增强子

增强子(enhancer)是使基因转录速率显著提高的一类顺式作用元件.各种增强子相互间在结构上同源性较少,但具有一些短的和简并的共有序列.增强子具有以下特性:(1)增强子能(通过启动子)提高同一条DNA链上靶基因转录的速率;(2)增强子对同源或异源基因同样有效;(3)增强子的位置可在基因5′上游、基因内或其3′下游序列中;(4)增强子在DNA双链中没有5′与3′固定的方向性;(5)增强子可远离转录起始点,通常在1～4 kb(个别情况下可远离转录起始位点达30 kb)起作用;(6)增强子一般具有组织或细胞特异性;(7)增强子的活性与其在DNA双螺旋结构中的空间方向性有关.

人白细胞抗原DQB15'-调控区序列与I型糖尿病的关联

应用聚合酶链反应(PCR)、PCR/SSCP和克隆测序等方法比较分析汉族1-型糖尿病患者与正常对照者HLA-DQB1 5'-调控区多态性.结果显示携带不同等位基因的患者与对照者DQB1 5'-调控区y、s box核苷酸序列相同,且与白种人基因结构一致;y box核苷酸序列存在二种结构,CCTAGAGACAGATT序列常常与DQB1.0302等位基因在同一单倍型;转录起始位点至y box间-44至-61位存在多态性,-59至-61位AAG等位基因可能与1-型糖尿病易感相关联;在2例携带DQB1.0601等位基因患者的-131至-128位间发现CACC→ACA A单个碱基取代突变.表明HLA- DQB1基因5'-调控区主要作用元件旁侧核苷酸变异可能参与1-型糖尿病的病因学.

可调控的肝癌特异性基因治疗载体的构建

目的构建新型AFP顺式作用元件调控的基因表达载体,检测该调控元件的特异性和可调控性.方法 PCR扩增截短的AFP基因启动子、增强子,将上述片段与含有报告基因强化绿色荧光蛋白基因的载体pEGFP-1的多克隆位点连接,构建成为AFP基因顺式作用元件调控的肝癌特异性EGFP表达载体(pEGFP-1-EP).用脂质体法将表达载体转染表达或不表达AFP的肿瘤细胞系,荧光显微镜观测重组AFP顺式作用元件的启动活性,并用流式细胞术检测全反式视黄酸对它的抑制作用.结果成功地将AFP基因启动子、增强子克隆到报告基因载体pEGFP-1的多克隆位点,酶切鉴定和DNA序列分析无误,荧光显微镜观测证实EGFP能在AFP阳性肝癌细胞特异性表达,1×10-7M全反式视黄酸对其活性有明显的抑制.结论 AFP顺式作用元件修饰的基因治疗载体,在基因转录水平特异性调控目的基因的表达,为下一步将其作为肝癌基因治疗载体奠定了基础.

前列腺细胞核蛋白的分离纯化

我们曾在前列腺特异抗原(PSA)启动子中雄激素应答元件(ARE)上游鉴定了一长度为15bp的顺式作用元件,命名为RFA [1].

食管癌细胞SHEEC中NGAL基因5′端转录调控区的克隆及其顺式作用元件定位分析

目的:从食管癌细胞SHEEC中克隆NGAL基因5′端转录调控区并进行顺式作用元件定位分析.方法:采用PCR法克隆NGAL基因5′端转录调控区,并通过NCBI公共数据库BLAST序列分析鉴定突变.应用KEGG序列数据库对该调控区进行顺式作用元件定位分析.结果:从SHEEC中获得了NGAL基因5′端转录调控区-1 124～+65区段的克隆,该区段序列有3处点突变,在NGAL基因-1 124～+65区段共鉴定出78个有效顺式作用元件位点.结论:多种反式作用因子可能是永生化食管上皮细胞恶性转化中NGAL基因转录增强的重要调控因素.

