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克里米亚-刚果出血热病毒特征核酸序列克隆载体的构建
[目的]构建含有克里米亚-刚果出血热病毒特征序列的克隆载体.[方法]设计RT-PCR引物及反应体系,从克里米亚-刚果出血热病毒RNA中扩增获得目的序列,进行分离纯化和回收,将纯化的扩增片段与pMD18-T载体进行连接,进行酶切鉴定与测序鉴定.[结果]确定检测克里米亚-刚果出血热病毒一步法RT-PCR的反应条件及体系,引物终浓度为400nmol/L,反应条件为:50℃ 30 min,94℃4 min,94℃ 30s,57℃ 30 s,72℃30 s,35cycles.成功将CCHF的特征序列片段克隆,pMD18-T载体经DNA测序鉴定正确.[结论]构建的pMD18-CCHF质粒,可用于克里米亚-刚果出血热病毒RT-PCR实验的阳性对照.
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T载体克隆在病毒样颗粒表达载体构建中的应用
目的提高带某些限制酶切位点聚合酶链反应(PCR)扩增产物克隆入表达载体的效率.方法将带Hind Ⅲ酶切位点的PCR扩增产物与T载体连接,转化BL21-DE3 E.Coli,提取质粒后,用Hind Ⅲ酶切,电泳分离并提取纯化的目的片段.然后,与经过相同的限制性酶酶切的表达载体pNCCL1连接. 结果经T载体克隆酶切构建的内含严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)核酸的病毒样颗粒表达载体,方法简单快速,每次均可获得成功.而采用直接酶切扩增产物的构建方法,未获得成功构建的表达载体.结论 T载体克隆可用于对直接酶切效果不好(如Hind Ⅲ)的PCR扩增片段的表达载体的连接构建,方法简便高效.
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层粘连蛋白-5γ2链Ⅳ功能区基因克隆及蛋白表达
层粘连蛋白-5(LN-5)是层粘连蛋白家族中一员,是1个α3、β3和γ2 3条多肽链经二硫键结合的"Y"字型糖蛋白分子.该蛋白在皮肤修复与移植、肿瘤发生与迁徙中起重要作用,遗传性大疱性表皮松懈症(JEB)与该多肽链结构的基因突变有关[1-3].γ2链IV功能区对LN-5分子在细胞黏附过程中起关键性作用[4].为探讨该功能区是否为LN-5小黏附功能单位,是否可替代LN-5检测指标,本研究构建含γ2链IV功能区基因克隆载体,并对该蛋白进行原核表达.
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噬菌体展示技术筛选HBV前-前-S抗原基因启动子结合蛋白基因
目的:筛选乙型肝炎病毒(HBV)前-前-S抗原基因启动子的结合蛋白.方法:应用噬菌体表面展示技术,以HBV前-前-S抗原基因启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮"黏附-洗脱-扩增"的筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,并对所筛选克隆进行DNA测序和生物信息学分析.结果:噬菌体经富集后,从随机筛选的43个克隆中得到20个与HBV前-前-S抗原基因启动子特异结合的阳性克隆,包括人类SMG-1的磷脂酰肌醇3相关激酶激酶、28S核糖体、单倍型As2A线粒体、组氨酰-tRNA合成酶、脂肪醛脱氢酶、桥粒相关蛋白、MAX相互作用蛋白1等17个已知功能基因及3个未知功能基因.结论:用噬菌体人肝细胞cDNA文库筛选得到HBV前-前-S抗原基因启动子的结合蛋白基因,为进一步研究HBV发病机制创造了新的途径.
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人hTERT正反义逆转录病毒表达载体的构件建和鉴定
目的:构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)正、反义逆转录病毒表达载体.方法:采用基因重组技术,用限制性内切酶EcoRI将hTERT基因从克隆载体pGRN-145上酶切下,并将其正向及反向克隆到去磷酸化逆转录病毒载体pLXSN中,NotI和XhoI酶切鉴定结果结果:经NotI和XhoI双酶切后,正义重组质粒被切成1438和7838bp两个片段,反义重组质粒被切成1438、1992和5898bp三个片段,与理论计算长度相符.结论:成功构建了hTERT正、反义逆转录病毒载体.
