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构建人ICAM-1真核表达载体的实验研究
目的:构建人ICAM-1-1真核表达载体pcDNA3.1(-)-ICAM-1.方法:设计特异性引物,利用PCR技术扩增出ICAM-1全编码区基因片段,插入到真核表达载体pcDNA3.1(-)中.结果:PCR扩增得到人成熟ICAM-1的cDNA片段大小为1800bp,重组子利用限制性内切酶进行酶切鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCDA3.1(-)-ICAM-1.结论:成功构建了人ICAM-1真核表达载体,为进一步建立稳定转染ICAM-1的细胞株以及研究ICAM-1及其受体的生物学功能提供了条件.
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美国新港沙门菌感染的暴发与黄瓜的关联性
2014年8月,美国国家食源性疾病监测分子分型网络(PulseNet)检测到一个跨州的新港沙门菌血清型感染的群组,其具有无法区分的脉冲场凝胶电泳(Pulse-Field Gel Electrophoresis,PFGE)带型(限制性内切酶XbaⅠ,带型为JJPX01.0061.信息来源http://www.cdc.gov/pulsenet).
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自身免疫性甲状腺病与促甲状腺激素受体基因突变的关系
自身免疫性甲状腺病(AITD)是一组器官特异性自身免疫疾病。主要包括Graves病(GD)、桥本甲状腺炎(HT)和原发性粘液性水肿。促甲状腺激素受体(TSHR)是AITD发病中重要的自身抗原，对其遗传变异的研究具重要意义。人类TSHR基因位于染色体14q31处，全长60 kb，包括10个外显子和9个内含子，第1至9号外显子编码TSHR氨基酸膜外区的部分，跨膜区和膜内区部分由第10号外显子编码〔1〕。研究表明，自主性功能性甲状腺腺瘤，遗传或散发性毒性甲状腺增生症，先天性甲减等多种甲状腺疾病与TSHR基因突变密切相关，对于Graves病和桥本甲状腺炎，这方面的研究较少。目前有G205C体细胞突变，C253A原始细胞突变的报道〔2，3〕，但尚存争议。本研究初步探讨AITD与TSHR基因突变的关系。 一、对象和方法 1.对象：123例无亲缘关系的西北地区汉族人。其中GD患者48例(男15例，女33例)，均具典型的高代谢症群，不同程度弥漫性甲状腺肿，实验室检查符合甲亢改变。大部分经甲状腺病理学检查确诊。HT患者50例(男4例，女46例)，根据甲状腺肿大，甲状腺自身抗体滴度及甲状腺病理检查确诊。健康人25例(男7例，女18例)，均无甲状腺疾病史及家族史，甲状腺功能测定在正常范围。 2.方法：(1)基因组DNA的提取：采外周血5 ml(ACD抗凝)，分离单个核细胞，饱和酚/氯仿抽提基因组DNA。(2)聚合酶链式反应(PCR)：引物1：上游引物5'-TCCCG～GGTCTCCTTTGGCCT-3'(position 5-24)，下游引物5'-GGTACTCACAGAGTCTGCGT-3'(position 269-259及9个第1号内含子碱基序列)，扩增第1号外显子，长度274bp。引物2：上游引物5'-ATCCTTGAGTCCTTGATGTG-3'(position 982-1001)，下游引物5'-TACTCTTCTGAGATTTGG～CC-3'(position 2375-2356)，扩增第10号外显子，长度1394bp(中科院微生物研究所合成)。反应体系50 μl，含模板DNA 200～500 ng，上下游引物各0.25 μmol/L，dNTP各200 μmol/L(SABC)，Taq DNA聚合酶1.25 U，10×PCR缓冲液5 μl,Mg2+ 1.5 mmol/L(上海生工)。循环参数设置：①扩增第1号外显子。94℃预变性90秒，94℃，60秒，55℃，60秒，72℃，60秒，30次循环，72℃后延伸5分钟。②扩增第10号外显子。94℃预变性90秒，94℃，60秒，55℃， 60秒，72℃，90秒，30次循环，72℃后延伸5分钟。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实。(3)限制性片段长度多态性分析(RFLP)：选取Taq Ⅰ(SABC)、Msp Ⅰ(SABC)、Hinf Ⅰ(MBI)、Bsr Ⅰ(MBI)四种限制性内切酶，对扩增产物进行酶切，琼脂糖凝胶电泳观察结果。 3.统计学处理：行列表χ2检验。
