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5-氮杂胞苷对骨髓瘤细胞增殖抑制作用及对XAF1基因表达的影响
目的 探讨5-氮杂胞苷处理对骨髓瘤细胞系RPMI 8226和XG-7细胞中XAF1基因表达的影响及体外抗骨髓瘤作用的机制.方法 采用逆转录PCR和Western blot方法检测骨髓瘤细胞系RPMI 8226和XG-7细胞中XAF1基因和蛋白的表达.采用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测XAFI基因启动子CpG岛甲基化状态.采用0～5 μmoL/L 5-氮杂胞苷处理骨髓瘤细胞株.采用CCK-8比色法检测5-氮杂胞苷处理对骨髓瘤细胞增殖抑制作用.采用Annexin V/7-AAD染色流式细胞术检测细胞凋亡.结果 XG-7细胞不表达XAF1 mRNA及蛋白,RPMI 8226细胞表达XAF1 mRNA转录本1和2.XG-7和RPMI 8226细胞XAFl基因启动子CpG岛均存在过甲基化.XG-7和RPMI 8226细胞经2.5μmol/L 5-氮杂胞苷处理72 h后仅表达XAF1 mRNA转录本1并表达XAF1蛋白,并且XAF1基因启动子CpG岛甲基化程度降低.5-氮杂胞苷抗骨髓瘤作用呈时间和浓度依赖性.5-氮杂胞苷处理RPMI 8226和XG-7细胞48 h的IC50值分别为2.4 μmol/L和2.6 μmol/L.结论 骨髓瘤细胞中抑癌基因XAFI表达缺失或表达异常与XAF1基凶启动子CpG岛过甲基化有关.5-氮杂胞苷处理可以诱导XAF1 mRNA及蛋白表达.5-氮杂胞苷在临床上能达到的药物浓度下具有抗骨髓瘤作用,其作用机制是诱导骨髓瘤细胞凋亡.
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大鼠胚胎脑膜组织细胞分离培养及其生物学特性观察
[目的]分离和培养大鼠胚胎脑膜组织细胞,并观察其生物学特性.[方法]在无菌条件下取妊娠14.5～16.5 d大鼠的胚胎脑膜组织,培养传代,在倒置光显微镜和电镜下对细胞形态变化进行动态观察;流式细胞仪检测细胞周期变化;用四唑盐(MTT)法测定细胞生长活力.在细胞传至第4代时加入10 μmol/L 5-aza,并观察其对细胞增殖和行为的影响;免疫细胞化学方法检测Desmin、GFAP的表达.[结果]在透射电镜下观察对照组多数细胞为未分化细胞,而实验组可见有成纤维样细胞和胶质样细胞的形态变化;流式细胞仪分析经5-aza诱导3 d后,处于增殖状态的S期细胞比率为8.1%,较对照组9.7%为低;经MTT法检测表明5-aza明显抑制胚胎脑膜组织细胞的增殖.免疫细胞化学检测结果表明,胚胎脑膜组织细胞经5-aza诱导8 d Desmin和GFAP的表达均较对照组显著增高,阳性率分别达51.2%和52.3%.[结论]5-aza对胚胎脑膜组织细胞生长有明显抑制作用,并诱导其分化成纤维样细胞和胶质样细胞.
