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5-氮杂胞苷影响LjFNSⅡ1.1和LjFNSⅡ2.1催化金银花木犀草素和木犀草苷合成机制的研究
该研究通过对金银花叶片进行不同时间(1,2,3d)与不同浓度(20,40,60,80,100 μmol·L-1)的5-氮杂胞苷处理,探索5-氮杂胞苷影响黄酮合酶FNSⅡ催化木犀草素和木犀草苷合成的机制.首先对LjFNSⅡ1.1,LjFNSⅡ2.1进行克隆;其次UPLC-MS/MS测定金银花叶中木犀草素与木犀草苷的含量,以及Real-Time PCR分析LjFNSⅡ1.1,LjFNSⅡ2.1的表达水平,结果表明LjFNSⅡ1.1,LjFNSⅡ2.1基因的表达水平与木犀草素的含量变化趋势大体一致,但与木犀草苷的含量变化相关性不显著;同时发现二者之间的表达水平略有差异.研究结果表明,5-氮杂胞苷处理金银花叶片后,LjFNSⅡ1.1,LjFNSⅡ2.1的表达水平上升,从而调控木犀草素和木犀草苷的含量升高,为研究LjFNSⅡ1.1,LjFNSⅡ2.1催化木犀草素和木犀草苷合成机制提供技术支撑和理论基础.
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人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化
目的 讨论小型猪心肌细胞(CMs)裂解液对人骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外诱导分化作用.方法 用5-aza、小型猪CMs裂解液二种方法体外诱导人MSCs的分化,单纯培养基(DMEM)培养为对照组,观察细胞形态改变.用细胞免疫化学、免疫荧光法检测MSCs的α-actin、cTnT、Cx43和CD31的表达,MTT法测定细胞增殖.结果 小型猪CMs裂解液诱导人MSCs所得心肌样细胞(CLCs)表达cTnT、Cx43和CD31;5-aza诱导组MSCs表达cTnT和Cx43,不表达CD31;5-aza培养初期对MSCs的增殖具有明显的抑制作用,CMs裂解液促进MSCs的增殖.结论 小型猪CMs裂解液培养基可以诱导人MSCs分化为心肌样细胞及内皮样细胞,并且具有很强的促细胞增殖作用,优于目前广泛研究的肌细胞诱导分化剂5-aza.本研究为大规模诱导人MSCs向CMs分化创造了条件.
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大鼠MSCs诱导分化为心肌样细胞时离子通道基因的表达
目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外向心肌样细胞分化过程中L-型钙通道(α1C)和瞬间外向钾通道(kv4.3)基因的表达.方法 无菌条件下冲洗Wistar大鼠双侧股骨和胫骨的骨髓腔获得MSCs,体外培养传代纯化,5-氮杂胞苷(5-aza)诱导24 h,显微镜下观察诱导前后形态变化,RT-PCR鉴定α1C和kv4.3基因的表达.结果 kv4.3基因诱导前有弱的表达,诱导后1、4、7和14 d表达明显逐渐增强(P＜0.05);α1C基因诱导前有较强的表达,诱导后1、4、7和14 d表达却明显逐渐减弱(P＜0.05).结论 α1C和kv4.3基因在维持MSCs的诱导分化过程中发挥重要作用.
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骨髓间质干细胞体外转分化为肌细胞的实验研究
研究骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为肌源性细胞的可行性.由新西兰大白兔胸骨获取骨髓间充质干细胞,纯化培养后用不同浓度的5氮杂胞苷(5-azacytidine)诱导,用透射电镜、免疫组化、动作电位、cTnI(肌钙蛋白)检测、Ach(乙酰胆碱)刺激后的反应等鉴定诱导后细胞.结果显示经5-氮杂胞苷诱导后的骨髓间充质干细胞在透射电镜下可以观察到细胞内有明显的肌丝,免疫组化可见细胞被抗肌红蛋白抗体着染显色,电生理检查表明诱导后细胞是可兴奋细胞,可检测到cTnI,Ach刺激后细胞表现为舒张反应.我们认为骨髓间充质干细胞可在体外经5-氮杂胞苷诱导后转分化为肌源性细胞.