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应用噬菌体展示技术筛选HBsAg启动子I的DNA结合蛋白
目的:通过筛选HBsAg基因启动子I(SPI,surface promoter I)结合蛋白,为HBV复制机制的研究探索新的途径.方法:应用噬菌体展示技术,以HBsAg基因启动子I的聚合酶链反应(PCR)产物DNA作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮"黏附-洗脱-扩增"筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索.结果:噬菌体经富集后,从随机筛选的14个克隆中得到8个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了和HBV表面抗原基因启动子I特异结合的肝细胞蛋白,共编码7种蛋白.其中3个克隆编码未知功能蛋白;其余的克隆分别编码4-氨基丁酸氨基转移酶、触珠蛋白、复制蛋白等蛋白.结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HBsAg基因启动子I的结合蛋白,分析了该蛋白的编码基因.
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HBV PreS2S/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达
目的:构建含HBV PreS2S和Fc融合基因的真核表达载体pcDNA3 S2S/Fc并在真核细胞中进行表达.方法:应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlappingextension,简称SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段S2S/Fc,回收后克隆到pGEM-T Easy TA克隆载体,获得合适的酶切位点,再采用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA3中,得到真核重组载体pcDNA3 S2S/Fc.然后用脂质体法转染SP2/0细胞.结果:对重组载体进行了限制性酶切鉴定及测序分析,证明连接正确;经间接免疫荧光检测正实该重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白.结论:真核表达载体pcDNA3 S2S/Fc的成功构建及在SP2/0细胞中的有效表达,为进一步探讨HBV感染的特异性生免疫治疗提供了实验依据.
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bFGF基因转染对成骨细胞生物学行为的影响
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是调控成骨细胞增殖和分化的首选生长因子之一,而且还是一种强大的毛细血管增殖刺激剂。但外源性生长因子半衰期短,需反复给药,且价格昂贵[1,2]。我们将bFGF基因由体外转入兔骨膜源成骨细胞,观察了其对成骨细胞生物学的影响,报告如下。1.材料与方法:含有bFGF cDNA的克隆载体puc13-rbFGF由日本Inawashiro博士惠赠,用EcoR I酶切puc13-rbFGF及真核表达载体pcDNA3,用T4DNA连接酶连接后构建pcDNA3-bFGF重组表达质粒并鉴定。无菌条件下取2个月龄新西兰兔之双侧股骨和胫骨骨膜,37℃下用0.25%胰蛋白酶和0.1%I型胶原酶各消化30min及2 h,将分离细胞接种于50ml培养瓶,加入含15%胎牛血清、10-7 M地塞米松、50mg/L维生素C、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基,在37℃5%CO2培养箱培养,用钙钴法行碱性磷酸酶(ALP)染色对培养细胞进行鉴定。
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中国红豆杉紫杉烯合成酶cDNA克隆(简报)
紫杉烯合成酶(taxadiene synthase)是抗癌药物紫杉醇生物合成途径的第一个酶,也是关键酶,在红豆杉植物体内催化生成紫杉醇的母核--紫杉烯;它在植物体内低水平的表达和低酶活力被认为是紫杉醇在植物体内含量低微的重要因素.Wildung等已经得到了太平洋红豆杉(Taxus brevifolia)紫杉烯合成酶的cDNA及其核苷酸顺序,长度为2 700 bp,开放阅读框架为2 586 bp,其中包括编码137个氨基酸残基的质体转移肽和725个氨基酸残基的紫杉烯合成酶肽链.我们过去的研究得到一中国红豆杉(T.chinensis)高产紫杉烷类化合物的愈伤组织细胞系,并构建了它的cDNA文库,克隆载体为λgt10.
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副溶血弧菌tlh基因克隆载体和表达载体的构建
目的构建含副溶血弧菌(vibrio parahaemolyticus,VP)tlh基因克隆载体和表达载体,检测并鉴定表达载体在转化菌的表达,为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究不耐热性溶血毒素(TLH)的功能奠定基础.方法根据Genbank的tlh全基因序列,设计一对附加EcorⅤ和HindⅢ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物,以VP基因组DNA为模板,用高保真Taq酶扩增出tlh基因.连接pGEM-T载体构建克隆载体,测序鉴定后,再用EcorⅤ和HindⅢ酶切回收目的基因并克隆至表达载体pET32a+,采用PCR和双酶切鉴定筛选阳性质粒,转化DE-3,IPTG诱导,用SDS-PAGE检测tlh的表达.结果扩增的目的基因与GenBank的tlh比较具有99%的同源性,重组表达载体转化DE-3,能表达融合蛋白.结论本研究成功扩增出完整的tlh基因,构建了克隆载体和表达载体,获得融合表达的目的蛋白.