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5-Azac诱导急性移植物抗宿主病免疫低反应的甲基化研究
目的 建立小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型,检测DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-aza-cytidine,5-Azac)诱导aGVHD免疫低反应后的甲基化变化,探讨5-Azac对小鼠aGVHD的免疫调节作用.方法 选择雄性C57BL/6(H-2b)与雌性BALB/c(H-2d)小鼠分别作为异基因移植供、受体建立移植物抗宿主病小鼠模型.BABL/c受体按照体质量相近进行配对,分为移植对照组和5-Azac实验组.5-Azac实验组于移植后1~7、14、21、28 d尾静脉注射5-Azac 0.25 mg/kg(0.3 mL/只);移植对照组尾静脉注射生理盐水0.3 mL/只.提取3只移植对照组和3只5-Azac实验组小鼠的外周血DNA,分别等量混匀,采用甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP-seq)的方法检测甲基化变化,筛选差异甲基化基因,并对其功能及生物学通路进行分析.结果 5-Azac实验组小鼠的生存时间延长,排斥反应减弱,成功诱导移植物抗宿主病免疫低反应状态.2组小鼠DNA MeDIP-seq结果对比显示:5-Azac实验组启动子区存在369个差异甲基化基因,其中上调239个、下调130个;外显子区存在184个差异甲基化基因,其中上调113个、下调71个.利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库对差异甲基化基因分析,结果显示其主要参与10个免疫学信号通路,其中TGF-β、GSK-3β、SYK、PI3K、NFAT、CD28、α4β7与aGVHD的发生发展密切相关.结论 5-Azac可以通过改变基因的甲基化状态有效诱导aGVHD的免疫低反应.
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吡格列酮联合5－氮杂胞苷干预对大鼠胰岛素瘤细胞增殖、凋亡及功能的影响
目的：观察吡格列酮（ PGZ）联合5－氮杂胞苷（5－AzaC）干预对大鼠胰岛素瘤细胞增殖、凋亡及胰岛素分泌量的影响。方法2015年6月—2016年6月于河南省平顶山市第二人民医院内分泌科进行实验。将大鼠胰岛素瘤细胞（RIN－m5f）行体外原代及传代培养，将培养好的细胞分为5组：空白组（不加任何试剂）、模型组[白细胞介素－1β（IL－1β）2 ng／ml＋干扰素γ（IFN－γ）100 U／ml]、吡格列酮组（IL－1β2 ng／ml ＋IFN－γ100 U／ml＋PGZ 15μmol／L）、5－AzaC组（IL－1β2 ng／ml ＋IFN－γ100 U／ml ＋5－AzaC 1．5μmol／L）及PGZ＋5－AzaC组（IL－1β2 ng／ml ＋IFN－γ100 U／ml ＋PGZ 15μmol／L ＋5－AzaC 1．5μmol／L）。应用倒置显微镜观察RIN－m5f细胞形态学的变化，流式细胞仪测定RIN－m5f细胞凋亡情况，应用Western blot法检测B细胞淋巴瘤－2（Bcl－2）、多糖聚合酶（PGZRP）表达情况，应用ELISA法检测葡萄糖刺激胰岛素分泌能力。结果 RIN－m5f细胞培养24 h、48 h、72 h后应用流式细胞仪可观察到PGZ组、5－AzaC组、PGZ＋5－AzaC组和RIN－m5f细胞凋亡率低于模型组（ q PGZ组＝12．122、8．452、8．252， P均＜0．05；qt5－AzaC组＝12．252、8．563、7．529， P均＜0．05；q PGZ＋5－AzaC组＝8．563、7．452、8．963， P ＜0．05），PGZ＋5－AzaC组细胞凋亡率低于PGZ组与5－AzaC组（ q PGZ组＝7．022、6．986、8．523， P均＜0．05；q 5－AzaC组＝8．963、9．123、10．523， P均＜0．05），培养48 h、72 h后PGZ＋5－AzaC组细胞凋亡率较培养24 h时显著下降（ q ＝5．996、6．789， P均＜0．05）。 Bcl－2、PG－ZRP表达水平：模型组＞PGZ组＞5－AzaC组＞PGZ＋5－AzaC组（ q ＝7．896、8．233、9．102， P均＜0．05）。 PGZ＋5－AzaC组葡萄糖刺激胰岛素分泌能力大于PGZ组、5－AzaC组（ q ＝8．252、7．896， P均＜0．05），5－AzaC组葡萄糖刺激胰岛素分泌能力大于PGZ组，差异均有统计学意义（q＝8．123， P ＜0．05）。结论 PGZ联合5－AzaC能有效抑制高糖诱导大鼠胰岛素瘤凋亡，恢复胰岛素瘤分泌能力，其作用机制可能与其能下调Bcl－2、PGZRP表达水平有关。
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5-氮杂胞苷对胃癌细胞系的生长凋亡及DR4与DR5表达的影响
目的 探讨5-氮杂胞苷(5-Aza-CdR)对胃癌细胞系的生长,凋亡及DR4与DR5表达的影响.方法 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法、Western blot方法和甲基化特异性PCR(MS-PCR)法检测5-Aza-CdR处理后的胃癌细胞株内DR4和DR5的RNA表达水平.结果 5-Aza-CdR能够逆转胃癌细胞中DR4和DR5的启动子甲基化水平,并上调DR4和DR5的表达水平.结论 5-氮杂胞苷对胃癌细胞系MKN28、AGS和SGC7901具有增殖抑制作用,且具有药物浓度和作用时间的依赖性.促进胃癌细胞系MKN28、AGS和SGC7901的凋亡且能使死亡受体DR4和DR5的表达水平增高.
