细胞凋亡,提高食管癌细胞对DDP的化疗敏感性,其机制可能是通过抑制癌细胞内质网应激起作用.
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启膈散及其拆方对人食管癌Eca109细胞裸鼠移植瘤血管生成的抑制作用
目的:探讨启膈散及其拆方抑制肿瘤血管生成的作用和机制.方法:取对数生长期的人食管癌EC9706细胞.接种于裸鼠右胁皮下制备荷瘤裸鼠模型.自接种后第2天开始,每天用40倍成人剂量的启膈散全方及其活血和化痰两个拆方水煎液灌胃给药,连续60 d.用免疫组化方法检测移植瘤中Fac-Ⅷ因子相关抗原标记的微血管密度(MVO)和VEGF的表达,Western blot方法检测肿瘤组织EGFR、PDGFR、VEGF及PLC-γ1蛋白表达.结果:各用药组肿瘤MVD与模型组相比明显降低(36.43±4.16,40.29±2.87 42.43±3.04 vessels/ram2 vs 48.57±7.45 vessels/mm2.P<0.05或0.01).各组肿瘤MVD值与VEGF表达量呈正相关(r=0.712.P=0.0005).各用药组肿瘤EGFR、PDGFR、VEGF、PLC-γ1蛋白表达与模型组相比明显降低.启膈散及其拆方抑制裸鼠移植瘤MVD及EGFR、PDGFR、VEGF、PLC-γ1蛋白表达的作用以全方组好,活血组次之.结论:启膈散及其拆方能够抑制肿瘤血管生成.其作用机制与抑制EGFR、PDGFR、VEGF及LPLC=γ1蛋白表达相关.
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负载食管癌酸洗抗原树突状细胞诱导高效特异的抗肿瘤免疫
目的:研究负载食管癌酸洗抗原树突状细胞(DC)诱导的特异性CTL对食管癌细胞的杀伤效应.方法:酸洗涤法获得T.Tn细胞膜抗原多肽,GM-CSF,IL-4和TNF-α体外诱导扩增DC并负载酸洗抗原,制备食管癌抗原特异性CTL;用CytoTox 96TM检测其对T.Tn体外杀伤效应.结果:负载食管癌抗原肽的DC诱导的特异性CTL对T.Tn的杀伤率达89.4%,显著高于LAK细胞的杀伤率43.9%(P＜0.05).而对MCC803及Hep2肿瘤细胞株无显著杀伤作用(P＜0.05).结论:负载食管癌抗原的DC体外可诱导出高效而特异的抗食管癌效应,提示以DC为中心的肿瘤生物治疗可望提高食管癌综合治疗水平.
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腺病毒介导的p27kip1对食管癌裸鼠模型抑制的作用
目的:用腺病毒为载体,来研究p27kip1基因对食管癌的体内抑制作用.方法:用人食管癌细胞Eca109接种于裸鼠皮下,原代生长后在鼠间传代,再用组织块移植法构建食管癌裸鼠模型,应用直接注射法,将成功构建的携带人p27kip1基因的重组腺病毒及LacZ重组腺病毒导入裸鼠食管癌瘤体中,与对照组比较,绘制肿瘤生长曲线,并计算肿瘤生长抑制率.结果:p27kip1基因治疗组肿瘤生长明显受到抑制,与对照组比较,有显著性差异(P＜0.001),肿瘤生长抑制率达64.1%.结论:腺病毒介导的p27kip1基因对食管癌具有较显著的体内抑制作用.
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食管癌细胞SHEEC中NGAL基因5′端转录调控区的克隆及其顺式作用元件定位分析
目的:从食管癌细胞SHEEC中克隆NGAL基因5′端转录调控区并进行顺式作用元件定位分析.方法:采用PCR法克隆NGAL基因5′端转录调控区,并通过NCBI公共数据库BLAST序列分析鉴定突变.应用KEGG序列数据库对该调控区进行顺式作用元件定位分析.结果:从SHEEC中获得了NGAL基因5′端转录调控区-1 124～+65区段的克隆,该区段序列有3处点突变,在NGAL基因-1 124～+65区段共鉴定出78个有效顺式作用元件位点.结论:多种反式作用因子可能是永生化食管上皮细胞恶性转化中NGAL基因转录增强的重要调控因素.
