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小檗碱干预食管癌细胞基因表达及剪切作用研究
目的 观察小檗碱对食管癌细胞生长影响,探讨其作用机制.方法 于37℃,5％CO2培养箱常规培养食管癌细胞株EC-9706和ECa-109,设对照组、小檗碱组(12.5、25、50、100、200mg/L),MTT法检测小檗碱对细胞生长的抑制作用;Trizol法抽提总RNA,基因表达谱芯片检测细胞基因表达,RT-qPCR检测部分差异基因及包含内含子的β-tubulin和Actin表达片段.结果 小檗碱可抑制管癌细胞株EC-9706和ECa-109生长,IC50值分别为12.33、49.63mg/L;小檗碱干预后得到差异基因1 782个,下调基因数占差异基因比率为78.84％.这些基因主要参与剪切子、癌通路、核糖体等信号通路.与对照组比较,小檗碱组SF3B3、SNRPD1、NCBP1mRNA表达降低(P＜0.01),包含内含子的β-tubulin和Actin mRNA表达片段增加(P＜0.01).结论 小檗碱可抑制食管癌细胞生长,干预多个肿瘤相关基因表达,可通过干预剪切体相关基因影响RNA成熟.
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HBeAg结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A的克隆化
目的:克隆HBeAg结合蛋白未知功能新基因HBeBP4的剪切体基因HBeBP4A,构建其真核表达载体,并应用生物信息学初步探讨其结构及功能.方法:应用PCR技术从HepG2细胞提取的cDNA扩增HBeBP4基因的剪切体基因HBeBP4A,选用pGEM-Teasy载体进行TA克隆,通过PCR,限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到真核表达载体pcDNATM3.1/myc-HisA,通过PCR,限制酶切分析进行鉴定,并应用生物信息学初步分析其物理化学性质,蛋白质结构和功能.结果:成功扩增出HBeBP4剪切体基因,命名为HBeBP4A.利用生物信息学分析推定其ORF为1104个核苷酸(nt),编码产物为367个氨基酸残基(aa).结论:发现了HBeAg结合蛋白4(HBeBP4)基因的剪切体HBeBP4A,构建了pcDNATM3.1/myc-HisA真核表达载体.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因2基因组DNA结构分析及其不同剪切体的克隆化研究
目的:HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因NS5ATP2及其不同剪接体基因序列的确立、克隆化研究.方法:依据我室构建的NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,利用生物信息学技术获得,提取HepG2细胞的总RNA,进行反转录(RT-PCR),扩增产物与原核表达载体连接,进行测序鉴定.结果:经测序鉴定成功获得新基因的编码序列,并意外发现了NS5ATP2的不同剪接体,对NS5ATP2基因组进行分析,获得剪接体的编码序列,并成功进行了克隆化研究.结论:利用分子生物信息学技术,发现并鉴定了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因NS5ATP2(615)及其可变剪接体NS5ATP2(216),为研究新基因的生物学功能及丙肝发病机制提供新的依据.
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HBeAg结合蛋白4剪切体HBeBP4A基因酵母表达载体的构建及表达研究
目的 在真核生物酵母细胞中表达乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A基因.方法 以pcDNATM3.1/myc-HisA-HBeBP4A重组质粒作为模板,经RT-PCR扩增HBeBP4A基因,克隆到pGEM-T载体中并测序鉴定,酶切回收后连接到酵母表达质粒pGBKT7中并转化酵母AH109,色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落,提取酵母蛋白质,行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析.结果 成功扩增出HBeBP4A基因,测序结果符合GenBank报告序列.酶切回收的HBeBP4A基因片段成功克隆入酵母表达载体pGBKT7并转化入酵母细胞AH109中,Western blotting分析显示该基因在酵母细胞中表达,表达产物相对分子量为61.37kD.结论 成功构建了HBeBP4A酵母表达载体,并在酵母细胞中表达.