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5-氮杂胞苷对胃癌细胞系的生长凋亡及DR4与DR5表达的影响
目的 探讨5-氮杂胞苷(5-Aza-CdR)对胃癌细胞系的生长,凋亡及DR4与DR5表达的影响.方法 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法、Western blot方法和甲基化特异性PCR(MS-PCR)法检测5-Aza-CdR处理后的胃癌细胞株内DR4和DR5的RNA表达水平.结果 5-Aza-CdR能够逆转胃癌细胞中DR4和DR5的启动子甲基化水平,并上调DR4和DR5的表达水平.结论 5-氮杂胞苷对胃癌细胞系MKN28、AGS和SGC7901具有增殖抑制作用,且具有药物浓度和作用时间的依赖性.促进胃癌细胞系MKN28、AGS和SGC7901的凋亡且能使死亡受体DR4和DR5的表达水平增高.
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牵拉应力在5-氮杂胞苷诱导骨髓间充质干细胞成肌过程中的动态效应
背景:国内外研究发现在一定力学环境下,体外培养的间充质干细胞其增殖分化等一系列生物学特性会发生相应变化.目的:体外观察5-氮杂胞苷与牵拉应力对大鼠骨髓间充质干细胞向肌细胞分化的调控作用.设计、时间及地点:2006-01/2007-06在上海交通大学牛物力学实验室完成的细胞观察实验.材料:清洁级3-4周龄雄性SD大鼠30只用于分离培养骨髓间充质干细胞,1～3d龄SD新生鼠4只用于建立骨骼肌阳性细胞株.化学诱导剂5-氮杂胞苷为Sigma公司产品,牵拉设备Fx-4000 Flexercell由美国Flexcell Int公司生产.方法:将传至第4代的骨髓间充质干细胞接种于Flex 6孔板.[1]设立5组行成肌家族因子表达Western-Blot检测:第1组细胞单纯经10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导1周;第2～4组细胞以10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导1周后,在1Hz频率、15%幅度应力条件下分别牵拉12,24,36h;第5组以新生鼠骨骼肌细胞作为阳性对照.[2]设立5组行诱导剂及牵拉应力作用的RT-PCR检测:第1组细胞给予1Hz频率、15%幅度应力牵拉24h;第2、3组分别经10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导1,2周;第4组细胞经10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导2周后,给与同等应力牵拉24h;第5组以新生鼠骨骼肌细胞作为阳性对照.主要观察指标:不同诱导条件及应力牵拉状态下骨髓间充质干细胞成肌家族因子的表达.结果:[1]第1组表达成肌因子MyoD与Myf5,成熟肌细胞标志MHC表达不显著;第2～4组MyoD与Myf5的表达明显增强(P<0.05),且随牵拉时间延长因子的表达逐步增强,MHC表达不显著.[2]第1组不表达成肌家族因子;第2组表达MyoD、 Myf5,第3组表达MyoD、 Myf5、 desmin,第4组几乎表达所有检測的肌细胞特异性标记.结论:经5-氮杂胞苷诱导可启动骨髓间充质干细胞向肌细胞分化,单独的牵拉应力不能诱导成肌.牵拉应力可调控5-氮杂胞苷对骨髓间充质干细胞的诱导分化进程,并且与牵拉作用时间成正性相关.
