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骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究
目的 探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是否能体外诱导分化为心肌样细胞.方法 用浓度梯度法分离和纯化Wistar大鼠MSCs,贴壁法培养,培养的第2代细胞分别用终浓度为0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0 μmol/L的5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导分化,用光学显微镜观察细胞的形态并用免疫细胞化学方法鉴定细胞内的心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI).结果 以终浓度10.0 μmol/L 5-aza为诱导组,细胞从原来的梭形变为排列趋向较为一致的长梭形,且体积增大,诱导10 d后,细胞内cTnI蛋白染色阳性.终浓度为0、0.1、1.0 μmol/L组细胞形态变化不明显,细胞内cTnI染色阴性.终浓度为50.0、100.0 μmol/L组细胞死亡.结论 大鼠MSCs细胞可经5-aza诱导分化为心肌样细胞,且5-aza的佳诱导浓度为10.0 μmol/L.
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5-氮杂胞苷和地塞米松对大鼠骨髓间充质干细胞分化作用的实验研究
[目的]探究5-氮杂胞苷和地塞米松对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化能力的影响.[方法] SD大鼠骨髓间充质干细胞体外扩增和传代培养,流式细胞术鉴定细胞表面标志,取3代细胞随机分为空白组、激素组、激素+5-氮杂胞苷组,相应药物干预3d后成骨诱导分化14d,RT-PCR和Western blot检测Runx2和PPARγ的表达.[结果]所取得骨髓间充质干细胞纯度和均一性好,细胞表面标记CD90高表达,CD34、CD45低表达.第3代细胞经药物干预和成骨诱导后,与空白组相比,激素组Runx2基因表达降低,PPARγ基因升高,5-氮杂胞苷+激素组结果与激素组相反(P＜0.05).[结论]激素能抑制骨髓间充质干细胞成骨分化,促进成脂分化,5-氮杂胞苷能干预激素的这种作用,提高骨髓间充质干细胞分化潜能.
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骨髓间充质干细胞诱导分化为骨骼肌细胞后其生物学特性的实验研究
取大鼠第3代骨髓间充质细胞(BMSCs),应用5-氮杂胞苷(5-Aza)、成肌分化因子(MyoD)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、类胰岛素生长因子-1(IGF-1)联合进行诱导,使之定向分化,在诱导后的第21天收集细胞,进行形态学观察和免疫化检查.认为在体外BMSCs可向骨骼肌细胞定向分化,并伴有结蛋白和骨骼肌肌球蛋白阳性表达;为临床骨骼肌缺损的治疗开辟了新的途径.
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骨髓间充质干细胞体外培养分化为肌原性细胞的实验研究
目的研究骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为心肌细胞的可行性.方法由新西兰大白兔胸骨获取骨髓间充质干细胞,培养传代后用5-氮杂胞苷诱导24h,免疫组化检测诱导后细胞的变化.结果 5-氮杂胞苷诱导后的细胞经免疫组化检测可见细胞被抗肌红蛋白抗体着染显色.结论骨髓间充质干细胞可在体外经5-氮杂胞苷诱导后转化为肌原性细胞.
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DNA甲基化调控肺腺癌微小RNA-145表达的分子机制
目的 观察肺腺癌组织中微小RNA(miRNA,miR)-145基因启动子区域各个胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤基序(CpG)岛的甲基化情况,探讨DNA甲基化在肺腺癌中调控miR-145表达的分子机制.方法 用DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-aza-C)对肺腺癌细胞株A549、H1975进行处理,比较miR-145的表达变化.收集手术切除的肺腺癌及癌旁组织标本共20对,应用甲基化DNA定量分析平台和半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,对癌和癌旁组织miR-145启动子区域的甲基化水平进行定量分析.结果 经5-aza-C处理后,A549和H1975细胞株中的miR-145表达均明显上调.甲基化定量数据显示在肺腺癌组织miR-145基因启动子区域的甲基化率均值明显高于癌旁组织(0.59比0.32,P＜0.01).并且在肺腺癌组织中,miR-145基因启动子区域的所有13个CpG位点均呈显著高甲基化:CpG1:13.55±2.06比19.30±5.83;CpG2:27.65±5.68比42.85±15.64;CpG3:36.40 ±6.28比60.20±17.55;CpG4:28.40±6.45比42.25±16.78;CpG5、6:28.65±3.91比41.50±10.19;CpG7:14.40±3.14比27.75±11.69;CpG8、9、10:55.50±4.85比76.50±8.52;CpG11:48.10 ±3.51比64.20±6.26;CpG12:52.75±5.90比73.35±12.70;CpG13:45.80±4.71比58.70±15.40.结论 肺腺癌细胞内miR-145表达受其基因启动子区甲基化调控;肺腺癌组织内miR-145基因启动子区CpG岛高甲基化与该基因表达水平变化密切相关.