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人骨髓间充质干细胞的生物学特性及向神经前体细胞分化的实验研究
目的 观察体外培养的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的生物学特性,并探讨使其转分化为神经前体细胞(NPCs)的方法.方法以密度梯度离心和贴壁法相结合分离成人骨髓间充质干细胞,并观察细胞形态、生长、表面标记以及成骨和成软骨及成脂肪能力的情况.选用第3代细胞进行诱导,先经胚胎干细胞培养液扩增,再用加有5-氮胞苷和曲古菌素A的神经诱导液诱导,7d后,一部分样本进行Nestin、Sox2免疫荧光染色和RT-PCR检测;另一部分样本在含有B27的神经培养液中继续培养7d,然后进行NF-L的免疫荧光检测.结果分离培养的hMSCs纯度较高,CD29、CD44的阳性率均在90%以上;具有明显的成骨、成软骨和成脂肪能力;经5-氮杂胞苷和曲古菌素A作用后能向神经前体细胞分化,免疫荧光染色及RT-PCR结果显示,诱导后的细胞能特异性表达神经前体细胞标志物Nestin和Sox2;在神经培养液中继续培养后检测神经细胞标记物NF-L,可见较多阳性细胞.结论 hMSCs可在体外进行分离培养扩增,经药物修饰后具有向神经前体细胞分化的潜能.
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3种诱导法诱导CD73+脂肪间充质干细胞成心肌细胞效果的比较
目的 从脂肪来源的间充质干细胞(ADMSCs)的混合细胞群中分离纯化出CD73阳性的细胞亚群,证明几种不同诱导法诱导CD73细胞的成心肌分化潜能.方法 体外分离培养1～3月龄小鼠的ADMSCs,利用流式细胞仪从ADMSCs中分选出CD73+和CD73两个细胞亚群.分别培养两组细胞,利用5-氮杂胞苷(5-aza)、心肌组织裂解液和5-aza+心肌组织裂解液对两组分选出的细胞分别进行成心肌的诱导.利用免疫细胞化学技术检测3种诱导法的成心肌效果.结果 未分选的ADMSCs可分化为成脂和成骨细胞,分选的CD73+细胞具备分化为心肌细胞的良好潜能.3种诱导法均能诱导CD73+ ADMSCs向心肌方向分化,5-aza诱导CD73+ ADMSCs分化为心肌细胞率为(22.99±6.72)％,心肌组织裂解液组心肌细胞率(14.12±5.42)％,5-aza+心肌组织裂解液组心肌细胞率(26.94±6.11)％.3种方法比较,5-aza+心肌组织裂解液的诱导效果佳(P＜0.05).结论 CD73+比CD73的ADMSCs更易于分化为心肌细胞.化学诱导因素和体外模拟心肌微环境,可高效诱导脂肪间充质干细胞分化为心肌细胞.
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体外心肌细胞共培养诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化
目的 探讨体外心肌细胞间接接触共培养诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化的效果,以寻找佳的诱导条件.方法 2～3周龄SD大鼠24只和新生1～ 3d SD大鼠96只.分别通过全骨髓贴壁筛选法和差速贴壁法获取BMSCs和心肌细胞(CMs).根据诱导条件不同分成3组:A组:5-氮杂胞苷(5-Aza-CR)诱导组,取采用10μmol/L 5-Aza-CR避光诱导24h;B组:共培养CMs诱导组,实验开始时,CMs和BMSCs分开培养,待各自贴壁后进行共培养;C组:5-Aza-CR+共培养CMs诱导组,CMs接种于Transwell小室上层,下层接种5-Aza-CR诱导的BMSCs.在相差显微镜下连续观察各组BMSCs的形态变化,诱导至第2、4周时收集细胞.应用免疫组织化学法和免疫荧光方法检测诱导后的BMSCs α-横纹肌肌动蛋白(α-actin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达情况.结果 1.细胞形态的变化:B组细胞有聚集生长趋势,C组脱落或降解的细胞明显少于A组,但部分细胞内有脂肪空泡形成.2.免疫组织化学和免疫荧光检测结果均显示,诱导2周时,A、B、C组cTnT均呈阴性或低表达,α-actin均呈弱表达;诱导4周时各组cTnT和α-actin均呈阳性表达.A组cTnT阳性表达率和α-actin阳性表达率分别为(20.22±2.30)％和(28.05±2.45)％、B组为(21.18 ±1.30)％和(29.06±1.86)％、C组为(26.28±2.89)％和(33.91±2.18)％,且C组与A、B组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),但A组与B组组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 体外心肌细胞间接接触共培养可以诱导BMSCs向心肌样细胞分化,和5-Aza-CR共同诱导可提高诱导率.