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体外模拟心肌环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化
目的:以往研究将长有一层心肌细胞的半透膜放于骨髓间充质干细胞培养皿中,或用培养过心肌细胞的培养基来培养骨髓间充质干细胞,均未发现心肌细胞特异蛋白表达.为此体外模拟心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并与常规诱导剂5-氮杂胞苷的诱导效果进行比较.方法:实验于2007-03/09在山西医科大学中心实验室完成.①动物:Wistar大鼠20只,新生1 d龄Wistar乳鼠10只,均由山西医科大学动物房提供,清洁级,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.诱导剂5-氮杂胞苷为美国Sigma公司产品.②实验方法:自新生Wistar乳鼠心脏分离培养心肌细胞,取第1、2代制成1×109 L-1细胞悬液,-70 ℃放置4～5 h后融化,吸管吹打,反复3次,离心取上清,过滤后即为心肌细胞冻融液,以此作为培养基体外模拟心肌微环境.自成年Wistar大鼠骨髓分离骨髓间充质干细胞,取生长良好的第2代制成1×108 L-1细胞悬液,分为4组:血清对照组加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基;5-氮杂胞苷组加入10μmol/L 5-氮杂胞苷37 ℃避光孵育24 h后,换DMEM/F12培养基继续培养;5-氮杂胞苷+心肌细胞冻融液组加入10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导24 h后,在培养体系中加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液;心肌细胞冻融液组加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液.③实验评估:诱导1周后观察骨髓间充质干细胞的形态变化,利用免疫细胞化学技术鉴定心肌特异性肌钙蛋白T、连接蛋白43、α-横纹肌肌动蛋白、CD31的表达情况.结果:①体外模拟心肌微环境情况:培养7 d时心肌细胞形成细胞簇或细胞单层,呈放射状排列的同心圆状或峰谷样生长,细胞簇搏动呈明显同步性.传代后的心肌细胞仍具有自主收缩的特性.②骨髓间充质干细胞的体外诱导结果:诱导处理1周后,5-氮杂胞苷组多数细胞呈杆状,紧密平行排列生长,细胞体积变大,可见肌丝样结构形成;心肌细胞冻融液组细胞有聚集生长趋势,形成大量的子细胞,可见大量的肌丝样的结构;5-氮杂胞苷+心肌细胞冻融液组脱落或降解的细胞数明显少于5-氮杂胞苷组,也形成肌丝样结构,但部分细胞内有脂肪空泡形成.③免疫细胞化学鉴定结果:诱导培养1周后,血清对照组仅表达α-横纹肌肌动蛋白;5-氮杂胞苷组表达心肌特异性蛋白T、α-横纹肌肌动蛋白、连接蛋白43,其阳性率分别为20%,28%,25%,抗CD31染色呈阴性;心肌细胞冻融液组上述蛋白阳性表达率分别为23%,32%,28%,明显高于5-氮杂胞苷组(P < 0.05),同时抗CD31染色呈阳性;5-氮杂胞苷+心肌细胞冻融液组上述蛋白阳性表达率略低于心肌细胞冻融液组,抗CD31染色呈阳性.结论:①以心肌细胞冻融液体外模拟心肌微环境,可高效诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞.②部分骨髓间充质干细胞表达CD31,即可向血管内皮细胞分化,提示与5-氮杂胞苷单一的肌细胞诱导作用相比,心肌细胞冻融液更能提供一个心肌再生所需的自然条件.
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共培养条件下人脐血间充质干细胞抑制心肌细胞凋亡:是否安全有效?