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5-氮杂胞苷对甲状腺乳头状癌细胞TPC-1中Dickkopf同源序列3基因去甲基化的转录调节作用
目的 观察甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5-azaC)对甲状腺乳头状癌细胞TPC-1生长的抑制作用及对抑癌基因Dickkopf同源序列3(DDK3)的转录调节作用.方法 经2、5、10、20、50、100、200、400 μmol/L的5-azaC处理TPC-1细胞后,采用噻唑蓝(MTT)观察药物对细胞的生长抑制作用；以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、甲基化特异性PCR(MSP)检测细胞经5、10、20、50 μmol/L的5-azaC处理后DKK3基因mRNA的表达及DKK3基因甲基化状态.结果 经不同浓度5-azaC处理TPC-1细胞后,MTT检测到细胞的生长受到抑制,且呈时间和剂量依赖性(P＜0.05)；经5、10、20、50 μmol/L的5-azaC处理48 h后,DKK3 mRNA相对表达量分别为0.208±0.017、0.365±0.013、0.489±0.017、0.582±0.011,表达强度与5-azaC浓度呈剂量依赖关系(F=370.356,P＜0.01)；MSP检测结果显示,经5-azaC处理后,DKK3基因启动子高甲基化的区域发生去甲基化.结论 5-azaC能有效逆转TPC-1甲状腺乳头状癌细胞DKK3基因的异常甲基化,从而激活DKK3基因表达,抑制肿瘤细胞生长.
关键词： 甲状腺乳头状癌 Dickkopf同源序列3基因 5-氮杂胞苷 去甲基化 -
骨髓间质干细胞体外定向肌样分化的研究
目的研究兔骨髓间质干细胞经5-氮杂胞苷诱导,在体外定向肌样分化的情况.方法取兔胫骨骨髓,分离并培养骨髓间质干细胞,用5-氮杂胞苷(10μmol/L)定向诱导,分别在培养的第7、14、21、28天用免疫组织化学的方法检测细胞中的肌球蛋白重链,取未经5-氮杂胞苷诱导正常培养的细胞为对照组.结果兔骨髓间质干细胞经5-氮杂胞苷诱导,在其培养的第21、28天免疫组织化学染色方法检测细胞中的肌球蛋白重链呈阳性,而在其培养的第7、14天以及对照组,免疫组织化学染色方法检测细胞中的肌球蛋白重链呈阴性.结论骨髓间质干细胞是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞,在5-氮杂胞苷的定向诱导下,可以肌样分化.
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5-氮杂胞苷增加鼻咽癌细胞株C666-1放射敏感度的实验
目的 研究5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-Aza)对人鼻咽癌细胞C666-1放射敏感度的影响及可能机制.方法 用不同浓度5-氮杂胞苷(0、500、1000、3000、5000 nmol/L)处理C666-1细胞,MTT法检测C666-1细胞增殖,流式细胞仪检测C666-1细胞周期,Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3、cleaved PARP及DNA损伤相关蛋白γ-H2AX的表达.结果 5-氮杂胞苷随着药物浓度的增加,对C666-1细胞生长抑制作用增强.用1 000 nmol/L 5-氮杂胞苷处理鼻咽癌细胞进行放射增敏研究.鼻咽癌细胞C666-1接受单纯电离辐射时SF2(照射2 Gy时的细胞存活率)为48％,5-氮杂胞苷联合电离辐射时SF2降为31％,放射增敏比为1.37.5-氮杂胞苷能增加电离辐射诱导凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3及cleaved PARP的表达.结论 5-氮杂胞苷增加鼻咽癌C666-1细胞对电离辐射的敏感度,可能的机制为5-氮杂胞苷能增加电离辐射诱导细胞凋亡.