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HCCR mRNA在急性白血病患者中的表达及其临床意义
人类子宫颈癌基因(HCCR)是新近确认的一种致癌基因,早由韩国学者Ko等[1]通过差异显示RT-PCR方法从子宫颈癌细胞中筛选、鉴定而出.HCCR基因定位于人染色体12q,分为2个亚型,分别为HCCR1(基因库登记号AF195651)和HCCR2(基因库登记号AF315598).HCCR1和HCCR2编码序列具有高度同源性,为同一mRNA的不同剪切体.研究表明,将表达HCCR1或HCCR2的细胞接种到裸鼠体内可以形成肿瘤,HCCR基因导致肿瘤的发生可能是通过对p53抑癌基因的负向调控而实现的.
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甘露聚糖结合凝集素相关蛋白19（MAp19）的研究现状
补体系统是机体固有免疫的重要组成部分,可通过经典途径、凝集素途径和替代途径而被激活,发挥其生物学效应[1,2]。启动凝集素途径活化的第一个补体组分是甘露糖结合凝集素( Mannan-binding lection,MBL)/纤维胶原素( Ficolin,FCN)与MBL-相关丝氨酸蛋白酶( Mannose-binding lectin associated serine protease, MASP)结合形成的复合物。 MASP家族由MASP-1、MASP-2、MASP-3丝氨酸蛋白酶及MAp19和MAp44非酶蛋白组成,其中MASP-2是参与凝集素途径活化的重要组分。 MAp19是MASP-2的剪切体,其氨基酸序列分析显示仅比MASP-2羧基端前两个功能区多四个氨基酸残基。 MAp19能与MBL结合,但无催化功能,它是否与MASP-2存在竞争抑制作用尚待进一步研究证实。此外发现MAp19与肾病、骨髓瘤以及SARS等疾病存在一定相关性。
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PBX1基因剪切体表达与SLE的相关研究
了解PBX1基因各种剪切体的表达在SLE患者和正常人中是否存在差异,探讨PBX1的表达与SLE发病的相关性.通过PCR扩增及毛细管芯片电泳,确证剪切体h、k、l存在于人体;通过实时荧光定量PCR技术,对剪切体h、k、1分别进行SLE患者组和正常组的mRNA表达定量比较.结果发现这3种剪切体在患者组中的表达较正常人明显降低,正常人的表达是SLE的9～12倍.重度患者的k、l剪切体与轻中度的病人相比表达明显降低,并发狼疮性肾炎的病人k剪切体的表达较无肾累及的病人显著降低.说明PBX1基因剪切体h、k、l在SLE患者中mRNA表达水平下降,并与SLE活动度及肾累及有关.提示机体通过PBXl的表达量的调节可能参与SLE的发病.
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丙型肝炎病毒E2蛋白结合蛋白E2-BP3剪切体的基因克隆及生物信息学分析
HCV感染致肝细胞损伤的机制,很大程度上与病毒蛋白和肝细胞蛋白间的相互作用有关.
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HBXAg反式调节基因11剪切体的克隆化及生物信息学分析
目的 克隆乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白反式调节的靶基因11(XTP11),获得未知功能的新基因-XTP11剪切体,对其进行生物信息学分析,探讨其结构和功能.方法 从肝母细胞瘤细胞系HepG2中提取总RNA,逆转录为cDNA后,设计特异性引物克隆XTP11剪切体,生物信息学技术获得编码序列、物理化学性质、蛋白质结构和功能等基本信息.结果 成功扩增出XTP11剪切体基因,生物信息学分析推定ORF为1 314个核苷酸,编码产物为437个氨基酸残基.结论 此文发现并鉴定了HBV XTP11剪切体,为阐明其在HBV X蛋白致病机制中的作用提供新的研究线索.
