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虫草素增强顺铂诱导的食管癌细胞系Eca109凋亡
目的 研究虫草素与顺铂联合用药对食管癌细胞Eca109凋亡的影响及其作用机制.方法 将食管癌细胞Eca109分为对照组、不同浓度虫草素处理组、不同浓度顺铂处理组和虫草素(70 μg/mL)与顺铂(0.8 μg/mL)联合处理组.MTS法检测Eca109细胞增殖;Hoechst 33258染色法及流式细胞术检测Eca109细胞凋亡;Western blot法检测细胞核内NF-κB P65及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达水平;ELISA法检测细胞核内NF-κB P65与DNA的结合活性.结果 虫草素与顺铂联合应用使顺铂对Eca109细胞的抑制率由29.30％增加至70.41％ (P ＜0.05),增强了顺铂对Eca109的敏感性;与顺铂单独用药相比,联合用药能够显著增加顺铂诱导的细胞凋亡(P＜0.05);与对照组相比顺铂能够增加细胞核内NF-κB P65的活性,而虫草素却能抑制NF-κB P65的活性,联合用药后NF-κB P65的活性下调;与虫草素和顺铂单独用药相比,联合用药组能够使抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低(P＜0.05),而促凋亡蛋白Bax表达则显著增高(P＜0.05).结论 虫草素可能通过抑制NF-κB途径,调节下游信号分子Bcl-2和Bax的表达,增强顺铂对Eca109的凋亡诱导效应.
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X射线对食管鳞癌细胞HOTAIR,Snail及E-cadherin表达水平影响
目的:探索X线诱导食管鳞癌细胞内HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)及上皮间质化相关因子Snail,E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达的时间剂量效应.方法:0、2、4、6、8 GyX射线分别照射食管鳞癌Ecal09细胞后,分别于0、2、4、8、16、24 h提取细胞内总RNA及蛋白,实时定量PCR检测(real-time quantitative PCR,qRTPCR)及Western blot检测相应指标mRNA及蛋白的表达水平.结果:Eca109细胞接受X线照射后继续培养24 h后发现,随X线照射剂量渐增大(0→2→4→6→8 Gy),HOTAIR与Snail表达水平逐渐升高:HOTAIR mRNA,Snail mRNA在6 Gy与8 Gy照射组表达水平显著高于0 Gy组,Snail蛋白在4 Gy照射组即有显著升高;而E-cadherin mRNA与其蛋白表达水平逐渐降低,6 Gy与8 Gy照射组显著低于0 Gy组,均P＜0.01.细胞接受8GyX线照射后,伴随照射后培养时间延长(0→2→4→8→16→24 h)细胞内HOTAIR,Snail表达水平逐渐升高:与0 Gy组相比,细胞培养至第8小时HOTAIRmRNA表达水平显著升高,培养至第16小时Snail mRNA与其蛋白表达水平显著升高;而E-cadherin mRNA与其蛋白伴随照射后培养时间延长表达水平逐渐降低,培养至第8小时E-cadherin与其蛋白表达水平即显著低于0 Gy组(均P＜0.01).结论:X射线诱导HOTAIR,Snail及E-cadherin 的异常表达呈时间和剂量依赖性,三者可能共同参与肿瘤细胞放疗抵抗形成.
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shRNA沉默Bmi-1质粒构建及对鳞癌细胞ECA109增殖的影响
目的 研究shRNA沉默Bmi-1基因对鳞癌细胞ECA109增殖变化的影响,探讨Bmi-1基因在鳞癌细胞增殖中的作用.方法 采用RT-PCR和Western blot法分别检测Bmi-1在Fibroblast细胞、Hacat细胞、A431细胞、ECA109细胞中的表达.构建重组质粒GPU6/GFP/Neo-shBmi-1,脂质体转染ECA109细胞后,检测细胞中Bmi-1表达变化.MTI法检测转染前后细胞抑制率,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化.结果 与Fibroblast细胞和Hacat细胞相比,Bmi-1在鳞癌细胞系A431、ECA109中含量明显升高.重组载体GPU6/GFP/Neo-shBmi-1构建成功,转染ECA109细胞后Bmi-1表达明显降低(P＜0.05).与对照组相比,转染后细胞增殖明显受到抑制(P＜0.05);G1期细胞明显增加(P＜0.05),S期细胞明显减少(P＜0.05).结论 Bmi-1与细胞恶性增殖相关.在ECA109细胞中沉默Bmi-1,可改变细胞周期,从而抑制细胞增殖.