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5-氮杂胞苷对DKK3去甲基化及对SGC7901胃癌细胞增殖的影响
目的 研究5-氮杂胞苷对SGC7901胃癌细胞DKK3基因启动子去甲基化对细胞增殖及凋亡的影响. 方法 采用5-氮杂胞苷处理SGC7901胃癌细胞,以未行5-氮杂胞苷处理的SGC7901胃癌细胞为对照,比较DKK3基因启动子甲基化改变及细胞增殖曲线、细胞增殖及凋亡的差异. 结果 SGC7901胃癌细胞DKK3基因启动子在5-氮杂胞苷作用前呈甲基化状态,作用后呈未甲基化状态,表明5-氮杂胞苷对SGC7901胃癌细胞DKK3基因启动子具有去甲基化作用.5-氮杂胞苷作用后的SGC7901胃癌细胞Go/Gi期比例、PI和凋亡率均显著高于作用前SGC7901胃癌细胞(均P＜0.05),S期和G2/M期显著低于作用前SGC7901胃癌细胞(均P＜0.05). 结论 DKK3基因可能具有抑癌基因作用,5-氮杂胞苷对SGC7901胃癌细胞DKK3基因启动子的去甲基化可促进细胞凋亡并抑制其增殖.
关键词： 5-氮杂胞苷 SGC7901胃癌细胞 DKK3 去甲基化 细胞增殖 -
整合素连接激酶过表达促进猪骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化
目的 探讨提高骨髓间充质干细胞(BMMSC)向心肌样细胞分化的方法,观察整合素连接激酶(ILK)过表达促进BMMSC向心肌样细胞分化的效果.方法 用包含人野生型ILK cDNA和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒载体(Ad-GFP-ILK)转染体外培养的猪BMMSC,诱导其在BMMSC中高表达,并用高浓度(50 μmol/L)的5-氮杂胞苷(5-AZA)刺激诱导BMMSC向心肌样细胞分化.实验分为空白对照组(N组)、Ad-GFP转染组(Ad组)、5-AZA诱导组(5-AZA组)、Ad-GFP-ILK转染组(ILK组).用噻唑蓝(MTF)法检测各组细胞活力;培养至2周、4周时采用免疫细胞化学染色检测心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)和α辅肌动蛋白(α-actinin)表达;4周时提取蛋白,Werstem blot检测cTnⅠ、缝隙连接蛋白43 (CX-43)、Caspase-3和ILK的表达.结果 MTT检测结果显示Ad组、5-AZA组比N组、ILK组细胞活力明显减弱(P＜0.05);但Ad组、5-AZA组之间,N组、ILK组之间比较均无统计学差异(P＞0.05).细胞培养至2周时,免疫细胞化学染色显示,5-AZA组、ILK组开始表达心肌特异性标记物cTnⅠ和α-actinin,而N组、Ad组均没有明显阳性表达.Western blot结果显示ILK蛋白在ILK组表达较其他组明显升高(P＜0.05).与N组、Ad组比较,5-AZA组、ILK组cTnⅠ表达明显升高(P＜0.05);而5-AZA组、ILK组之间,N组、Ad组之间则没有差异(P＞0.05).CX-43在4组间的表达趋势与cTnⅠ相同.Caspase-3表达在Ad组、5-AZA组较其他组明显升高(P＜0.05).结论 ILK过表达能促进BMMSC向心肌样细胞分化,其分化效率和较高浓度的5-AZA体外刺激无差异.ILK过表达对细胞增殖活力无影响,且有一定的抗凋亡作用.