人RAG2基因5'近端染色质结构定量差异分析及可接近区域转录调控机制研究

目的 研究人类重组激活基因2(RAG2)5’近端染色质可接近区域调控RAG2表达的分子机制.方法 采用染色质可接近性实时聚合酶链反应(CHART-PCR)分析RAG2基因5’近端区域的DNase Ⅰ超敏位点(DHS),比较RAG阳性和阴性淋巴细胞以及非淋巴细胞的染色质开放状态变化.采用双荧光素酶报告基因分析DHS的转录调控活性,采用胶迁徙试验和染色质免疫沉淀试验证实GATA3的体外(in vitro)和在体(invivo)结合,采用PCR定点突变和显性负突变体技术证实GATA3对RAG2基因的调控作用.结果 人RAG2基因5’上游近端区域染色质在T与B细胞中处于不同的开放状态,RAG阳性T细胞的核心启动子活性与其特异性DHS相吻合.T细胞特异性转录因子GATA3结合于T细胞特异性DHS的高度保守区域,特异性上调报告基因及在体RAG2 mRNA在T细胞中的表达.结论 RAG2基因5’近端区域通过染色质开放状态变化调控基因表达的特异性.GATA3与高度保守的DHS区域结合,上调内源性人RAG2在T细胞中的表达.

犬黑素皮质素受体-2基因的分子克隆及序列分析

目的 分离犬MC2R基因cDNA 5'末端,分析其启动区域特点.方法 采用了RNA连接酶介导的RACE(RLM-RACE)技术分离了犬MC2R基因和局部序列比对工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)对CDS区进行了初步验证.结果 新分离了犬MC2R cDNA 的5'末端,并对其启动区序列作了初步分析.序列分析显示,该基因至少由两个外显子(exon1和exon2)组成,exon1和exon2的一部分编码5'非翻译区(5'-UTR),exon2其余的部分编码整个编码区.结论 克隆了犬MC2R基因的5'末端,在其启动区发现了inr、SF-1、SP1、CRE、PPRE、AP-1等多个顺式作用元件,为犬MC2R表达调控研究奠定基础.

催乳素基因转录调控的分子机制

大鼠催乳素(rPRL)基因转录调控过程主要涉及顺式作用元件和反式作用因子.目前,已鉴定出多种rPRL基因的反式作用因子,如垂体特异转录因子、催乳细胞特异转录因子和雌激素受体等.这些反式作用因子结合于rPRL基因上相应的顺式作用元件,发挥基因转录调控功能.此外,某些激素、多肽、生长因子、神经递质、第二信使、即早基因以及DNA结构的变化也能影响rPRL基因转录过程.

犬MC2R基因5'-UTR、3'-UTR序列测定、分析及其 5'侧翼启动区序列分析

目的 分离犬MC2R基因CDS部分序列和该基因5'、3'非翻译区,并对5'、3'非翻译区和5'侧翼的启动区进行分析.方法 本研究采用反转录PCR(RT-PCR)和RNA连接酶介导的RACE (RLM-RACE)技术和BLAST分析软件.结果 得到了5'、3'非翻译区和部分CDS片段的序列,他们的大小分别为168 bp、1 366 bp和987 bp,并预测了大约1 500 bp的5'侧翼的启动区域.结论 对它们进行分析显示,该基因至少由两个外显子(exon1和 exon2)组成,exon1 和exon2的一部分编码5'非翻译区(5'-UTR),exon2其余的部分编码整个编码区.其启动区有inr, SF-1, SP1, CRE, PPRE, AP-1等多个顺式作用元件,这些为犬MC2R表达调控研究提供研究奠定基础.

肝癌靶向性超抗原基因疫苗的设计和预测

目的:探讨AFP顺式作用元件调控的肝癌特异性减毒超抗原疫苗(SEA(D227A)-Linker-CD80tm)设计的合理性.方法:应用核酸和蛋白质分析软件Gene Construction Kit2.0、ANTHERPRO5.0、JAMBW1.1和www.expasy.com网站提供的方案,分析重组体的开放读框以及融合蛋白的可及性、柔性、抗原性和疏水性,并作了跨膜区和二级结构模拟.结果:重组体的转录受AFP顺式作用元件调控,Linker所在部位柔性高,可及性弱,不改变两侧蛋白分子的抗原性和疏水性.融合蛋白表达后,被CD80tm锚定于肝癌细胞表面,超抗原部分(SEA)表达在细胞膜外,二级结构预测Linker不改变蛋白结构,完全符合作者设计疫苗的初衷.结论:重组疫苗设计合理,特异性高,融合蛋白有很大可能保留了SEA和CD80tm的理化特性,为进一步的实践操作提供了可靠的理论基础.