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实时荧光定量PCR检测人组织因子及其剪切体方法的构建
目的 建立检测人组织因子(flTF)及其剪切体(asTF)的实时荧光定量PCR检测技术.方法 分别采用文献报导及自行设计的检测人flTF和asTF的引物及TaqMan探针,经优化反应体系及反应条件后,用于检测人flTF和asTF基因.将扩增的人flTF和asTF的基因片段纯化后分别与pMD19-T载体连接,分别克隆构建含flTF和asTF基因片段的重组质粒,作为实时荧光定量PCR检测flTF和asTF基因表达的标准品.结果 PCR扩增产物分别经测序证实为flTF和asTF的特异性片段.本法检测flTF和asTF基因表达的灵敏度均为40拷贝/μl,线性范围均为4.00×101～4.00×107拷贝/μl,相关系数均为1.000;扩增效率分别为flTF 91.15%,asTF 90.53%,批间变异系数分别为flTF 3.04%～9.31%,asTF 3.01%～9.64%.结论 成功建立了检测人flTF和asTF的实时荧光定量PCR方法,且该方法特异性好,灵敏度高.
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乙型肝炎病毒X蛋白反式调节基因11剪切体的原核表达及蛋白纯化
目的 克隆乙型肝炎病毒X蛋白反式调节基因11(XTP11)剪切体, 构建其原核表达载体,表达并纯化该蛋白.方法 应用逆转录聚合酶链反应及生物信息学技术从HepG2细胞中提取cDNA为模板并扩增,意外获得XTP11基因的剪切体基因,选用pGEM-T载体进行T-A克隆,通过限制性酶切分析及测序鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌,经异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导XTP11剪切体融合蛋白的表达,表达产物进行SDS-PAGE分析,考马斯亮蓝染色,以鼠His probe单克隆抗体进行Western blot分析鉴定证实表达蛋白的特异性,并纯化蛋白.结果 成功扩增出XTP11剪切体基因,构建了pET-32a(+)XTP11剪切体原核表达载体,经IPTG诱导获得了大小约为69kD的重组蛋白.结论 发现的HBV XTP11剪切体及其融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.
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mM-CSF 及其剪切体重组逆转录病毒表达载体的构建
目的：构建膜结合型M-CSF（ mM-CSF）及其胞内区截短30个氨基酸的剪切体（ mM-CSF-Δ）重组逆转录病毒表达载体。方法用DNA重组技术构建并鉴定mM-CSF和mM-CSF-Δ的重组逆转录病毒表达载体MSCV-PGK-GFP-mM-CSF、MSCV-PGK-GFP-mM-CSF-Δ，与空载体对照MSCV-PGK-GFP分别转染Phoenix细胞包装病毒，并感染HEK293细胞，通过流式分选术获得3种阳性细胞。结果经Phoenix包装的重组及对照逆转录病毒成功感染HEK293细胞，获得了稳定表达细胞株HEK293-M、HEK293-M-Δ和对照细胞株HEK293-V。 RT-PCR以及West-ern blotting法检测发现HEK293细胞中有mM-CSF和mM-CSF-Δ的表达，HEK293-M细胞和HEK293-M-Δ细胞经流式抗体标记后均能检测到膜蛋白的表达。结论成功构建了mM-CSF及其剪切体的重组逆转录病毒表达载体。
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mM-CSF 及其剪切体对淋巴细胞白血病Ramos 细胞增殖的抑制作用
目的：探讨膜结合型巨噬细胞集落刺激因子（ mM-CSF）及其剪切体（ mM-CSF-Δ）对淋巴细胞白血病Ramos细胞增殖的抑制作用。方法采用Overlap PCR法构建带有mM-CSF的真核表达质粒pTARGET-mM-CSF，再进一步构建胞内区截短30个氨基酸的表达质粒pTARGET-mM-CSF-Δ，并进行PCR及DNA双向测序鉴定。将空载体pTARGET、pTARGET-mM-CSF、pTARGET-mM-CSF-Δ质粒分别转染Ramos细胞，经G418筛选稳定表达细胞株，并用RT-PCR、Western blotting进行鉴定；MTT法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期。结果成功构建了mM-CSF和 mM-CSF-Δ的真核表达载体，获得了稳定转染细胞株 Ramos-V、Ramos-M 和 Ramos-Δ。 Ramos-M、Ramos-Δ、Ramos-V细胞增殖能力的OD值分别为0．413±0．014、0．384±0．019、0．463±0．037，Ramos-M细胞与Ramos-Δ细胞比较，Ramos-M、Ramos-Δ细胞分别与Ramos-V细胞比较，P＜0．05或＜0．01。 Ramos-M、Ramos-Δ、Ramos-V细胞处于G0／G1期的比例分别为41．54％±1．22％、45．60％±1．09％、39．20％±1．53％，Ramos-M细胞与Ramos-Δ细胞比较， Ramos-M、Ramos-Δ细胞分别与 Ramos-V 细胞比较， P ＜0．05或＜0．01。结论 mM-CSF、mM-CSF-Δ均能抑制淋巴细胞白血病Ramos细胞增殖，且后者抑制作用更强。