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流体剪切力对5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响
目的 观察5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,并探讨流体剪切力对诱导过程的影响.方法 贴壁法从大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,进行纯化传代培养,取第4代骨髓间充质干细胞以3、5、10、15及20 μmol/L 5-氮杂胞苷分别作用12、24及48 h,用免疫荧光法鉴定分化的心肌样细胞α-肌动蛋白表达率,10 μmol/L作用24 h为佳诱导浓度.通过建立流体剪切力模型,设立以下四组:不加载流体剪切力组、加载5 dyn/cm2流体剪切力组、加载15 dyn/cm2流体剪切力组和加载25 dyn/cm2流体剪切力组,作用24 h,倒置显微镜观察诱导后骨髓间充质干细胞形态的变化,4周后逆转录聚合酶链反应测定分化的心肌样细胞心肌肌钙蛋白I mRNA的表达.结果 骨髓间充质干细胞随着传代逐渐变成梭形,5-氮杂胞苷诱导后骨髓间充质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,部分相邻细胞的突起连接成网,形态学上表现出向心肌细胞方向转化的特征.免疫荧光显示α-肌动蛋白表达阳性.经过流体剪切力作用细胞后,心肌肌钙蛋白I的表达增高,阳性条带均比未进行力学刺激的细胞表达明显,以15 dyn/cm2剪切力明显.但是25 dyn/cm2剪切力作用结果并没有随着力的增大而增大.结论 5-氮杂胞苷可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,5-氮杂胞苷可联合剪应力诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,且诱导效果优于单独使用5-氮杂胞苷.
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5-氮杂胞苷增强阿霉素对神经母细胞瘤细胞的抗瘤活性
目的 许多神经母细胞瘤细胞系及肿瘤组织标本中caspase-8表达缺失,caspase-8基因沉寂的主要原因是其启动子区域高度甲基化.该文探讨去甲基化药物5-氮杂胞苷对caspase-8表达及对化疗药阿霉素抗人神经母细胞瘤细胞作用的影响及其影响机制.方法 应用RT-PCR方法检测5-氮杂胞苷作用前后SH-SY5Y细胞中caspase-8 mRNA水平变化.MTT分析研究5-氮杂胞苷与化疗药阿霉素联合应用前后人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的存活率,以及加入caspase-8活性抑制剂后存活率的变化.结果 RT-PCR方法发现SH-SY5Y细胞株不表达caspase-8 mRNA,5-氮杂胞苷作用3d后可检测到caspase-8 mRNA表达,5d后表达较第3天增加;5-氮杂胞苷与不同浓度阿霉索(0.05,0.1,0.25,0.5 μg/mL)联合应用后SH-SY5Y细胞存活率为(77.61±7.30)%,(57.35±6.64)%,(46.25±4.46)%,(35.59±5.12)%,同一浓度单独应用阿霉素组细胞存活率为(94.89±4.15)%,(80.60±8.50)%,(64.48±4.92)%,(52.32±6.71)%,5-氮杂胞苷与阿霉素联用组细胞存活率明显低于单用阿霉素组,差异均有显著性.caspase-8抑制剂组与同一浓度的5-氮杂胞苷+阿霉素组比较,细胞存活率明显增加,依次为(92.95±3.48)%,(78.39±4.28)%,(62.31±6.50)%,(49.92±5.77)%,差异均有显著性.结论 阿霉素对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y具有增殖抑制作用,5-氮杂胞苷可以增强阿霉素的抗瘤活性.其发生机制可能是通过上调caspase-8 mRNA的表达而实现的.