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复合通用CD4+ T辅助细胞表位基因克隆载体的构建及测序
目的 构建复合通用CD4+T辅助细胞表位基因克隆载体,并进行测序.方法 由DNA work2.0软件设计并人工合成20条55个碱基的寡核苷酸序列,利用套叠PCR技术人工合成全基因序列,并克隆至pUC19载体,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,酶切鉴定并进行测序.结果 经PCR扩增出645bp的目的DNA片段.酶切鉴定筛选出8个阳性克隆,经测序获得一个序列完全正确的克隆.结论 已成功构建了复合通用CD4+T辅助细胞表位基因克隆载体,为研究表位疫苗和细菌多糖结合疫苗提供了新的载体表位.
关键词: 通用CD4+ T辅助细胞表位 克隆载体 构建 测序 -
弓形虫主要表面抗原P30基因的扩增及其克隆载体的构建
弓形虫是人和几乎所有动物的有核细胞内的专性寄生虫.成人感染后一般为无症状带虫状态,先天性感染能导致流产、畸胎或死胎,恶性肿瘤及艾滋病后继发的弓形虫机会性感染往往是导致死亡的重要原因[1].
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SARS冠状病毒M蛋白全长基因的克隆、表达与纯化
克隆SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列,构建原核重组表达质粒PET23a-M,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达、纯化.表达产物用WesternBlot检测其抗原性.RT-PCR扩增M编码基因目的片段,胶回收纯化,插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DH5α.
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弓形虫RH株SAG2基因片段的克隆、表达、纯化与鉴定
克隆弓形虫RH株膜表面抗原2(SAG2)编码基因,构建原核重组表达质粒PET23a-SAG2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达及纯化SAG2蛋白.PCR扩增503bp的SAG2编码基因目的片段,胶回收纯化,插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DH5α.限制性酶切分析及测序鉴定后以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切pMD-18T-SAG2质粒与表达质粒载体Pet23a的BamHⅠ和SalⅠ多克隆位点,构建重组体Pet23a-SAG2,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,以限制性酶切分析鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达.表达产物经金属鏊合层析纯化.用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达与纯化产物.PCR扩增出约503bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符;所构建的PET23a-SAG2重组体阳性克隆经双酶切与测序鉴定,与预期结果一致.SDS-PAGE与免疫印迹显示,表达产物约18kD.成功构建PET23a-SAG2表达质粒,诱导表达并纯化出了弓形虫RH株SAG2蛋白,并以免疫印迹鉴定.
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风疹病毒包膜糖蛋白E1酵母表达载体的构建
目的:构建风疹病毒包膜糖蛋白E1的全基因片段的克隆载体和酵母表达载体.方法:应用PCR方法扩增糖蛋白E1的全长基因,并在基因两端创建相应的酶切位点.E1基因与pBluscriptⅡSK+载体均经双酶切后连接,转化大肠杆菌JM109,经氨苄筛选和蓝白斑筛选并测序,建立了克隆载体pBluscriptⅡSK+-E1;克隆载体与表达载体pGAPZαA双酶切后连接,转化大肠杆菌JM109,经Zeocin筛选并测序.结果:PCR扩增后出现一条1.5kb的条带,体外重组技术重组于重组质粒pBluscriptⅡSK+和pGAPZαA后,经PCR、EcoRⅠ及XbaⅠ双酶切均出现相应长度的片段,测序证实为包膜糖蛋白E1的基因.结论:成功构建了含有风疹病毒包膜糖蛋白E1全基因的克隆载体及酵母表达载体.