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4株乳腺癌细胞中内皮素受体B基因的甲基化状态及对MCF-7细胞增殖的影响
目的 探讨内皮素受体B(EDNRB)基因在4株乳腺癌细胞中的表达、甲基化状态以及恢复EDNRB表达对MCF-7细胞增殖的影响.方法 采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)和亚硫酸盐测序法(BSP)分析4株乳腺癌细胞中EDNRB的甲基化状态;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测EDNRB mRNA的表达水平;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和集落形成实验检测EDNRB表达恢复对MCF-7细胞增殖的影响.结果 EDNRB在乳腺癌细胞MCF-7和ZR-75-1中表达缺失,并呈高甲基化状态;而在EDNRB表达高的MDA-MB-231细胞中其启动子呈低甲基化,表明乳腺癌细胞中EDNRB基因启动子甲基化状态与其表达成负相关.5-氮杂胞苷(5-Aza-CR)能够反转EDNRB基因的表达,EDNRB表达恢复后MCF-7细胞的增殖受到抑制.结论 EDNRB基因启动子区CpG岛频繁甲基化可能在乳腺癌发生发展中发挥重要作用,EDNRB有望成为乳腺癌早期诊断的新的分子标志物.
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心肌微环境与5-氮杂胞苷诱导脂肪间充质干细胞心肌分化的差异
目的 探讨体内心肌微环境及体外5-氮杂胞苷(5-aza)诱导脂肪间充质干细胞分化为心肌样细胞的作用差异.方法 取小鼠腹股沟的皮下脂肪组织,分离培养脂肪间充质干细胞(ADMSCs),对其进行表面标记和成骨、成脂分化能力鉴定.选取生长状态良好的第3代ADMSCs,分为5-aza体外诱导组、体内心肌移植组,体外诱导3周以及体内移植1周后,采用免疫荧光技术检测特异性心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达.结果 两种诱导方法ADMSCs均表达cTnT,5-aza诱导组3周表达率(33.33±3.79)％,移植组1周表达率(42.93 ±4.04)％,移植组1周较5-aza诱导组3周具有更高的分化效率(P＜0.05).结论 体外5-aza化学诱导和体内心肌微环境均可使ADMSCs分化为心肌样细胞,但心肌微环境的诱导分化效率明显高于5-aza的作用.
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硼替佐米联合5-氮杂胞苷对K562细胞凋亡和SHIP基因表达的影响
本研究旨在探讨硼替佐米联合5-氮杂胞苷对K562细胞凋亡和SHIP mRNA表达的影响.用不同浓度硼替佐米和5-氮杂胞苷处理K562细胞24 h,采用MTT比色法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,RTPCR法检测SHIP基因mRNA的表达.结果表明:5-20 nmol/L硼替佐米对K562细胞增殖均有一定抑制作用,并随着浓度增加抑制作用逐渐增强.硼替佐米和5-氮杂胞苷联合处理组对细胞的抑制作用比同剂量两药单用时都显著增强(P＜0.05).硼替佐米能促使K562细胞凋亡,且随浓度增加而凋亡增多,联合处理组对细胞的凋亡作用比同剂量单药作用时显著增强(P＜0.01).硼替佐米能下调K562细胞SHIP mRNA的表达,且随着药物浓度增加,表达逐渐降低,联合处理组与同剂量单药组相比更显著下调SHIP mRNA表达(P＜0.05).结论:硼替佐米或5-氮杂胞可以下调K562细胞中SHIP mRNA的表达,并可能通过此机制诱导K562细胞凋亡,两药具有协同作用.