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吉非替尼联合紫杉醇对食管癌细胞体内外生长抑制实验研究
目的:探讨吉非替尼联合紫杉醇对人食管癌细胞株Eca-109在体内外生长的影响及其可能机制.方法:按两因素析因设计试验,并应用MTT法观察单用吉非替尼、紫杉醇及联合应用对Eca-109细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞周期和凋亡.按单因素影响设计,建立裸鼠人食管癌皮下移植瘤模型,并分为4组各10只,分别为对照组、紫杉醇组、吉非替尼组及吉非替尼+紫杉醇联合组.经过不同处理4周后,切除瘤灶,称瘤质量,计算抑瘤率.结果:MTT法结果显示,药物干预72 h后,各用药组与对照组比较,吸光度A值均减小,吉非替尼作用72 h的半数抑制浓度为(1.72±0.27) μmol/L,紫杉醇的半数抑制浓度为(5.27土0.88)μmol/L.流式细胞术检测结果显示,4组Go/G1、S和G2/M期细胞比较差异均有统计学意义,P＜0.05;对照组Eca-109细胞的凋亡率为(9.69±1.42)％,紫杉醇组为(12.41±2.75)％,吉非替尼组为(22.0±4.26)％,吉非替尼+紫杉醇联合组为(33.1±3.78)％,差异有统计学意义,P＜0.001.对照组肿瘤体积为(1.56±0.16) cm3,紫杉醇组为(0.81±0.15) cm3,吉非替尼组为(1.35±0.08) cm3,紫杉醇+吉非替尼联合组为(0.54±0.11) cm3,差异有统计学意义,P＜0.05.结论:吉非替尼与紫杉醇合用对体内外食管癌Eca-109细胞具有显著的抑制作用,且强于药物单一作用.
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NGAL基因5′侧翼区转录调控元件的分段定位鉴定
目的:对中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋白 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL) 基因5′侧翼区的转录调控元件进行分段定位鉴定.方法:以双荧光素酶报告基因检测系统检测NGAL基因5′侧翼区(-1 431～+84)转录调控元件与转录调控蛋白之间的相互作用.结果:在NGAL基因5′端-945～-658和-657～-417 2个区段发现了转录增强子元件与转录激活蛋白之间的相互作用,而在-416～-152区段则发现了转录沉默子元件与转录抑制蛋白之间的相互作用.结论:在NGAL基因5′侧翼转录调控区可能至少存在着2个转录增强子元件和1个转录沉默子元件.
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RNA干扰MDC1基因对食管癌细胞X线照后细胞周期及相关蛋白表达影响
目的：利用RNA干扰技术降低食管癌细胞ECA109中MDC1基因表达，观察照射后细胞周期和放射敏感性变化并探讨相关机制。方法针对MDC1mRNA序列设计合成3对有效干扰序列和阴性对照序列，与载体pSIH1?H1?copGFP形成重组质粒，RT?PCR和蛋白印迹法测定MDC1mRNA和蛋白水平表达。克隆形成实验检测细胞放射敏感性，流式细胞术检测细胞周期，蛋白印迹法检测CHK1、CHK2蛋白表达，激光共聚焦显微镜观察细胞核内MDC1斑点数量。单因素方差分析组间差别。结果成功构建 pMDC1?shRNA 质粒并感染 ECA109细胞，获得稳定转染细胞 ECA109M。ECA109M细胞MDC1mRNA、蛋白表达水平低于ECA109N、ECA109细胞（ P＝0．032、P＝0．041）。5 Gy照射后 ECA109M 细胞 G2＋M 期比例低于 ECA109N、ECA109（P＝0．026）。5 Gy 照射后 ECA109、ECA109N、ECA109M细胞中CHK1和CHK2蛋白表达相近（P＝0．345和P＝0．451），ECA109M 细胞CHK2T68蛋白表达低于ECA109、ECA109N细胞（ P＝0．012）。 ECA109细胞D0值为3．06 Gy，SF2值为0．91；ECA109N、ECA109M细胞的D0值分别为2．90、1．88 Gy；SF2值分别为0．89、0．84（ P＝0．021；P＝0．037）。结论 RNA干扰降低MDC1蛋白表达后可以降低细胞周期相关蛋白的表达，解除细胞周期阻滞，增强食管癌细胞ECA109的放射敏感性。
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今又生联合h-R3对不同放射敏感性食管癌细胞的作用研究
目的 探讨重组腺病毒-p53抗癌注射液(今又生)、重组人源化表皮生长因子受体单克隆抗体(h-R3)单独及联合应用对不同放射敏感性食管癌细胞的作用.方法 用MTT法测定h-R3、今又生及两药联合对TE13及放射抗拒性细胞TE13R120的生长情况的影响;采用流式细胞术检测两种药物单独及联合作用对TE13、TE13R120细胞周期分布的影响及对Bax、Bcl-2蛋白表达的影响.结果 h-R3、今又生及联合用药组均对两种细胞增殖产生抑制作用,联合用药组对两种细胞的抑制作用高于h-R3单药组和今又生单药组,但差异均无统计学意义(P＞0.05).h-R3与今又生同时作用后12 h,对TE13细胞产生明显的G1期阻滞(P＜0.05),而对TE13R120可产生轻度的G1期阻滞.两药同时作用后12 h,对凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响不明显.结论 h-R3与今又生联合应用对不同放射敏感性的食管癌细胞产生了增殖抑制作用,这种增殖抑制作用的发生可能与G1期阻滞有关,其具体机制有待于进一步研究.