背景:脐血间充质干细胞归巢或植入心脏后能够修复心肌组织,但其移植治疗的安全性尚有待分析.目的:观察共培养情况下人脐血间充质干细胞能否抑制人心肌细胞凋亡,以及人脐血间充质干细胞移植治疗的安全性.方法:人脐血间充质干细胞来源于分娩孕妇脐血,经5-氮杂胞苷处理24 h向心肌细胞诱导分化.分别取体外培养3～5代细胞以及诱导后细胞,检测其端粒酶活性及肿瘤相关基因的表达、染色体核型G带分型、细胞表面抗原表达、裸鼠体内成瘤情况、共培养条件下细胞凋亡情况.结果与结论:脐血间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导前后,其端粒酶活性及p53,cyclin A,cdk2,β-actin,C-fos,h-TERT,c-myc等肿瘤相关基因的表达均基本相似;均未发现异常染色体核型;免疫表型无明显变化,CD34呈阴性,CD44及CD90(Thy-1)呈阳性.脐血间充质干细胞接种10周后裸鼠仍健康存活,体内未见肿瘤生长,石蜡切片苏木精-伊红染色显示为正常的皮下组织.与单纯心肌细胞比较,共培养情况下脐血间充质干细胞能够显著抑制心肌细胞的凋亡(P < 0.05),提示人脐血间充质干细胞用于细胞移植治疗安全有效.
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P53-P21蛋白通路对5-氮杂胞苷诱导的大鼠骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的影响
背景:5-氮杂胞苷是诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的有效化学试剂.目的:观察P53特异性抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路对5-氮杂胞苷诱导的大鼠骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的影响.方法:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为4组,即正常对照组、5-氮杂胞苷组、PFT-α组、PFT-α+5-氮杂胞苷组.观察骨髓间充质干细胞培养传代过程中细胞形态变化,应用流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原,MTT法测定诱导后各组骨髓间充质干细胞增殖能力,以流式细胞仪检测诱导后各组细胞凋亡率,采用Western blot法测定诱导后P53、P21蛋白表达情况.结果与结论:原代培养的骨髓间充质干细胞2周形成集落,传代细胞体积变大,呈长梭形,排列趋一致.骨髓间充质干细胞表面抗原CD44,CD45阳性表达率分别为(89.98±1.29)%,(2.14±0.22)%.MTT结果显示,当PFT-α浓度≤20 μmol/L时,对骨髓间充质干细胞的增殖有一定促进作用;而当其浓度达到40 μmol/L时,PFT-α则可明显抑制骨髓间充质干细胞的增殖.培养第5,7天时,与其他3组比较,5-氮杂胞苷组对骨髓间充质干细胞增殖表现出明显抑制(P < 0.01).流式细胞仪结果显示,5-氮杂胞苷组骨髓间充质干细胞凋亡率显著高于其他3组(P < 0.01).Western blot结果显示,各组均有P53、P21蛋白的表达,以5-氮杂胞苷组表达量明显增多.提示通过P53特异性抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路,能显著减少5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞的凋亡,促进5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞增殖.
关键词： 骨髓间充质干细胞 P53特异性抑制剂(PFT-α) 5-氮杂胞苷 凋亡 增殖 -
5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞的分化
背景:5-氮杂胞苷能诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞.目的:以5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞.方法:采用贴壁培养法分离、纯化人脐带间充质干细胞,以5-氮杂胞苷诱导第3代人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞.结果与结论:诱导前人脐带间充质干细胞呈典型的梭形;诱导后一二周细胞体积变大,三四周后相邻细胞间胞膜有接触,逐渐相连呈肌管状,细胞胞质内可见细丝样结构.诱导4周后免疫组织化学鉴定人脐带间充质干细胞cTnI表达阳性,未诱导细胞cTnI表达阴性;诱导组Nkx2.5、GATA 4 mRNA表达水平较未诱导组显著增加(P < 0.05).提示5-氮杂胞苷可能通过调控GATA4、Nkx2.5基因的表达促进人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞,并促进其成熟.