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MSRE-gPCR技术分析多基因DNA甲基化对肝细胞癌的诊断价值
背景与目的:DNA甲基化是潜在的肿瘤标志物.本研究运用自行建立的甲基化敏感性限制性内切酶一定量PCR(methylation-sensitive restriction enzymes-based quantitative PCR,MSRE-gPCR)方法检测肝细胞癌(hepatocellutar carcinoma,HCC)组织中多个基因的DNA甲基化状态,筛选可用于HCC诊断的DNA甲基化标志物组合.方法:以47对HCC患者癌组织和癌旁组织、8例正常人肝组织为材料,运用MSRE-gPCR方法检测这102例肝组织中APC、GSTPI、RASSFIA、p16、SFRP1、RUNX3、Hint1、SOCS1和HIC-1基因的启动子甲基化状态.结果:APC、GSTPI、RASSF1A、p16、SFRP1、RUNX3基因在肿瘤组织中的甲基化率分别为70.2%、70.2%、63.8%、29.8%、44.7%和36.2%,均显著高于对应癌旁组织(P均＜0.05);而Hintl、SOCSI和HIC-1基因甲基化水平在HCC肿瘤和癌旁组织间无显著差异.联合检测APC、GSTP1、RASSF1A和SFRP1 4个靶点,可检出所有HCC病例.这些基因的甲基化水平与患者肿瘤大小、分化、包膜及HBV感染等临床病理参数均无显著相关性.结论:联合检测APC、GSTPI、RASSFIA和SFRPI的DNA甲基化状态对于HCC风险评估和分子诊断具有重要价值.
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血浆Ras相关区域家族蛋白1A基因甲基化在肝细胞癌分子诊断中的价值
目的:建立一种可检测微量DNA标本中DNA甲基化的甲基化敏感性限制性内切酶-定量PCR(methylation-sensitive restriction enzymes-based quantitative PCR,MSRE-qPCR)方法,并运用该技术探讨血浆Ras相关区域家族蛋白1A(Ras association domain family 1A,RASSFL4)基因甲基化检测在肝细胞癌(hepatocellutarcarcinoma,HCC)非侵入性诊断中的价值.方法:用MSRE Hba I消化DNA样品,再用qPCR技术分析酶切结果,建立检测RASSF1A基因甲基化的MSRE-qPCR方法.以45例肝组织(20对HCC患者手术切除肿瘤标本及匹配非癌组织和5例正常肝)为材料,测试该方法的应用价值;运用亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)技术进行进一步验证,并与甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)方法相比较.再运用该技术检测150例血浆标本(包括72例HCC患者、37例肝硬化或慢性肝炎等良性病变患者和41例健康对照)的RA88F1A基因甲基化状态,并分析其与HCC患者临床病理参数的关系.结果:MSRE-qPCR法可定量检测低至1%以下的RASSF1A甲基化片段.20例HCC组织中有14例(70%)发生RASSF1A高甲基化,对应非癌组织中RASSF1A甲基化阳性率为25%,而5例正常肝组织均为阴性.MSRE-qPCR结果经BSP验证无误,且与MSP检测结果具有较好的一致性.HCC患者血浆RA88F1A甲基化阳性率(47/72,65.3%)显著高于健康对照(1/41,2.4%)和肝良性病变组(3/37,8.1%),差异均有统计学意义(P<0.000 1).联合检测血浆RASSF1A甲基化与血清AFP可显著提高HCC诊断效率.结论:建立的MSRE-qPCR方法要求样本少、操作简便、成本低廉,可定量检测RASSF1A基因甲基化水平.血浆RA88F1A甲基化分析对于HCC的非侵入性诊断具有重要价值.