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5-氦杂胞苷体外抗骨髓瘤细胞增殖及诱导凋亡的初步研究
本研究探讨5-氮杂胞苷对骨髓瘤细胞株中XAF1基因表达的影响及体外抗骨髓瘤细胞增殖效率.采用逆转录PCR方法检测骨髓瘤细胞株RPMI 8226和XG-7中XAF1基因的表达.采用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测XAF1基因CpG岛甲基化状态.采用0-5 μmol/L 5-氮杂胞苷处理骨髓瘤细胞株.采用CCK-8比色法检测5-氮杂胞苷处理对骨髓瘤细胞增殖抑制作用,应用Graphpad 5.0软件分析5-氮杂胞苷对骨髓瘤细胞的生长抑制作用.采用Annexin V/7-AAD染色流式细胞仪检测细胞凋亡.结果表明:XG-7细胞不表达XAF1 mRNA,RPMI8226细胞表达XAF1 mRNA转录本1和2.XG-7和RPMI 8226细胞株XAF1基因启动子CpG岛均存在过甲基化.XG-7和RPMI 8226细胞株经2.5 μmol/L 5-氮杂胞苷处理72 d、时后仅表达XAF1 mRNA转录本1,并且XAF1基因启动子CpG岛甲基化程度降低.5-氮杂胞苷抗骨髓瘤作用呈时间和浓度依赖性.5-氯杂胞苷处理48小时抑制XG-7骨髓瘤细胞株的IC50值为2.6 μmol/L.1.0、2.0、2.5、5.0 μmol/L浓度的5-氮杂胞苷处理XG-7细胞48小时后诱导细胞凋亡率分别为(34.3±8.0)%,(54.8±3.1)%,(64.1±3.4)%,(81.0±4.1)%.1.0-4.0 μmol/L5-氮杂胞苷与1.0-4.0 μmol/L亚砷酸联合应用具有协同抗骨髓瘤细胞作用,联合指数均小于1.0.结论:骨髓瘤细胞中XAF1表达缺失与启动子CpG岛过甲基化有关.5-氮杂胞苷在临床上能达到的药物浓度下具有抗骨髓瘤作用,其作用机制是诱导骨髓瘤细胞凋亡,与亚砷酸具有协同抗骨髓瘤作用.
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5-氮杂胞苷抑制血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大的作用研究
目的 探讨甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5-AZA-2'-dC)在血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的心肌肥大细胞的对肌浆网Ca2+-ATP泵(SERCA2a)表达等的影响.方法 培养SD大鼠乳鼠原代心肌细胞,根据处理方法,分为5组,分别为对照组、血管紧张素Ⅱ组、5-氮杂胞苷组、血管紧张素Ⅱ与5-氮杂胞苷同时处理组和5-氮杂胞苷预处理组;按照分组处理48 h后分别测定心肌细胞A型利钠肽(ANP)mRNA及蛋白表达、细胞面积等心肌细胞肥大的指标;Western blot检测心肌细胞肌浆网Ca2+-APT泵(SERCA2a)、钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)、磷酸化钙调蛋白激酶Ⅱ(p-CaMK Ⅱ)的蛋白质表达的水平;激光共聚焦检测胞内钙变化情况.结果 血管紧张素Ⅱ(10-6 mol/L)处理心肌细胞48 h,可使ANP mRNA及蛋白表达增加(P＜0.05).与对照组相比,血管紧张素Ⅱ组心肌细胞ANP、p-CaMK Ⅱ蛋白表达明显增加(P＜0.01);而5-氮杂胞苷(10-6 mol/L)同时加药组及预处理组较之血管紧张素Ⅱ组则下降(P＜0.01);与对照组相比,血管紧张素Ⅱ组心肌细胞的SERCA2a蛋白质表达下降(P＜0.01),而5-氮杂胞苷同时加药组及预处理组较血管紧张素Ⅱ组的上升(P＜0.01).钙离子变化情况,与对照组相比,血管紧张素Ⅱ组胞内钙离子峰值上升时间和下降时间均延长(P＜0.05),而5-氮杂胞苷同时加药组及预处理组较之血管紧张素Ⅱ组则稍缩短(P＜0.05).结论 5-氮杂胞苷可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大,其机制可能通过促进SERCA2a表达有关;SERCA2a表达的增加,缩短胞浆钙再摄取入肌浆网的时间,有利于维持胞内钙稳态.