SCN5A基因启动区+495bp～+584bp片段的克隆与功能分析

目的 为了研究大鼠心肌SCN5A基因启动区+495bp～+584bp区域内的顺式作用元件对转录调控的影响.方法 应用聚合酶链反应扩增大鼠心肌SCN5A基因启动区+495bp～+584bp片段,与荧光素酶报告基因载体pGL3-promoter重组,以pGL3-promoter空载体为对照,瞬时转染人胚肾母细胞(HEK293)和小鼠胚胎心肌细胞(H9C2),检测荧光素酶活性.结果 成功构建的pGL3-P1重组载体的荧光素酶活性与pGL3-promoter对照载体相比,在HEK293细胞无明显差别(P＞0.05),在H9C2细胞荧光活性增高(22.5±5.4)倍(P＜0.01).结论 大鼠心肌SCN5A基因启动区+495bp～+584bp区域存在对基因的转录调控活性具有增强作用的组织特异性顺式作用元件.

079顺式作用元件CArG-,E-,CCAAT-,TATA-盒可能参与曼氏血吸虫性别调节的基因转录

人卵巢癌相关候选基因HE4(WFDC2)的转录调控主要由Sp1与位于-71和-48的Egr-1位点结合所介导

目的阐明HE4基因转录调控机制的细节.方法1.用半定量RT-PCR的方法评估HE4基因在肿瘤细胞株中的表达情况;2.以荧光素酶报告基因载体为基础,对HE4基因的上游顺序构建了3'、5'缺失突变和一系列连接体扫描突变;3.通过瞬时转染/体外双荧光素酶报告系统对这些重组质粒中插入片段进行启动子活性的分析;4.针对蛋白和关键顺式区域的结合的特异性和能力,开展泳动滞后和抗体介导的超迁移分析.结果通过对(-1860/+29)的HE4基因上游片段及其剪切体的分析,将HE4基因小启动子确定为-107/+15的DNA片段.通过对连接体扫描突变体的分析,将关键的顺式作用元件确定在W45(-71/-48)片段,生物信息学提示该区存在两个Egr-1位点.通过用已知的反式作用因子与报告基因质粒分别进行共转染,提示Sp1是为有效的反式作用因子,而不是Egr-1.通过泳动滞后和抗体介导的超迁移实验,证实Sp1确实是参与作用的转录因子.结论HE4基因的转录活性主要是由转录因子Sp1与位于(-71/-48)区域的两个Egr-1位点结合所介导的.

白假丝酵母菌唑类耐药相关的转录调控研究进展

近30年来,白假丝酵母菌已成为导致免疫功能低下患者发病和死亡常见的条件致病性真菌.随着临床上唑类药物的频繁使用,耐药菌株不断被检出,其耐药机制研究也备受关注.近年来,其在转录调控水平的机制研究也取得了很大进展,明确了耐药相关编码基因的顺式作用元件和反式作用因子,并部分阐述了相应的作用机制.文章就白假丝酵母菌唑类药物耐药相关的转录调控研究进展作一综述.

cAMP反应元件结合蛋白与神经病理性疼痛

神经病理性疼痛(neuropathic pain)是指由于外周或者中枢神经系统的直接损伤或功能紊乱引起的疼痛.常表现为自发性和诱发性疼痛.其确切机制尚不清楚.目前研究认为与初级感觉神经元的异常兴奋;交感神经的芽生和交感-感觉耦联;初级传入末梢在脊髓背角的异常分布;中枢敏感以及大脑皮层的功能重塑等有关[1,2].这种慢性改变涉及基因表达的改变,基因表达的关键是基因转录的调控.cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response-element binding protein,CREB)是转录/翻译因子家族的一员,通过与顺式作用元件结合,改变DNA的局部构象而影响基因转录水平.近年来研究发现,CREB在神经病理性疼痛的发生发展过程中具有重要作用.