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腺瘤性结肠息肉病基因甲基化在肝细胞癌分子诊断中的价值
目的:建立甲基化敏感性限制性内切酶-定量PCR (methylation-sensitive restriction enzyme-quantitative PCR,MSRE-qPCR)方法,并应用该方法探讨血浆腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)基因甲基化检测在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)诊断中的应用价值.方法:用Hha Ⅰ消化DNA样品,qPCR 技术评估酶切效率,建立优化的MSRE-qPCR方法.用MSRE-qPCR法检测45例肝组织(20例HCC及其相应匹配的非癌组织和5例正常肝组织)中APC甲基化水平；应用亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)对MSRE-qPCR检测结果进行验证,并与甲基化特异性PCR (methylation-specific PCR,MSP)检测方法比较.运用MSRE-qPCR技术检测72例HCC、37例肝良性病变和41例健康志愿者血浆标本的APC甲基化状态.结果:建立的MSRE-qPCR方法可定量检测低至1％的APC甲基化片段.MSRE-qPCR和MSP检测结果均显示,HCC组织中APC基因发生高频率甲基化.MSRE-qPCR检测结果经BSP验证准确无误,且与MSP检测结果具有较好的一致性(Kappa=0.955,P＜0.000 1).HCC患者血浆APC甲基化水平高于肝良性病变及健康志愿者(P＜0.000 1).血浆APC甲基化分析与血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)联合检测可提高HCC诊断效率.结论:MSRE-qPCR可定量检测APC甲基化水平.血浆APC甲基化分析对于HCC的非侵入性诊断具有重要价值.
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红花cDNA-AFLP限制性内切酶的选择及银染体系的建立
目的:建立适于红花cDNA-AFLP分析酶切组合及银染技术体系,为进一步进行红花重要性状相关基因研究奠定基础.方法:对PstI/MseI和MseI/EcoRI两种限制性内切酶组合酶切效率进行比较,并探讨测序板处理中亲和硅烷和剥离硅烷的用量、测序胶中TEMED的用量、预电泳、温度因素、显色液的配置等银染过程中较关键的几个因素.结果:选用PstI/MseI限制性内切酶组合酶切效率较高,测序板应彻底清洁,TEMED量应适中,应进行30 min预电泳,整个铺板电泳过程保持温度恒定,选用4 ℃冷藏的碳酸钠做显色液效果好,综合以上几方面能显著提高胶图的质量.结论:本研究建立了适于红花的cDNA-AFLP银染体系,PstI/MseI较MseI/EcoRI酶切组合具有更高的多态性率,能更全面地揭示红花研究材料间更为丰富的遗传变异性;银染过程中成功克服了以往试验中常见的撕胶、背景太深、条纹不清晰等问题.
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PCR和限制性内切酶在uPA-SCID小鼠基因型鉴定中的应用
目的 建立一种简便、快捷、准确的基因型鉴定方法用于uPA-SCID小鼠的基因型鉴定.方法 应用PCR技术与限制性内切酶相结合的方法检测uPA-SCID小鼠的基因型.结果 uPASCID小鼠的uPA基因型鉴定结果显示:uPA基因野生型在153 bp有条带,纯合子在337 bp有条带,杂合子在337bp、153bp有条带.uPA-SCID小鼠的SCID基因型鉴定结果显示:uPA-SCID小鼠SCID基因突变体在38 bp、26 bp有条带,杂合子在64 bp、38 bp、26 bp有条带,野生型在64 bp有条带.结论 建立的基因型鉴定方法简便易行、可靠,通过该方法可以确定uPA-SCID小鼠的基因型,筛选出需要的纯合子uPA-SCID小鼠.
关键词： uPA-SCID小鼠 基因型鉴定 聚合酶链反应(PCR) 限制性内切酶 -
分子生物学与营养研究
20世纪50年代J DWatson和F Crick关于DNA双螺旋模板学说的提出，60年代J Monad和F Jacod关于基因调控操纵子学说的出现，以及70年代初期DNA限制性内切酶的发现和一整套DNA体外重组技术--基因工程技术的发展，推动了分子生物学的迅猛发展。它使整个生命科学的研究上升到一个全新的阶段。分子微生物学、分子免疫学、分子生理学、分子病理学、分子药理学、分子心脏病学、分子神经病学、分子内分泌学，以及分子营养学等边缘学科应运而生。分子营养学可以理解为：从分子水平研究营养学的一门学科。当今分子生物学与营养研究的热点主要有三个方面：基因表达的营养调控，营养与遗传变异，生物技术与营养。
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关于N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因家族cDNA扩增的初步研究
目的通过实验方法扩增N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因家族cDNA.方法主要通过PCR技术,用各种N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因家族cDNA的特异性引物进行扩增并结合电泳技术,用不同的限制性内切酶进行酶切鉴定.结果通过电泳图谱和酶切图谱初步证实了这一家族的不同成员均已得到有效的扩增.结论成功扩增了N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因家族cDNA,并为其文库的建立打下良好的基础.