关键词： 心肌肥大 甲基化抑制剂 5-氮杂胞苷 血管紧张素Ⅱ 肌浆网Ca2+-ATP泵 -
5-氮杂胞苷抑制肝癌细胞恶性表型和逆转甲基化状态的作用及机制
目的:探讨DNA异常甲基化与肝细胞肝癌间的相关性及5-氮杂胞苷(5-aza-CR)抑制肝癌细胞恶性表型和逆转甲基化状态的作用及其机制.方法:用5-aza-CR处理肝癌细胞株HuH-7和裸鼠移植瘤模型,然后用相差显微镜观察药物处理前后细胞形态变化,MTT法观察细胞生长速度变化,流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率,甲基化特异性PCR(MSP)检测p16基因5'CpG岛甲基化状态,RT-PCR法检测p16 mRNA的表达情况.结果:5-aza-CR对肿瘤细胞HuH-7和裸鼠移植瘤细胞均有明显的抑制作用;实验组HuH-7细胞周期G0/G1期延长41.1%±3.2%,S期缩短39.0%±1.4%.G2期缩短2.2%±0.7%,凋亡细胞增加30.0%±4.5%;裸鼠移植瘤细胞周期G0/G1期延长27.4%±3.1%,S期缩短25.8%±2.1%,G2期缩短1.6%±1.8%,凋亡细胞增加2.9%±0.6%;对照组HuH-7与裸鼠细胞仅甲基化引物扩增出特异PCR条带,实验组HuH-7细胞仅非甲基化引物扩增出特异PCR条带,而实验组裸鼠细胞甲基化和非甲基化引物均扩增出特异PCR条带;实验组肿瘤细胞HuH-7和裸鼠移植瘤细胞的p16 mRNA均有表达,而对照组则无表达.结论:5-aza-CR在体外和体内均有抑制肝癌细胞生长、阻滞细胞周期G1/S和促进p16 mRNA表达的作用:5-aza-CR可抑制肝癌细胞恶性表型和逆转p16甲基化状态.
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骨髓间充质干细胞向心肌分化的实验研究
目的:研究骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)分化为心肌样细胞的能力,用于心肌补片治疗心肌梗死的研究.方法:分离C57/BSL小鼠BMSCs,全培养差速贴壁法,经过贴壁培养至第3代,流式细胞仪鉴定细胞表面标志(CD34、CD45、CD73、CD90),经10 μrol/L的5-氮杂胞苷诱导细胞,24h后更换完全培养基培养,2 w后进行免疫荧光染色,荧光显微镜观察心肌钙蛋白T(cTnT)和连接素蛋白43(CX43)的表达.结果:流式鉴定结果显示CD34、CD45阴性,CD73强阳性,CD90弱阳性.免疫荧光染色显示,诱导后细胞高表达心肌细胞特异性蛋白cTnT,连接素蛋白CX43表达水平明显增加.结论:5-aza可以诱导BMSCs大量表达心肌特异性蛋白cTnT和细胞连接素蛋白(CX43),干细胞分化为心肌样细胞,为干细胞移植治疗小鼠心梗提供种子细胞.
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曲古霉素A和5-氮杂胞苷对高糖诱导损伤的胰岛β细胞的保护作用
目的 探讨高糖诱导下曲古霉素A(TSA)和5-氮杂胞苷(5-AzaC)对胰岛β细胞增殖、凋亡及功能的影响. 方法 体外培养大鼠胰岛素瘤(RIN-m5f)细胞至指数增长期,根据干预方案分为空白对照(NC)组、高糖诱导(HG)组、0.05、0.10 μmol/L TSA干预组、0.63、1.25 μmol/L 5-AzaC干预组、0.10 μmol/L TSA+1.25 μmol/L 5-AzaC联合干预组.检测RIN-m5f细胞增殖活性、细胞凋亡率、葡萄糖刺激胰岛素分泌能力. 结果 0.05、0.10 μmol/L TSA干预组、0.63、1.25 μmol/L 5-AzaC干预组及联合干预组的细胞增殖活性均高于HG组,而细胞凋亡率均低于HG组(P＜0.05).在3.3 mmol/L及25 mmol/L葡萄糖刺激时,各组葡萄糖刺激胰岛素分泌量均高于HG组(P＜0.05). 结论 TSA和5-AzaC可抑制高糖诱导的胰岛β细胞凋亡和恢复β细胞的胰岛素分泌功能.