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马血清在脂肪干细胞成肌诱导中的作用
背景:利用5-氮杂胞苷诱导脂肪干细胞成肌实验对培养技术以及细胞活性要求较高,诱导成肌时间较长.倘若某种添加剂可缩短诱导时间,将具有重要意义.目的:评估马血清在5-氮杂胞苷诱导脂肪干细胞成肌细胞实验中的作用.方法:将第1代长满100 mm培养皿的脂肪干细胞传代至3个6孔板,实验组培养基中加入体积分数为5%马血清+10 μmol/L 5-氮杂胞苷;对照组培养基中单纯添加10 μmol/L的5-氮杂胞苷;空白组为单纯低糖DMEM培养基,余培养、传代及鉴定所需的条件相同.每日光镜观察记录形态,在培养的第7,14,28,35天行免疫荧光和流式细胞仪检测肌蛋白表达差异.结果与结论:免疫荧光检测成肌特异性胞质蛋白表达以及流式细胞检测相应蛋白表达率提示,加入马血清后的实验组脂肪干细胞的成肌速度和诱导成肌所需时间明显比单纯加入5-氮杂胞苷的对照组更有优势.实验初步表明马血清在促进脂肪干细胞诱导成肌方面起着缩短诱导成肌所需时间的作用.
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聚乳酸-聚乙醇酸共聚物复合心肌样细胞体外构建工程化心肌组织
背景:研究证实,在一定的诱导条件下,骨髓间充质干细胞可能向心肌细胞等多种中胚层来源的间质细胞分化.目的:探索以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物为支架、骨髓间充质干细胞诱导分化的心肌样细胞为种子细胞,体外构建工程化心肌组织的可行性.方法:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞加入含5-氮胞苷的培养液进行诱导分化,培养4周.将诱导成功后的细胞制成细胞悬液,缓慢滴注于预先制备好的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物上,培养14 d.以倒置相差显微镜观察诱导前后细胞的形态学变化,免疫荧光染色法鉴定诱导后骨髓间充质干细胞中心肌特异性肌钙蛋白l的表达,大体观察工程化心肌组织在培养期间的形态,透射电镜观察工程化心肌组织的超微结构.结果与结论:原代培养的骨髓间充质干细胞14 d形成集落,传代细胞体积变大,5-氮胞苷诱导后细胞呈长梭形,呈一致性生长.免疫荧光染色结果显示诱导后骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ.透射电镜可见肌丝、Z线样物质.结果证实,以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物为支架、骨髓间充质干细胞诱导分化的心肌样细胞为种子细胞,可于体外构建出类似天然心肌的工程化心肌组织.
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5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ诱导脂肪间充质干细胞向心肌细胞的分化
背景:采取有效措施修复坏死心肌成为临床治疗心肌梗死的新方向.目的:探讨5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ对小鼠脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化的影响.方法:取20只4周龄ICR小鼠,利用Ⅰ型胶原酶消化法获得脂肪间充质干细胞,观察细胞的形态学特点,运用MT-T-法检测细胞的增殖情况,运用免疫荧光技术检测细胞表面抗原CD90,CD105,CD73,CD45的表达.第4代脂肪间充质干细胞培养24 h后,更换为含15 μmol/L 5-氮杂胞苷和15 μmol/L 5-氮杂胞苷+0.1 μmol/L血管紧张素Ⅱ的培养基诱导24 h,然后更换为完全培养基,Western Blot检测细胞中cTnT蛋白表达.结果与结论:①原代脂肪间充质干细胞胞核较小,呈梭形、星形,传代后细胞体积增大,形态趋于一致,排列规则;②第3代小鼠脂肪间充质干细胞的生长曲线呈现“S”形,第1-3天为潜伏期,第4天进入对数生长期,第5-7天细胞生长达到峰值,进入平稳期;③第4代脂肪间充质干细胞表面CD90、CD105及CD73呈阳性表达,CD45阴性表达;④5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ组心肌细胞中cTnT蛋白表达量显著高于5-氮杂胞苷(P＜0.05);⑤结果表明,5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ能够显著促进脂肪间充质干细胞向心肌细胞样细胞分化.