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ECA109细胞对二甲基亚枫耐受剂量的分析
目的:通过观察不同剂量二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO) 作用下ECA109细胞形态和生长状态的变化,确定ECA109细胞对DMSO的耐受剂量.方法:按照一定浓度梯度(V/V)将DMSO加入培养液,干预后的24h、48 h和72h于倒置相差显微镜下观察AO/EB染色前后细胞的形态特征,同时用四甲基偶氮唑蓝(MTT) 显色法检测细胞的生存率和计算半数抑制浓度(50% inhibiting concentration,IC50).结果:DMSO浓度为8 ml/L时,24h内ECA109细胞生长正常,形态完活力与对照组无差别,浓度提高到10 ml/L时,24h时细胞生存率可下降10%,随着作用时间延长,细胞生存率进一步降低;24 h的IC50值约为17.34/L,48h和72 h对应的IC50值分别为13.7ml/L和11.24 ml/L.结论:对ECA109细胞而言,24 h内的应用终浓度应低于10 ml/L,干预时间如需延长,DMSO的应用剂量应相应降低.
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缺氧对食管癌细胞增殖及凋亡的影响
目的:探讨缺氧对人食管癌细胞Eca109增殖及凋亡的影响及其作用机制,为食管癌的诊断和治疗提供新的思路和路径.方法:以终浓度为250μmol/L氯化钴模拟缺氧环境,将人食管癌细胞Eca109于常氧及缺氧条件下分别培养12h、24 h、36h、48 h,采用倒置相差显微镜观察细胞生长情况,MTT法检测细胞增殖情况,利用细胞活力分析仪NC-3000检测各组细胞凋亡情况.结果:相对于常氧对照组而言,缺氧后各组Eca109细胞增殖减弱,凋亡细胞比率明显升高,其中以缺氧24 h的凋亡细胞比率高,缺氧36 h的凋亡细胞比率较缺氧24 h时有所回落.结论:缺氧可以抑制人食管癌细胞Eca109的增殖并诱导其凋亡.
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YC-1对食管癌细胞Eca109缺氧诱导因子1α表达的抑制效应
食管癌是我国的常见消化道恶性肿瘤之一,在部分地区发病率和死亡率均在第一位,发现一种新的有效药物对于治疗食管癌具有重要意义.食管癌存在缺氧微环境,目前研究表明缺氧诱导因子(HIF)-1α在食管癌的发生中起着重要作用,与微血管密度、肿瘤远处转移、化学治疗药物敏感性等有关.
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香加皮单体成分宝藿苷I对食管癌细胞增殖及凋亡的影响
目的:研究香加皮单体成分宝藿苷Ⅰ在体内外对人食管癌细胞Eca109的增殖抑制作用及其对细胞凋亡的影响.方法:采用柱层析和高效液相色谱等逐步分离法对香加皮抗肿瘤活性成分进行分离和纯化,应用薄层层析和电喷质谱分析进行成分鉴定;采用MTT法分析不同浓度宝藿苷Ⅰ对食管癌细胞株Eca109增殖的抑制作用;应用FCM分析细胞周期变化和凋亡率变化;皮下注射Eca109细胞建立裸鼠移植瘤动物模型,通过肌肉注射给药检测宝藿苷Ⅰ的体内抗肿瘤效果;Western 印迹法检测移植瘤组织凋亡相关基因survivin的表达变化.结果:宝藿苷Ⅰ可明显抑制Eca109细胞的增殖(P<0.05),并呈浓度及时间依赖性.经宝藿苷Ⅰ作用48 h后,随着药物浓度的增加(12.5、25.0和50.0 μg/mL),Eca109细胞G0/G1期明显增加(P<0.05),S期和G2/M期细胞明显减少(P<0.05);经宝藿苷Ⅰ作用后,Eca109细胞的凋亡率随药物作用时间的延长(24、48和72 h)和宝藿苷浓度的增加(0、12.5、25.0和50.0 μg/mL)而明显升高(P<0.01);Eca109裸鼠移植瘤经宝藿苷Ⅰ(15 mg/kg)治疗后,肿瘤生长受到明显抑制(P<0.01),生长抑制率达(60.9±0.16)%;survivin的蛋白表达明显降低(P<0.05).结论:香加皮单体成分宝藿苷Ⅰ不仅在体外对Eca109细胞的增殖具有显著的抑制作用,在体内也有较好的抗食管癌效果.其抗瘤机制可能与阻滞Eca109细胞周期发展和诱导凋亡相关基因survivin的表达降低有关.