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皮肤鳞状细胞癌中p16基因甲基化的研究
近年来研究显示,p16基因第1外显子5'CpG岛的高甲基化在多种肿瘤的发生发展中起重要作用[1],特别是在一些过去未发现有p16基因缺失与突变的肿瘤中也发现由p16基因甲基化而引起的基因失活.我们应用限制性内切酶-PCR法对40例原发性皮肤鳞状细胞癌(鳞癌)组织和10例正常皮肤组织进行p16基因甲基化的检测,以探讨皮肤鳞癌的发生发展是否与p16基因甲基化有关.
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线粒体脑肌病患者线粒体DNA突变分析
目的:分析线粒体脑肌病患者骨骼肌细胞线粒体DNA的突变情况,为疾病诊断提供依据.方法:用常规苏木精-伊红(H-E)、酶组织化学染色和电镜检查等方法对线粒体脑肌病进行诊断,用聚合酶链反应(PCR)/限制性内切酶酶切方法对线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征(MELAS)和肌阵挛性癫痫伴肌红纤维断裂综合征(MERRF)的患者进行线粒体基因分析.结果:3例患者均被确诊为线粒体脑肌病,其中例1和例2 tRNAleu基因发生A3243G杂合突变,例3发生A8344G杂合突变.结论:线粒体DNA中的tRNA基因突变,是线粒体脑肌病的重要病因之一.
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用连续长片段RT-PCR扩增HCV结构基因
目的与方法:使用连续长片段RT-PCR,扩增HCV的结构基因.结果:利用连续长片段RT-PCR技术,结合热启动和两段PCR一次扩增出长2.3kb的HCV结构基因和部分调控序列,并用测量分子质量和限制性酶切的方法进行了鉴定.结论:利用长片段RT-PCR可一次扩增出C、E1、E2基因和部分5'-NTR.
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杭州地区肥胖儿童的ApoE基因HhaI酶切位点多态性研究
相关研究表明,载脂蛋白E(ApoE)基因的多态性影响血脂水平,特别是血清胆固醇水平,与儿童高血脂、冠心病(coronary heart disease,CHD)等多种疾病有关[1].我们利用PCR限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术对来我院就诊的杭州地区肥胖儿童的ApoE基因的多态性进行分析,并检测其血脂水平,以便找出其与儿童肥胖的关系.
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物种的学名与限制性内切酶正斜体表达
菌株的属名、种名(包括亚种、变种)用拉丁文斜体，如结核分枝杆菌( Mycobacterinum tuberculosis)；属的首字母大写，其余小写，属以上用拉丁文正体。
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弓形虫不同地理株致密颗粒蛋白基因的比较研究
目的比较弓形虫不同地理株(RH株、ZS2株、GT株)GRA7基因的异同.方法从弓形虫不同地理株的基因组DNA中扩增出GRA7基因,对目的基因用限制性内切酶(Esp3I、 CfrI、MboI)酶切并比较.结果 PCR扩增出3株弓形虫的目的基因片段大小均在500bp-750bp之间,约711bp.三种限制性内切酶酶切片段的大小均与理论值相符.结论弓形虫不同地理株GRA7基因具有高度保守性.
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弓形虫非同源性不同地理株的GRA1基因体外扩增片段的鉴定及比较研究
目的对弓形虫人源性RH株、人源性ZS2株、猪源性CN株3个不同地理株的GRA1基因片段鉴定并比较异同.方法采用PCR技术和限制性内切酶技术,分别对弓形虫3株的GRA1基因片段进行体外扩增.扩增的目的基因片段分别用3种内切酶HindⅢ、HpaⅡ、TaqⅠ进行单酶切鉴定、比较.结果从弓形虫3个分离株RH株、ZS2株、CN株基因组DNA中扩增出785bp的GRA1基因片段.3个株的GRA1基因分别用3种内切酶酶切后,酶切片段与理论值相符.结论实验所用不同来源弓形虫分离株的GRA1基因扩增片段基本相同,且3种限制性内切酶酶切图谱基本一致,表明这3个分离株的GRA1基因高度保守.