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5-氮杂胞苷诱导脐带间充质干细胞向成肌细胞分化研究
目的 探讨人脐带间充质千细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HuMSCs)向成肌细胞分化.方法 贴壁法分离HuMSCs；流式细胞仪分析其表面抗原；透射电镜及原子力电镜观察细胞超微结构；5-氮杂胞苷诱导细胞向成肌细胞分化；逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测成肌细胞特异基因结蛋白(desmin)和重链肌球蛋白(myosin heavy chain,MHC)表达；蛋白质印迹法(Western Blot)检测特异蛋白desmin和MHC表达.结果 贴壁法稳定从脐带分离出细胞；HuMSCs不表达CD31、CD34、CD45,强表达CD29、CD90、CD44、CD105,极低表达HLA-DR、CD40；5-氮杂胞苷诱导后干细胞表达成肌细胞特异基因及蛋白明显高于对照组.结论 贴壁法分离HuMSCs可靠、纯度高；5-氮杂胞苷可诱导HuMSCs向成肌细胞分化.
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3种胃癌细胞株中GSTP1基因表达及其启动子区甲基化状态的研究
目的 研究候选基因GSTP1在胃癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,初步探讨胃癌细胞株GSTP1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性.方法 采用RT-PCR和Western blot技术分别检测GSTP1在人胃癌细胞株MGC803、BGC823和SGC901中的mRNA和蛋白表达水平.甲基化特异性PCR(MSP)法检测启动子区域甲基化状态.分别用不同浓度的去甲基化药物5-氮杂胞苷处理GSTP1基因启动子区高甲基化状态细胞后,再检测GSTP1基因蛋白表达水平.结果 人胃癌细胞株BGC823和SGC7901中GSTP1 mRNA和蛋白里阳性表达,MGC803中mRNA和蛋白里阴性表达;BGC823和SGC7901细胞GSTP1基因启动子区域未发生甲基化,而MGC803细胞启动子区呈高甲基化状态;经5-氮杂胞苷药物干预后,MGC803细胞的CSTP1蛋白表达明显增强.结论 胃癌MGC803细胞株中GSTP1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关.
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人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的超微结构
目的:培养人骨髓间充质干细胞(hMSCs),体外向心肌细胞(CMs)定向诱导分化,进行超微结构观察,为hMSCs体外向CMs诱导分化提供理论依据.方法:体外分离培养扩增hMSCs并进行流式细胞仪分析鉴定;选用生长良好,纯度高的P5代hMSCs.用5-氮杂胞苷(5-Aza,10 μmol·L-1)体外定向向CMs诱导分化,对其进行Desmin检测,在倒置显微镜及透射电镜下观察细胞形态学和超微结构.结果:流式细胞仪检测显示体外分离纯化培养扩增出细胞不表达CD34,高表达CD44,表明扩增细胞为hMSCs.hMSCs经5-Aza诱导分化后其形态发生改变,逐渐由长梭形变为多角形及星形,并表达Desmin.透射电镜下可见细胞大小不一致,细胞表面有许多微绒毛;细胞器丰富,胞质内可见丰富的线粒体、租面内质网;部分细胞内可见大量糖原颗粒沉积,小部分细胞内可见髓样小体;胞浆内可见肌丝样结构,细胞间存在细胞连接.结论:体外分离培养扩增的hMSCs经5-Aza诱导,可分化成具有CMs超微结构特件的心肌样细胞.