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POLⅠ基因对人食管癌细胞放化疗敏感性的影响
目的:探讨DNA聚合酶Ⅰ(DNA polymeraseⅠ,POLⅠ)基因对人食管癌细胞ECA-109放射敏感性及对化疗药物顺铂敏感性的影响.方法:利用已经构建成功的针对POLⅠ基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)重组质粒,转染ECA-109细胞,通过倒置荧光显微镜观察转染效率,实时荧光定量PCR检测转染后ECA-109细胞中POLⅠ的mRNA表达水平,用细胞克隆形成实验来研究shRNA抑制POLⅠ表达后ECA-109细胞对X线放疗敏感性的变化,用MTT法检测POLⅠ基因敲除后ECA-109细胞对顺铂敏感性的变化.结果:沉默POLⅠ基因的shRNA转染ECA-109细胞后,荧光倒置显微镜下可见大量绿色荧光颗粒；实时荧光定量PCR检测发现,转染后细胞中POLⅠ的mRNA表达水平显著降低(P＜0.05)；转染后的细胞对放疗敏感性提高,对顺铂的敏感性提高(P＜0.05).结论:shRNA有效下调细胞中POLⅠ的表达,提高了肿瘤细胞对化疗药物顺铂和放疗的敏感性.
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miR-155-5p在食管鳞癌中的表达及其功能
目的： miRNA在癌症的发生、转移、侵袭、血管生成等方面起着重要的调控作用。文中通过检测miR-155-5p在食管鳞癌中的表达，研究其在食管鳞癌发生、发展中的功能。方法收集上海仁济医院及奉贤区中心医院胸外科手术的20例食管鳞癌组织及其距病变部位5 cm以上的正常组织，采用实时荧光定量qPCR 法检测20对癌组织和相应癌旁组织中miR-155-5p的表达差异。将合成的miR-155-5p类似转染物、抑制剂及阴性对照质粒瞬时转染食管鳞癌细胞Eca109中，利用CCK8法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡，利用细胞划痕实验检测细胞迁移。结果食管鳞癌组织中miR-155-5p表达明显高于相应癌旁组织，差异有统计学意义（529．42％vs 100％， P＜0．05）。划痕实验表明，过表达miR-155-5p时，食管鳞癌细胞的迁移能力增强。类似转染物转染的细胞凋亡率[（5．43±3．09）％]较抑制剂[（5．28±1．98）％]及阴性对照[（5．67±1．99）％]差异均无统计学意义（P＞0．05）。结论 miR-155-5p在食管鳞癌组织中的表达明显上调，具有食管鳞癌早期诊断的潜在价值；上调miR-155-5p的表达对Eca109增殖和凋亡未见明显影响，但显著促进了Eca109细胞的迁移，提示miR-155-5p的表达变化可能与食管鳞癌早期转移有关。
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Bufalin对食管癌ECA109细胞中FAK活化和上皮-间质转化的影响
目的 探讨Bufalin对食管鳞状细胞癌ECA109细胞中FAK活化和上皮-间质转化(epithelial-mesenehymal transition,EMT)的影响.方法 采用RT-PCR法检测不同浓度Bufalin对食管鳞状细胞癌ECA109细胞中FAK、E-cadherin、vimentin mRNA表达的影响.Western blot法检测不同浓度Bufalin对ECA109细胞中FAK活化水平及FAK、E-cadherin、vimentin蛋白表达的影响.采用Transwell小室实验检测不同浓度Bufalin对ECA109细胞迁移与侵袭能力的影响.结果 RT-PCR结果表明Bufalin抑制FAK、E-cadherin、vimentin的mRNA表达.Western blot结果表明Bufalin抑制E-cadherin、vimentin的表达和FAK的活化.Transwell实验结果表明Bufalin可以抑制ECA109细胞的迁移及侵袭.药物干预组(20、40、60、80、100 nmol/L Bufalin及PF562271组)与阳性对照组相比,Transwell迁移实验结果显示穿过基膜的细胞个数由107.00±8.19下降至78.67±3.06、61.67±3.06、42.67±3.512、24.33±2.517、10.33±3.215、9.00±2.65;Transwell侵袭实验结果显示穿过基膜的细胞个数由127.67±8.02下降至102.33 ±4.51、87.33±7.10、73.00±4.58、57.33±2.52、39.00±3.61、37.33±2.52,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 Bufalin可以抑制食管鳞状细胞癌中FAK的活化,提示Bufalin可能是通过下调FAK来抑制食管鳞状细胞癌EMT过程及食管癌的迁移及侵袭.