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基因表达谱芯片筛选NS5ATP2剪切体NS5ATP2-512转染细胞差异表达基因
目的应用基因芯片技术检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活基因NS5ATP2剪切体512的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明NS5ATP2剪切体512蛋白可能的分子生物学功能.方法设计并合成NS5ATP2基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS5ATP2蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的NS5ATP2编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,在此过程中发现其剪切体NS5ATP2-512并构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP2-512.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有14个基因表达水平显著上调,15个基因表达水平显著下调.结论应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS5ATP2剪切体NS5ATP2-512转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS5ATP2-512蛋白可能的生物学功能提供依据.
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单管多重检测急性早幼粒细胞白血病 PML-RARa 融合基因3种剪切体 RT-qPCR 方法的建立及临床应用
本刊主编,武汉大学人民医院李艳教授(通讯作者)指导博士研究生陈占国(第一作者)等在《PLOS ONE》(2015,10(3) e0122530,IF：3.534)发表了题为“Development and validation of a 3-plex RT-qPCR assay for the simultaneous detection and quantitation of the three PML-RARa fusion transcripts in acute promyelocytic leukemia”的研究论文,主要内容如下。
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乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A的克隆与原核表达
目的:克隆乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白未知功能新基因HBeBP4的剪切体基因HBeBP4A,构建其原核表达载体,诱导在大肠埃希菌中表达.方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术及生物信息学(bioinformatics)技术从HepG2细胞提取的cDNA模板中扩增获得HBeBP4基因的剪切体基因HBeBP4A,选用pGEM-T-easy载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化进BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导HBeBP4A融合蛋白的表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,考马斯亮蓝染色,以抗-His的单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹分析鉴定证实表达蛋白的特异性.结果:成功扩增出HBeBP4剪切体基因HBeBP4A,并将其插入pET-32a(+)原核表达载体,经BL21(DE3)受体菌转化、IPTG诱导、SDS-PAGE分析获得了HBeBP4A重组蛋白的表达,Western blotting证实了重组蛋白表达的特异性.结论:发现了乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4(HBeBP4)基因的剪切体HBeBP4A,构建了pET-32a(+)-HBeBP4A原核表达载体,并利用大肠埃希菌原核表达系统成功获得了pET-32a(+)-HBeBP4A重组蛋白的表达.
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食管鳞癌△ NP63表达和肿瘤微血管密度的关系
p63基因作为p53基因家族的成员,参与肿瘤的发生过程,其剪切体之一△NP63具有癌基因的作用[1],为了探讨△NP63和肿瘤生长的关系,我们用CD105作为微血管密度判断指标,分析了△NP63表达和肿瘤血管密度之间的相关性.