人同源盒基因NKX3.1内含子及5′上游10 kb调控区功能的初步分析

目的 检测人同源盒NKX3.1基因内含子及5'上游10 kb调控区对启动子活性的影响,分析其雄激素反应性和组织特异性,为进一步研究该基因表达调控机制奠定基础.方法 利用基因重组技术分别构建5'上游10 kb调控区/内含子-NKX3.1基本启动子-荧光素酶报告基因质粒.转染雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP后,检测荧光素酶表达活性,观察内含子及5'上游调控区对NKX3.1启动子活性的影响；加入雄激素类似物R1881刺激,进一步检测其雄激素反应性；通过转染不同细胞分析其组织特异性.结果 荧光素酶报告基因分析表明,NKX3.1基因5'上游-7 681 ～-6 483 bp可以增强其启动子活性2.6倍,但该增强作用并不具有组织特异性.内含子及5'上游10 kb其他区域对NKX3.1启动子活性未见明显的增强作用.R1881刺激并不能使内含子及5'上游10 kb调控区活性明显增强.结论 NKX3.1基因内含子及5 '上游10kb调控区不具备雄激素反应性,5'上游-7 681 ～-6483bp可以增强NKX3.1启动子活性,但其组织特异性增强元件并不存在于该片段.

顺式作用元件的预测

顺式作用元件是同一DNA分子中具有特殊功能的转录因子DNA结合位点和其它调控基序,在基因转录起始调控中起重要作用;按功能特性分为通用调节元件如启动子、增强子及沉默子和专一性元件如激素反应元件,cAMP反应元件;确定顺式作用元件的试验方法主要有:DNA结构分析、序列分析和基因删除或替换等,软件预测是确定顺式作用元件的另一种方法,但不同软件预测结果差异较大,将试验方法与软件预测相结合能够提高顺式作用元件预测的准确性.

Ⅰ型胶原基因转录调控的研究进展

调控Ⅰ型胶原(COL1)基因转录的顺式作用元件位于启动子和第一个内含子中.顺式作用元件及其结合的转录因子有生物种类特异性.一些转录因子以不同的亲和力与其部分潜在结合位点结合,它们间的相互作用稳定了DNA的环状结构,并引发转录.转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子在转录水平参与COL1基因的调控,在COL1基因启动子上有它们的反应元件.

CYP21基因启动子结构功能及突变研究进展

21羟化酶基因(CYP21基因)缺陷可引起21羟化酶缺乏.近年对CYP21基因的研究取得了一定进展,本文介绍了该基因启动子区的位置、结构、调节因子,重要功能域及突变等方面的进展,从分子水平进一步加深了对CAH的发病机理的了解.

大鼠SCN5A基因内含子1+204 bp～+757 bp转录调控功能分析

目的 克隆大鼠心肌SCN5A基因5'端调控区,检测目的片段在HEK293细胞中的转录活性.方法 扩增大鼠心肌SCN5A基因+204 bp～+757 bp、+204 bp～+385 bp和+204 bp～+329 bp片段,构建含目的片段的荧光素酶报告基因--pGL3-P0、pGL3-P1和pGL3-P2,比较HEK293细胞中荧光素酶活性,评价不同长度DNA片段的转录调控活性.结果 成功构建大鼠心肌SCN5A基因5'端3个片断的荧光素酶报告基因,HEK293细胞中pGL3-P1相对荧光素酶活性分别为pGL3-P0、pGL3-P2的4.3倍和2.8倍.结论 SCN5A基因内含子1目的片段在HEK293细胞中具有较强的转录调控活性;SCN5A基因+329 bp～+385 bp为正凋控区,软件分析MZF1、USF、C-ETs-1等因子能与这些正调控区域结合并可能参与SCN5A基因的表达调控.