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蟾毒噻咛的抗肿瘤作用
目的：研究蟾毒噻咛的抗肿瘤作用。方法：取3种肿瘤细胞株ECa109、HepG2、A549，每种细胞分为9组，分别加入0．125、0．250、0．500、1．000、2．000、4．000、8．000、16．000、32．000 mg/L的蟾毒噻咛处理48 h。采用MTT比色实验计算细胞增殖抑制率；采用流式细胞术检测HepG2细胞周期及凋亡。建立荷S180腹水瘤昆明小鼠模型，随机分为5组，每组20只，阴性对照组注射溶剂，阳性对照组每天给予20 mg/kg的5-FU，蟾毒噻咛低、中、高剂量组分别给予15、20和30 mg/kg的蟾毒噻咛，连续腹腔注射给药7 d。末次给药后每组随机抽取半数荷瘤小鼠，收集腹水，计算腹水抑制率和瘤细胞存活率；剩余小鼠统计生存时间，计算生命延长率。结果：随着药物质量浓度的增大，蟾毒噻咛对3种肿瘤细胞的抑制作用增强，其中对HepG2细胞的抑制作用强（ F＝6．785、29．641和14.455，P＜0．05）；蟾毒噻咛能诱发HepG2细胞凋亡，将细胞周期阻滞在G2期。蟾毒噻咛还能提高荷瘤鼠腹水抑制率，抑制瘤细胞存活率，提高荷瘤鼠生命延长率（F＝412．321、900．735和1151．272，P＜0．05）。结论：蟾毒噻咛具有抗肿瘤作用。
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仙鹤草水提液对食管癌Eca109细胞生长的抑制作用
目的:研究仙鹤草水提液对人食管癌Eca109细胞生长的抑制作用及其可能机制.方法:MTT法测定0g/L、2 g/L、4 g/L、8 g/L、16 g/L的仙鹤草水提液分别作用于Eca109细胞24 h、48 h、72 h,观察对Eca109细胞生长的抑制作用;采用免疫组织化学染色技术检测16 g/L仙鹤草水提液作用72 h对Eca109细胞Bcl-2、P53蛋白表达的影响.结果:MTT结果显示16 g/L仙鹤草水提液作用48 h和72 h后Eca109细胞生长明显受抑;免疫组化结果显示16 g/L仙鹤草水提液作用72 h后Eca109细胞内Bcl-2蛋白表达下调,P53蛋白表达上调.结论:仙鹤草水提液体外能诱导Eca109细胞凋亡,其机制可能与下调Bcl-2蛋白表达及上调P53蛋白表达有关.
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miR-199 a-3 p对Eca109和KYSE450细胞周期和迁移的影响
目的:观察miR-199a-3p对食管鳞癌细胞周期及迁移能力的影响,并探讨其分子机制.方法:常规培养Eca109和KYSE450细胞,分别转染miR-199a-3p mimics及miR-199a-3p mimics negative control(阴性对照).采用qRT-PCR法检测3组细胞中miR-199a-3p的表达水平,并用流式细胞术及划痕实验分别检测细胞周期及细胞迁移能力,用Western blot检测细胞中mTORC2信号通路相关蛋白[mTOR、Rictor、PI3K、p-Akt(T308)、p-Akt(S473)]的表达.结果:与阴性对照相比,转染miR-199a-3p mimics后,Eca109和KYSE450细胞中miR-199a-3p表达量增加;G1期细胞增多,细胞相对迁移率降低,mTOR和Rictor蛋白的表达水平降低,而PI3K、p-Akt(T308)和p-Akt(S473)蛋白的表达水平升高(P均<0.05).结论:miR-199a-3p可能通过调控mTORC2信号通路来影响食管鳞癌细胞周期进程及细胞迁移.