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DNA甲基转移酶类在大鼠神经病理性疼痛发病机制中的作用
目的:探索DNA甲基转移酶类(DNA methyltransferases,DNMTs)在坐骨神经慢性缩窄性损伤(chronic constriction injury,CCI)大鼠神经病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)发病机制中的作用.方法:腰段鞘内置管成功的27只成年雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为假手术组+生理盐水组(sham+NS组)、CCI+NS组及CCI+5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-AZA)组(CCI+5-AZA组),每组9只.CCI术后第3天至第14天,sham+NS组和CCI+NS组每天鞘内注射1次NS,CCI+5-AZA组每天鞘内注射1次10 μmol/L 5-AZA.分别于术前及术后第3,5,7,10,14天测定各组大鼠术侧后足机械痛阈和热痛阈.术后第14天各组大鼠于深麻醉下处死,取脊髓腰膨大,采用RT-PCR,Western印迹和免疫组织化学测定DNMT1,DNMT3a和DNMT3b的表达.结果:术后第3天至第14天,CCI+NS组的机械痛阈和热痛阈均较sham+NS组明显下降(均P＜0.05).术后第5天至第14天,CCI+5-AZA组的机械痛阈和热痛阈均较CCI+NS组明显上升(均P＜0.05),但仍低于sham+NS组(均P＜0.05).DNMT1,DNMT3a和DNMT3b在大鼠脊髓腰膨大背角处有致密表达,且以胞核分布为主.术后第14天CCI+NS组的DNMT1,DNMT3a和DNMT3b表达较sham+NS组均明显上升(均P＜0.05).CCI+5-AZA组的DNMT1,DNMT3a和DNMT3b表达均较CCI+NS组明显下降(均P＜0.05),但仍高于sham+NS组(均P＜0.05).结论:DNMTs在脊髓腰膨大处的表达上调很可能在CCI大鼠NPP发病机制中起重要作用.DNMTs抑制剂5-AZA可下调DNMTs的表达和缓解CCI诱导的NPP,可能成为NPP的潜在治疗药物.
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黄芪注射液与5-氮杂胞苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的研究
目的 研究黄芪注射液与5-氮杂胞苷(5-Aza)对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymall stem cells,MSCs)分化为心肌细胞的影响.方法 在无菌条件下从成年大鼠胫骨骨髓分离出MSCs,以1:3的比例传代,取第3代的细胞,接种后随机将MSCs分为黄芪注射液诱导分化组、5-Aza诱导分化组、黄芪注射泣预处理后5-Aza诱导分化组,分别以黄芪注射液、5-Aza及黄芪注射液+5-Aza进行诱导,用相差显微镜观察各组细胞形态变化;免疫细胞化学鉴定MSCs表面标志物及心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ.结果 各组诱导后细胞形态发生改变,细胞之间形成连接,排列方向趋于一致,免疫组化检测结果显示肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)表达均阳性.黄芪注射液组与5-Aza组相比其诱导率无明显区别,但黄芪注射液+5-Aza组阳性细胞比率均高于5-Aza组及黄芪注射液组,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 黄芪注射液可体外诱导MSCs分化为心肌样细胞,采用黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化的方法优于单纯采用黄芪注射液或5-Aza诱导法.
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5-氮杂胞苷对Eca109细胞增殖及RUNX3基因表达的影响
目的 探讨去甲基化制剂5-氮杂胞苷(5-azaC)干预对Eca109细胞增殖及其抑癌基因RUNX3表达的影响.方法 应用MTT法来观察5-azaC对Eca109细胞增殖的抑制能力;采用10 μmol/L、20 μmol/L和50 μmol/L 3种不同浓度的5-azaC处理Eca109细胞株,采用MSP检测干预前后RUNX3基因启动子区的甲基化状况;应用RT-PCR、Western blotting检测干预前后RUNX3基因的mRNA和蛋白表达水平的变化.结果 Eca109细胞RUNX3基因启动子区处于异常的高甲基化状态,经5-azaC处理后,高甲基化的RUNX3基因启动子部分去甲基化;处理前启动子高甲基化的RUNX3基因其mRNA或蛋白均不表达,去甲基化处理后能重新激活该基因表达,经3种不同浓度5-azaC处理后,Eca109细胞生长减慢.结论 启动子区高甲基化是食管癌Eca-109细胞RUNX3基因失活的主要原因之一, 5-azaC能逆转RUNX3基因甲基化状态, 从而调控RUNX3基因表达并抑制细胞生长.