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心肌细胞裂解成分诱导骨髓间充质干细胞分化的超微结构观察
目的:观察骨髓间充质干细胞(MSCs)在心肌细胞裂解成分作用下超微结构改变,了解心肌细胞裂解成分对MSCs分化的诱导作用.方法:分离并裂解新生大鼠的心肌细胞;自成年大鼠骨髓中分离MSCs;将分离的MSCs分3组培养:仅用普通培养基培养(对照组);5-氮杂胞苷(5-aza)诱导后用普通培养基培养(5-aza诱导组);含有心肌细胞裂解成分的培养基培养(心肌细胞裂解成分培养组).培养1周,观察细胞形态及超微结构的改变,对培养的细胞进行抗心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)及抗分化决定簇31(CD31)细胞免疫化学染色,并分析各组细胞的增殖情况.结果:对照组MSCs无明显的肌样细胞或内皮样细胞形成,抗cTnT和抗CD31染色阴性.5-aza诱导组部分MSCs分化为肌样细胞,电镜下可见大量细胞器空化,抗cTnT染色阳性,但细胞增殖缓慢.心肌细胞裂解成分培养组的MSCs分化为肌样细胞,电镜下可见肌丝样结构,抗 cTnT染色阳性,细胞增殖旺盛,另见部分MSCs分化为内皮样细胞,形成内皮细胞特有的胞质突起和质膜小泡等超微结构,且抗CD31染色阳性.结论:含有心肌细胞裂解成分的培养基可以诱导MSCs向心肌样细胞和内皮样细胞方向分化.
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骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞
目的:观察5-氮杂胞苷(5-aza)体外诱导分化骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)成为心肌细胞的作用,并为进一步体内研究而进行细胞标记.方法:提取小型猪骨髓20ml,体外分离培养骨髓间充质干细胞,分为对照组和诱导组,其中诱导组在培养第3天加入5-aza(10 μmol/L),分别在培养2周和4周时观察两组细胞光镜、电镜下形态,4周时进行磷钨酸-苏木素染色(PTAH)和肌动蛋白(actin)免疫组化染色.诱导组MSCs加入5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU,5μg/ml),分别在作用后第2周和第4周,利用BrdU单克隆抗体免疫组化检测BrdU标记方法.此外,用含有LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染诱导组MSCs,利用X-gal染色检测LacZ基因表达的半乳糖苷酶,观察诱导分化后MSCs的体外标记情况.结果:体外能够成功地分离骨髓MSCs,5-aza诱导分化2周和4周后的MSCs在光镜下明显成为梭形,形态类似肌细胞.电镜下诱导分化后的MSCs在2周时出现肌丝结构,4周时肌丝明显增多.PTAH染色显示超过70%的细胞具有横纹肌的染色性质,actin免疫组化染色显示:超过80%的诱导后MSCs肌动蛋白呈阳性表达.体外BrdU单克隆抗体检测BrdU掺入到MSCs细胞核中,X-gal染色证明LacZ基因能够进入MSCs并表达,两种体外标记方法在标记2周和4周时都为阳性.结论:5-aza能够诱导骨髓MSCs成为心肌细胞,BrdU掺入和含有LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染能够成功对诱导分化后MSCs进行标记,并且标记持续至少4周.