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人Rb94基因联合γ射线照射对K150细胞生长影响的体外研究
目的 探讨外源性Rb94基因联合γ射线照射对食管癌细胞株K150生长的抑制作用,为临床上进行Rb94基因.放射治疗肿瘤奠定实验基础.方法 将重组腺病毒Ad-Rb94于体外转染K150细胞,转染后进行6 Gy~(137)C8 γ射线照射,数字随机表法分为空白对照组、Ad-LacZ对照组、Ad-Rb94组、照射组和Ad-Rb94联合照射组,观察K150细胞的生长曲线、细胞周期、细胞凋亡和Rb94基因表达的变化.结果 Ad-Rb94组、照射组和联合照射组对K150细胞生长均具有抑制作用,联合照射组的抑制效应强(45.49%),明显高于Ad-Rb94组(20.26%)和照射组(35.11%)(χ~2=14.25,P<0.05).联合照射组K150细胞出现明显的G_1期阻滞和细胞凋亡,G_1期细胞和凋亡细胞所占比例高,分别达到73.4%和15.7%.联合照射组K150细胞中Rb94基因表达量多,分别是Ad-Rb94组和空白对照组的1.87倍和2.92倍.结论 Rb94基因联合γ射线照射对食管癌细胞的抑瘤作用具有协同效应,有效地抑制肿瘤细胞的生长.
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放射抗拒性食管癌细胞系的建立及基因表达差异分析
目的 观察食管癌细胞经射线反复照射后放射敏感性的变化,应用基因芯片技术分析放射抗拒性食管癌细胞基因表达变化.方法 食管鳞状细胞癌细胞株TE13经反复γ射线照射(累积剂量120 Gy),逐步筛选出具有放射抗拒性的细胞TE13R120.相差显微镜下观察TE13及TE13R120的形态学差异;应用细胞克隆形成实验,验证TE13及TE13R120两种细胞的不同放射敏感性,用流式细胞术检测它们的细胞周期分布特征;基因芯片分析两种细胞基因表达差异.结果 TE13R120的细胞群体倍增时间为39.93 h,长于亲代TE13(33.94 h).TE13及TE13R120的放射敏感性明显不同(D0值分别为1.63和2.85 Gy,SF2值分别为0.55和0.64,Dq值分别为1.38和1.15 Gy,n值分别为2.33和1.49).两种细胞经4 Gy放射线照射后,出现不同的细胞周期分布改变,12～48 hTE13R120细胞周期变化不明显,而其亲代细胞TE13发生明显G1期阻滞.应用DNA芯片对2159个基因进行了筛选,TE13R120与TE13相比,上调基因96个,下调基因80个.结论 新的食管癌细胞系TE13R120比其亲本对射线更加抗拒,并且在基因水平上发生明显变化.4 Gy照射后12～48 hTE13R120细胞周期变化不明显,而其亲代细胞TE13发生明显G1期阻滞.
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重组人血管内皮抑素对食管癌细胞的放射增敏作用及其机制
目的 观察重组人血管内皮抑素(rhES)对食管鳞癌KYSE-150细胞的放射敏感性的影响及其机制的初步探讨.方法 将食管鳞癌KYSE-150细胞分为空白对照组、rhES组、X射线照射组和rhES联合X射线照射组.细胞克隆形成法测定细胞存活分数；单击多靶模型拟合细胞存活曲线并计算放射增敏比(SER)；流式细胞术检测rhES联合X射线照射对细胞周期及凋亡的影响；反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Cyclin B1、Cyclin D1、Bcl-2、Bax mRNA表达水平,Western blot检测HIF-1α、VEGF、VEGFR蛋白的表达水平.结果 KYSE-150细胞的Do、Dq、SF2值随着rhES浓度的增加逐渐减小,当达到Do照射剂量时,100和200 μg/ml rhES的放射增敏比分别为1.14、1.27；rhES联合X射线照射组与X射线照射组比较,细胞凋亡率增加、凋亡相关基因bax的表达增加、细胞VEGF蛋白及HIF-1α蛋白的表达水平降低(t=7.97、3.02、117.55、7.22,P＜0.05).结论 rhES对体外食管癌细胞具有明显的辐射增敏作用,其机制与其抑制细胞HIF-1 α、VEGF蛋白表达以及对细胞凋亡相关基因bax的表达调控、诱导细胞凋亡密切相关.