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β-胡萝卜素对食管癌细胞凋亡与 Cav-1表达的影响
目的：观察β-胡萝卜素对食管癌细胞凋亡的影响，并分析食管癌细胞对β-胡萝卜素的敏感性与小窝蛋白-1（Cav-1）表达的关系。方法：采用Western blot法检测正常食管上皮细胞株Het-1A及食管癌细胞（TE1、EC1和Eca109）中Cav-1蛋白的表达；CCK-8法检测不同浓度（0、1、5、10、20、30、50μmol／L）β-胡萝卜素处理食管癌细胞12、24、36、48、60、72 h后，对食管癌细胞增殖抑制的影响，筛选出β-胡萝卜素的佳处理时间及浓度；在筛选条件下处理食管癌细胞，采用Annexin V-FITC／PI双染法检测细胞凋亡率；qRT-PCR检测Cav-1 mRNA表达水平的变化；Western blot检测Cav-1蛋白表达水平的变化。结果：Cav-1蛋白在食管癌细胞中呈过表达（ TE1＞Eca109＞EC1），而Het-1A细胞中无Cav-1表达。β-胡萝卜素对正常食管上皮细胞的增殖无抑制作用，而对食管癌细胞（ TE1、EC1和Eca109）的增殖抑制作用具有时间和剂量依赖性，且食管癌细胞对β-胡萝卜素的敏感性与Cav-1的表达有关。分别采用30、50、50μmol／Lβ-胡萝卜素处理48 h后，TE1、Eca109和EC1细胞凋亡率显著提高（P＜0．05），Cav-1 mRNA和蛋白质表达水平均明显下降。结论：β-胡萝卜素能够有效促进食管癌细胞凋亡，而对正常食管上皮细胞无毒性作用，且食管癌细胞对β-胡萝卜素的敏感性可能受到Cav-1的调节。
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下调 Ets2表达对裸鼠食管鳞癌移植瘤生长及 mTOR／p70S6K信号通路的影响
目的：探讨下调Ets2表达对裸鼠Eca109移植瘤生长及mTOR／p70S6K信号通路的影响。方法：选择已筛选出的在体外靶向下调Ets2基因表达的siRNA片段，构建包含此片段的慢病毒（LV-siEts2）并感染Eca109，15只裸鼠随机分为空白对照组、阴性对照组和LV-siEts2组，分别背部皮下接种Eca109、LV感染的Eca109和LV-siEts2感染的Eca109，形成移植瘤，之后观察肿瘤生长情况、绘制肿瘤生长曲线并计算肿瘤抑制率。应用qRT-PCR检测肿瘤组织中Ets2 mRNA的表达，TUNEL法检测肿瘤组织细胞的凋亡，Western blot法检测肿瘤组织中Ets2、Caspase-3、Bcl-2、E-cadherin以及mTOR／p70S6K信号通路蛋白的表达。结果：LV-siEts2组肿瘤生长速度明显变慢，肿瘤体积和质量显著小于空白对照组和阴性对照组（P＜0．05）；LV-siEts2组肿瘤组织中Ets2 mRNA及蛋白表达水平均显著降低；LV-siEts2能引起Eca109细胞的凋亡，且上调Caspase-3和E-cadherin蛋白表达水平，而下调Bcl-2蛋白表达水平（P＜0．05）；LV-siEts2能显著降低mTOR及p70S6K的蛋白表达。结论：LV-siEts2在体内通过抑制mTOR／p70S6K信号通路促进细胞凋亡，从而抑制裸鼠Eca109移植瘤的生长。
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辣椒素对食管鳞状细胞癌细胞凋亡和 NF-κB 信号通路相关蛋白表达的影响
目的：探讨辣椒素对食管鳞状细胞癌（食管鳞癌）细胞凋亡和NF-κB信号通路的影响。方法：采用Western blot法检测食管鳞癌EC9706和Eca109细胞中IκBα、磷酸化IκBα（ pIκBα）、p50和p65蛋白的表达及0、50、100和200μmol/L辣椒素作用后pIκBα和Bcl-2蛋白的表达；凝胶滞留实验检测2种食管鳞癌细胞胞核中NF-κB与DNA的结合活性及0、100和200μmol/L辣椒素作用对NF-κB与DNA结合活性的影响。2种食管鳞癌细胞分别分为对照组、5-FU组、辣椒素组和联合组，流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果：2种食管鳞癌细胞胞质均表达IκBα和pIκBα蛋白，胞核均表达p50和p65蛋白；随辣椒素作用浓度的增加，pIκBα和Bcl-2蛋白的表达逐渐下降，NF-κB与DNA的结合活性也逐渐下降。辣椒素可促进2种食管鳞癌细胞的凋亡，与5-FU 联合使用时，凋亡细胞显著增加（EC9706：F辣椒素＝2535．497，F交互＝113．034，P＜0．001；Eca109：F辣椒素＝5984．040，F交互＝5．150，P＜0．05）。结论：辣椒素可能通过抑制IκBα的磷酸化阻断NF-κB信号通路，促进食管鳞癌细胞凋亡。