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骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究
目的 通过体外诱导研究大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化,为心衰的干细胞移植治疗提供实验依据.方法 分离培养大鼠骨髓间充质干细胞.采用5-氮杂胞苷定向诱导,通过形态学、免疫细胞化学及磷钨酸苏木素染色(PTAH)鉴定.结果 诱导后细胞以梭形、柱状为主;部分细胞有分支,核一个、卵圆形、居中,类似心肌细胞形态;诱导24 h后培养2周,Sarcomeric Actin和Connexin-43表达较弱,以后表达逐渐增强;诱导细胞PTAH阳性.结论 骨髓间充质干细胞能在体外被诱导分化为心肌样细胞,有望成为心衰时干细胞移植治疗的理想细胞材料.
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定向诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化
目的:采用骨髓间充质干细胞体外转化为心肌样细胞,为心衰的干细胞移植治疗提供基础.方法:分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,5-氮杂胞苷诱导24h后正常培养,通过形态学、PAS反应、磷钨酸苏木素染色(PTAH)、免疫细胞化学染色作鉴定.结果:诱导细胞以梭形、柱状为主,部分细胞有分支,单个核、卵圆形、居中,似心肌细胞,PAS及PTAH染色均为阳性.诱导后培养2周的细胞表达Sarcomeric Actin和Connexin-43较弱,以后表达逐渐增强,而且1、3、5代细胞均稳定表达.结论:骨髓MSCs可在体外被诱导分化为心肌样细胞,有望成为心衰干细胞移植治疗的理想细胞材料.
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5-氮杂胞苷联合伊马替尼对胃肠间质瘤的体外治疗作用
目的 观察甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5-aza-CdR)联合伊马替尼对人胃肠间质瘤(GIST)细胞GIST 882生长、运动、侵袭和凋亡的影响.方法 MTT法检测不同浓度5-aza-CdR、伊马替尼及双药联合作用对GIST882细胞生长情况的影响；平板克隆形成实验检测克隆形成数;迁徙运动及侵袭实验观察药物干预对细胞运动和侵袭能力的影响;流式细胞术检测各组细胞周期和凋亡的情况.结果 5-aza-CdR与伊马替尼对GIST882细胞均有较强的抑制作用,此作用呈浓度和时间依赖性;两药联用的抑制率较单独应用明显增高(P＜0.05).药物作用48 h时,5-aza-CdR组(1000 μg/L)的细胞凋亡率为(11.7±1.2)％,伊马替尼组(100 μmol/L)则为(14.6±0.8)％,与对照组(2.8±0.3)％相比,差异有统计学意义(P=0.000).联合组细胞凋亡率为(19.4±1.1)％,明显高于单药组(与5-aza-CdR组相比,P=0.000;与伊马替尼组相比,P=0.013).5-aza-CdR可使GIST882 G0/G1期比例增加,S期比例降低,伊马替尼组及联合用药组对细胞周期的改变不明显.结论 去甲基化药物有望成为GIST药物治疗中单独或联合用药的新选择.
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骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞及其内向整流钾电流特征
[目的]体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌细胞并探讨其内向整流钾电流(Ik1)特征.[方法]采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓MSCs,在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导,用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法鉴定诱导细胞,并采用全细胞膜片钳技术检测Ik1表达.[结果]诱导后细胞体积较诱导前增大,呈长梭形.14 d后细胞之间出现连接,排列方向渐趋一致.免疫细胞化学染色显示Desmin、αt-sarcomeric actin和心肌特异性cTnI呈阳性反应,RT-PCR结果表明诱导细胞有心肌β肌球蛋白重链表达.诱导细胞Ik1表达呈明显的不均一性,部分细胞Ik1与正常心室肌细胞相似,但Ik1电流密度总体上低于正常心室肌细胞.[结论]5-氮杂胞苷能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化;诱导细胞Ik1表达不均一性提示可能有致心律失常潜能.
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骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞的初步实验观察
目的体外培养并诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌细胞.方法采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓MSCs,在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导,用免疫细胞化学的方法鉴定肌细胞及心肌细胞特异蛋白的表达.结果诱导后细胞体积较诱导前增大,而且更加细长,呈长梭形.14 d细胞之间出现连接,排列方向渐趋一致.免疫细胞化学染色显示Desmin,α-SarcomericActin和心肌特异性cTnI呈阳性反应.结论MSCs可能具有表达心肌细胞的特异性启动或分化调控基因,5-氮杂胞苷能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化.