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组织因子及其剪切体在胃癌组织中的表达及其预后的研究
目的 探讨组织因子(TF)及其剪切体在胃癌组织中的表达,并分析全长组织因子(flTF)及其剪切体(asTF)与胃癌患者预后的关系.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测52例胃癌组织及10例正常胃组织的flTF及asTF的基因表达水平并分析临床意义,应用Cox模型分析其与胃癌患者死亡的关联程度.结果 胃癌组织flTF mRNA相对定量[7.45(0.34 ～33.68)]高于正常胃组织[3.00(1.36 ～5.02)],差异有统计学意义(P＜0.05).胃癌组织asTF mRNA相对定量[0.88(0.07 ～26.00)]高于正常胃组织[0.33(0.03 ～0.97)],差异有统计学意义(P＜0.01).flTF与asTF基因表达水平与性别、年龄、TNM分期、肿瘤大小、组织学分型和化疗敏感性等预后相关因素的关系差异均无统计学意义(P＞0.05).Log-rank生存分析显示flTF低表达组[33.83(25.24 ～42.43)个月]比高表达组[18.18(13.32 ～23.04)个月]平均术后生存时间显著延长15.66个月,差异有统计学意义(x2=6.185,P＜0.05).asTF低表达组[25.32(21.19 ～29.45)个月]比高表达组[20.50(12.51～28.48)个月]平均术后生存时间显著延长4.82个月,差异有统计学意义(X2 =4.604,P＜0.05).多因素Cox模型分析显示,flTF及asTF均是胃癌独立的预后风险因素[风险比(HR)=6.03,95％可信区间(CI):1.02 ～35.71,P＜0.05]及(HR=10.74,95％ CI:2.32～49.59,P＜0.01).结论 flTF及asTF mRNA在胃癌组织中的表达水平较正常组织显著上调,flTF及asTF的基因表达水平是胃癌患者死亡的高危因素.
关键词： 胃癌 组织因子 剪切体 预后 实时荧光定量聚合酶链反应 -
小鼠arhgap39基因真核过表达载体的构建及其蛋白表达的初步研究
目的 构建arhgap39基因真核过表达载体并初步研究arhgap39蛋白表达的相关问题.方法 提取小鼠海马组织总RNA,逆转录合成cDNA,根据GeneBank中基因信息设计引物,高保真PCR扩增arhgap39基因的编码区,随后将其转移到真核载体上,转染NG-108细胞并观察其在细胞内的表达情况.结果 经酶切和测序鉴定表明成功构建arhgap39基因的相关真核过表达载体;将其转染NG-108细胞,免疫印迹试验证实arhgap39成功过表达,arhgap39的分子量约为140 kD.结论 我们的实验结果确认了arhgap39蛋白的分子量,并对其可能存在的存在形式做了验证性研究,可以为进一步的研究提供理论基础和研究工具.
关键词： arhgap39基因 过表达载体 剪切体 分子量 小鼠 -
CART抑制内质网应激促进缺血再灌注损伤后的神经修复
目的：早期溶栓和神经细胞保护一直是防治缺血性脑卒中的两大策略。然而，溶栓治疗常面临再灌注损伤或继发性出血等问题。因此，神经细胞保护及神经损伤的修复一直是本领域的研究热点。多年来的研究重点主要侧重于神经元的保护。本研究室发现CART能够发挥缺血再灌注损伤早期的神经保护作用和后期的神经修复作用。 CART发挥神经修复作用的机制有待进一步研究。方法：原代培养新生C57BL／6小鼠皮层神经元，体外氧糖剥夺复氧（O／R）模型，MTT生存实验及Western blot。结果：原代培养的皮层神经元O／R 4 h后给药CART，继续长时间培养，CART可以提高神经元的生存率，分子实验表明CART组GRP78蛋白水平升高，caspase 12的剪切体水平降低。结论：CART促进缺血再灌注损伤后期的神经修复，其机制可能是上调GRP78水平，抑制内质网应激和凋亡分子激活。