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PDX-1基因克隆载体的体外构建
目的:体外构建胰-十二指肠同源框-1( PDX-1)基因的克隆载体。方法采用TRIzol方法从大鼠胰岛细胞瘤细胞株中提取RNA,通过RT-PCR方法在体外扩增大鼠PDX-1 cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定,割胶纯化后回收目的基因,与pMD-18T克隆载体连接构建,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定pMD-18T-PDX-1的正确构建。结果正确构建了含有PDX-1 cDNA的克隆载体pMD-18T-PDX-1,其中PDX-1 cDNA全长为908 bp。将经双酶切鉴定正确的pMD-18T-PDX-1细菌克隆进行测序,测定结果与GenBank中大鼠PDX-1基因序列(NM_022852.3)一致。结论成功构建了PDX-1基因克隆载体。该载体可为PDX-1基因分子生物学研究及PDX-1基因在诱导非β细胞向胰岛素分泌细胞分化中作用机制的研究提供基础。
关键词: 胰-十二指肠同源框-1 cDNA 胰岛细胞瘤 克隆载体 -
卡介苗热休克蛋白16.3基因的克隆与原核表达
目的 克隆卡介苗(BCG)的热休克蛋白16.3基因(hsp16.3),并在大肠杆菌中表达.方法 利用PCR技术从BCG中扩增hsp16.3基因,并将其克隆到质粒pProEX HTb中,进行测序.将得到的重组表达质粒pProEX HTb-hsp16.3在大肠杆菌BL21中进行表达.结果 成功地克隆了BCG hsp16.3基因.经DNA测序证实,与Gen Bank公布的序列一致.含pProEX HTb- hsp16.3重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后,能够表达相对分子质量约为16KDa的融合蛋白.结论 获得了BCG hsp16.3基因,成功构建原核表达质粒pProEX HTb- hsp16.3,并在大肠杆菌得到高效表达.
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西尼罗Ⅰ型病毒亚克隆的构建及其鉴定
目的 构建西尼罗病毒基因组的cDNA亚克隆,为西尼罗病毒全长cDNA克隆的研发和应用打下基础.方法 根据基因组中限制性酶切位点的分布设计4对引物,QIAamp RNA抽提试剂盒提取西尼罗病毒培养细胞BHK-21的总RNA,长片段RT-PCR技术扩增目的 基因片段.将目的 基因片段与pMD18-T载体进行连接,转化入感受态细胞E.coli DH5α,进行蓝白斑筛选后得到阳性克隆,将重组质粒进行PCR和测序鉴定.结果 获得的目的 基因片段经PCR和测序结果表明西尼罗病毒功能基因正确地克隆进入载体.结论 成功获得西尼罗Ⅰ型病毒功能基因的cDNA亚克隆,可应用于西尼罗病毒全长cDNA克隆的制备.
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重组人TFF2乳酸链球菌表达载体pTRTFF2的构建
目的 构建带c-myc分子标签的人三叶因子家族2(hTFF2)融合基因c-myc-hTFF2的乳酸链球菌表达载体,以便进一步构建能表达活性c-myc-hTFF2融合蛋白的乳酸链球菌工程菌.方法 根据hTFF2的氨基酸表达序列和乳酸链球菌的氨基酸密码子,以c-myc作为分子标签,设计c-myc-1 TFF2的cDNA序列,并在其5'端和3'端添加SalⅠ和BamHI酶切位点;将目的基因片段设计成14个相互互补的寡核苷酸,经聚合酶链式反应,得到目的基因c-myc-hTFF2;将c-myc-hTFF2连入pBluescriptⅡsk(+)载体,构建其克隆载体pBS-TFF2并进行酶切鉴定及DNA测序;分别用SalⅠ/BamHI和XhoⅠ/BamHI对pBS-TFF2和pNBC1000进行双酶切反应,再通过连接反应将c-myc-hTFF2融合基因插入pNBC1000,构建c-myc-hTFF2大肠杆菌表达载体(pNTFF2);用XbαⅠ对pNTFF2和穿梭载体pTRKH2单酶切反应,并通过连接反应将c-my-hTFF2的表达载体连入穿梭载体pTRKH2,完成乳酸链球菌表达载体pTRTFF2的构建,并进行酶切鉴定.结果 成功构建了c-myc-hTFF2的乳酸链球菌表达载体pTRTFF2.结论 体外基因拼装是构建目的基因有效的方法;pTRTFF2的构建为构建乳酸链球菌工程菌奠定了基础.
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含人甲胎蛋白mRNA部分序列的耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达
原发性肝癌为一种严重威胁人们健康的恶性肿瘤.甲胎蛋白(AFP)mRNA在监测原发性肝癌的肝外转移以及术后复发方面是一个很好的标志物,也可用于肝癌治疗效果的评价.通常AFP mRNA的检测方法为逆转录巢式聚合酶链反应(RT-PCR)法进行定性检测,或利用凝胶电泳扫描的方法进行半定量检测.近来随着实时荧光PCR技术的发展使得准确定量检测AFP mRNA成为可能.