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弓形虫RH株SAG2基因片段的克隆、表达、纯化与鉴定
克隆弓形虫RH株膜表面抗原2(SAG2)编码基因,构建原核重组表达质粒PET23a-SAG2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达及纯化SAG2蛋白.PCR扩增503bp的SAG2编码基因目的片段,胶回收纯化,插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DH5α.限制性酶切分析及测序鉴定后以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切pMD-18T-SAG2质粒与表达质粒载体Pet23a的BamHⅠ和SalⅠ多克隆位点,构建重组体Pet23a-SAG2,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,以限制性酶切分析鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达.表达产物经金属鏊合层析纯化.用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达与纯化产物.PCR扩增出约503bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符;所构建的PET23a-SAG2重组体阳性克隆经双酶切与测序鉴定,与预期结果一致.SDS-PAGE与免疫印迹显示,表达产物约18kD.成功构建PET23a-SAG2表达质粒,诱导表达并纯化出了弓形虫RH株SAG2蛋白,并以免疫印迹鉴定.
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间日疟原虫MSP1 C端基因亚克隆及在E.coli中的融合表达
在大肠杆菌(E.coli)中融合表达间日疟原虫MSP1C端编码基因,以获得能作为检测抗原的重组蛋白GST-PvMSP1 C.方法:以限制性内切酶BamH Ⅰ和Sa1Ⅰ双酶切质粒pMD/PvMSP1 C,获得间日疟原虫MSP1 C端编码基因片段,柱纯化后,插入表达质粒载体的多克隆位点,构建重组体pGEX-4T-2/PvMSP1C,并转化大肠杆菌BL21(DE3),阳性克隆以限制性酶切分析鉴定后,以IPTG进行诱导表达,表达产物以SDS-PAGE电泳与免疫印迹分析.双酶切质粒pMD/PvMSP1 C,获得1119bp的PvMSP1 C编码基因片段,与预期片段大小相符;所构建的pGEX-4T-2/PvMSP1 C重组体阳性克隆经双酶切鉴定与预期结果一致;SDS-PAGE电泳显示,GST-PvMSP1 C融合表达蛋白的大小约63ku,且能够分别被GST抗体与间日疟患者的血清所识别.成功亚克隆并构建了间日疟原虫MSP1 C端编码基因pGEX-4T-2/PvMSP1 C表达质粒,诱导表达了GST-PvMSP1C融合蛋白,表达蛋白具有一定免疫活性.
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载脂蛋白B基因EcoR I 位点多态性对儿童血脂及肾功能的影响
目的 探讨载脂蛋白B(ApoB)基因EcoR I 位点多态性对儿童血脂及肾功能的影响.方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术结合测序的方法确定70例健康体检儿童ApoB基因EcoR I位点的基因型,同时计算体质量指数(BMI),检测血清脂蛋白a(Lpa)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、非高密度脂蛋白胆固醇(non-HDL)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、ApoA1、ApoB、ApoA1/B、尿素氮(BUN)、肌酐(Ccr)及尿酸(UA)水平.结果 1.EcoR I位点各基因型频率分别为E+/E+:72.875%,E+/E-:18.571%,E-/E-:8.571%,等位基因E+与E-的频率分别为82.143%和17.857%;2.各基因型组间比较结果显示血清Lpa、TC、HDL-C、ApoA1和BUN组间差异具有统计学意义(P＜0.05);3.E+/E-组血清TC、HDL-C和ApoA1水平显著高于E+/E+组(P＜0.01);E-/E-组BUN显著高于E+/E+组(P＜0.01);E-/E-组Lpa和ApoA1明显低于E+/E-组(P＜0.05),但BUN明显较E+/E-组升高(P＜0.05);4.等位基因E-组血清TC、HDL-C、LDL-C和BUN明显高于E+组(P＜0.05).结论 ApoB基因EcoR I 位点多态性可能通过调控血脂代谢进而对肾功能构成的影响.