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前列腺癌中N-myc下游调节基因-1启动子区甲基化状态的初步研究
目的 检测前列腺癌中N-myc下游调节基因-1(N-myc downstream regulated gene-1,NDRG1)启动子区的甲基化状态,探讨甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞苷对NDRG1基因在前列腺癌细胞mRNA的表达及对细胞增殖的影响.方法 2013年1月至2014年4月采用亚硫酸盐测序PCR法分别检测前列腺癌组织、良性前列腺增生(BPH)组织、前列腺癌细胞系(PC3、22RV1、LNCaP、DU145)和人正常前列腺细胞系RWPE-1中的NDRG1基因启动子区甲基化状态.用10 μmol/L 5-氮杂胞苷分别作用于LNCaP和DU145细胞72 h后,噻唑盐法分析5-氮杂胞苷对LNCaP和DU145细胞增殖的影响;RT-PCR法检测两种细胞系中NDRG1 mRNA的表达.结果 NDRG1基因在前列腺癌细胞系PC-3、22RV1、LNCaP和DU145中甲基化率分别为(24.8±3.3)％、(36.2±2.5)％、(48.6±2.8)％、(69.5±1.7)％,人正常前列腺细胞系RWPE-1甲基化率为(4.8±4.5)％;前列腺癌组织中为(48.6±5.3)％,BPH组织中为(4.3±2.1)％,组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).10 μmol/L5-氮杂胞苷处理LNCaP和DU145细胞72 h后,两种细胞中NDRG1基因发生了去甲基化,mRNA表达水平较处理前增强8～9倍,细胞生长受到抑制(P＜0.05).结论 NDRG1基因启动子区的高甲基化是其在前列腺癌中异常表达的原因之一,5-氮杂胞苷能逆转NDRG1基因的甲基化状态,调控该基因mRNA表达,并能抑制前列腺癌细胞的增殖.
关键词： 前列腺癌 启动子 甲基化 N-myc下游调节基因-1 5-氮杂胞苷 -
5-氮杂胞苷调控TIP30基因表达对人结直肠癌细胞氟尿嘧啶敏感性的影响
目的 探讨5-氮杂胞苷(5-Aza-dC)对结直肠癌细胞中TIP30基因表达的影响,并探讨其与氟尿嘧啶(5-Fu)敏感性的关系.方法 5-Aza-dC处理结直肠癌HCT116细胞,采用甲基化特异性PCR (MSP)方法检测TIP30基因启动子CpG岛甲基化状态,逆转录PCR检测TIP30 mRNA表达,Western blot法检测TIP30蛋白的表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测HCT116细胞对5-Fu的敏感性.结果 未经5-Aza-dC处理的HCT116细胞中,TIP30基因启动子完全甲基化.5-Aza-dC处理HCT116细胞3d后去除5-Aza-dC,HCT116细胞TIP30基因非甲基化产物阳性,启动子去甲基化.随着5-Aza-dC去除时间的延长,HCT116细胞中TIP30基因启动子甲基化产物和非甲基化产物均为阳性,即启动子部分甲基化,部分非甲基化；去除5-Aza-dC第10天,TIP30基因启动子甲基化产物阳性,TIP30基因启动子重新甲基化.未经5-Aza-dC处理的结直肠癌HCT116细胞TIP30 mRNA和蛋白不表达.5-Aza-dC处理结直肠癌HCT116细胞3d后去除5-Aza-dC,TIP30 mRNA和蛋白表达明显增强.随着5-Aza-dC去除时间的延长,TIP30 mRNA和蛋白表达水平逐渐降低,第10天达到低水平.在5-Aza-dC处理前、5-Aza-dC处理后去除5-Aza-dC的第0、10天,5-Fu作用于HCT116细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为41.62、33.17和4.96 μg/ml.结论 TIP30基因表达差异可能与其启动子甲基化状态有关,且TIP30基因启动子甲基化差异与结直肠癌细胞对化疗药物的敏感性相关.
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p38对骨髓间充质干细胞成肌分化作用的研究
目的:以5-氮杂胞苷(5-Aza-CR)诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)成肌分化,探讨生肌调控因子中Myf5的表达及信号转导通路p38在此分化过程中的作用.方法:分离、纯化MSCs,以10 μmol/L 5-Aza-CR诱导其向成肌细胞分化,RT-PCR测定Myf5的表达,免疫组化检测肌球蛋白(myosin)的表达,Western-blot检测p38信号通路特异抑制剂SB203580作用前后磷酸化p38的变化.结果:SB203580作用后,Myf5表达由6 h延迟至9 h,诱导12 d部分MSCs表达myosin,18 d表达的数量及程度明显增加;5-Aza-CR诱导后,磷酸化p38蛋白水平较作用前增强,但在SB203580抑制后明显受抑.结论:5-Aza-CR诱导后,MSCs表达生肌调控因子并向成肌细胞分化,p38在此分化过程中起着正向信号转导作用.