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不同浓度的5-氮杂胞苷对RPMI 8226细胞系的诱导凋亡作用分析
目的:探讨不同浓度的5-氮杂胞苷对RPMI 8226细胞系的诱导凋亡作用.方法:对RPMI 8226细胞系采用5-氮杂胞苷0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10 μrnol/L、20 μmol/L、50 μmol/L处理24 h、48 h、72 h,并对RPMI 8226细胞系处理后进行刮痕实验,12h后对细胞迁移进行比较.结果:在作用24h、48h时,随着作用浓度的增加,RPMI-8226细胞的抑制率出现明显的增加,但在作用72 h时,我们发现10 μmol/L、20μmol/L、50μnol/L其对RPMI-8226细胞的抑制效果无明显的差异性；刮痕实验后12h后其出现差异性,其中药物浓度越大其对RPMI-8226细胞的运动迁移能力越弱.结论:DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞苷可对RPMI-8226细胞的凋亡具有良好的诱导效果,同时可抑制RPMI-8226细胞的增殖以及迁移.
关键词： 5-氮杂胞苷 RPMI 8226细胞系 凋亡 多发性骨髓瘤 -
大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究
目的:研究体外不同诱导条件下大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌细胞分化的潜能.方法:取Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓,分离培养MSCs,采用第二代或第三代MSCs,以5-氮杂胞苷(5-aza)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及两者联合作用,作为分化诱导剂,连续观察三周,相差显微镜下观察其形态变化.免疫细胞化学方法鉴定心肌特异性蛋白T(Troponin T, cTnT)、连接蛋白43(Connexin43)、α-横纹肌动蛋白(α-Sarcomeric Actin)的表达,应用半定量RT-PCR技术分析Nkx2.5、GATA-4、TGF-?等相关调控基因在分化过程中的表达.结果:免疫细胞化学显示cTnT、Connexin43、α-Sarcomeric Actin诱导前无表达,单纯bFGF诱导组及对照组未发现cTnT、Connexin43、α-Sarcomeric Actin染色阳性细胞,单纯5-aza诱导组诱导后上述三种蛋白阳性细胞表达比例分别为22%、28%、32%,5-aza与bFGF联合诱导组诱导后上述三者阳性细胞表达比例分别为28%、33%、40%,联合诱导组诱导后细胞阳性率明显高于单纯5-aza诱导组,两组相比较差异有显著性意义(P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,GATA-4、Nkx2.5、TGF-β在诱导前的MSCs有低表达,单纯5-aza诱导组及5-aza与bFGF联合诱导组诱导后3周,这三种基因有较强的表达,单纯5-aza诱导组诱导检测结果显示,GATA-4、Nkx2.5、TGF-β在诱导前的MSCs有低表达,单纯5-aza诱导组及5-aza与bFGF联合诱导组诱导后3周,这三种基因有较强的表达,单纯5-aza诱导组诱导前后相比较,差异有显著性意义(P＜0.05),5-aza与bFGF联合诱导组诱导前后相比较,差异也有显著性意义(P＜0.05),单纯5-aza诱导组与5-aza和bFGF联合诱导组诱导后两组之间相比较,差异亦有显著性意义(P＜0.05),表明单纯5-aza诱导及5-aza与bFGF联合诱导均可使MSCs向心肌细胞转化,联合诱导可以使更多的MSCs向心肌细胞方向转化.单纯bFGF诱导组诱导前后无显著性差异.结论:5-aza及bFGF联合诱导,可以作为更好的促进MSCs向心肌细胞分化的条件.
关键词： 骨髓间充质干细胞 细胞分化 5-氮杂胞苷 碱性成纤维细胞生长因子 心肌细胞 -
大鼠骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞的实验研究
目的采用5-氮杂胞苷 (5-aza) 诱导骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞.方法分离培养骨髓间充质干细胞,采用密度为1.073的percoll分离液分离大鼠骨髓间充质干细胞并进行体外培养和连续传代,在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导,用免疫组化的方法鉴定心肌特异性肌钙蛋白I的表达.结果诱导前,骨髓间充质干细胞形态均一,呈多突起扁平形态,诱导后细胞形态发生变化,细胞之间形成连接,排列方向渐趋一致,免疫组化显示表达阳性.结论 5-aza可诱导骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞.