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EC9706、Eca109细胞系中S100A4及基质金属蛋白酶-2的表达
目的:检测食管鳞状细胞癌EC9706、Eca109细胞系中S100A4及基质金属蛋白酶-2(MMP-2,的表达.方法:采用免疫细胞化学法和Western blotting法检测EC9706、Eca109中S100A4蛋白及MMP-2蛋白的表达,采用RT-PCR法检测EC9706和Eca109细胞中S100A4与MMP-2的mRNA表达.结果:EC9706、Eca109细胞系中均存在S100A4与MMP-2蛋白及mRNA的表达,S100A4蛋白及MMP-2蛋白的阳性表达主要定位于胞浆中,Eca109细胞系中偶见胞核着色.Eca109细胞系中S100A4与MMP-2蛋白和S100A4 mRNA的表达量高于EC9706(P<0.05).结论:在EC9706、Eca109细胞系中均有S100A4、MMP-2的表达,提示S100A4可能在食管鳞状细胞癌的发生、发展中起重要作用.
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微小RNA-26a对食管癌Eca109细胞增殖、迁移、凋亡及细胞周期的影响
目的 探讨微小RNA-26a(miR-26a)对食管癌Eca109细胞增殖、迁移、凋亡和细胞周期的影响.方法 将正常培养的人食管鳞状细胞癌Eca109细胞随机分为正常对照组(正常培养的不加任何类型慢病毒的Eca109细胞)、阴性对照组(转染随机序列慢病毒)及miR-26a过表达组(转染miR-26a过表达慢病毒).分别采用四甲基偶氮唑盐实验、细胞划痕实验、流式细胞术检测细胞增殖、迁移、细胞周期和凋亡情况.结果 转染后72、96h,miR-26a过表达组细胞增殖能力低于正常对照组和阴性对照组(P＜0.05);阴性对照组与正常对照组细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P＞0.05).转染后72 h,miR-26a过表达组细胞划痕愈合率低于正常对照组和阴性对照组(P＜0.05);阴性对照组与正常对照组细胞划痕愈合率比较差异无统计学意义(P＞0.05).转染后48 h,miR-26a过表达组G1、G2期细胞所占比例高于正常对照组和阴性对照组,S期细胞所占比例低于正常对照组和阴性对照组(P＜0.05).阴性对照组与正常对照组细胞G1、S和G2期细胞所占比例比较差异无统计意义(P＞0.05).结论 miR-26a可以抑制人食管鳞状细胞癌Eca109细胞增殖和迁移,阻断细胞由G1期向S期过渡,但对细胞的凋亡无明显影响.
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ANTXR1对人食管癌ECA109细胞株迁移和侵袭能力的影响
目的 研究炭疽毒素受体1(anthrax toxin receptor 1,ANTXR1)对食管癌细胞系ECA109的迁移及侵袭能力的影响及机制.方法 采用化学合成ANTXR1基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)下调该基因表达,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western blot检测转染后的细胞内ANTXR1、基质金属蛋白酶2(matirx metallo-proteinases 2,MMP 2)和基质金属蛋白酶9(matirx metallo-proteinases 9,MMP 9)的表达,通过细胞划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测ANTXR1对ECA109细胞迁移和侵袭的影响. 结果 将ANTXR1转染入ECA109后,细胞中ANTXR1 mRNA和蛋白水平都明显降低,MMP2、MMP9表达明显下调,ECA109细胞的迁移和侵袭能力显著降低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论 在食管癌细胞系ECA109中ANTXR1与细胞的迁移和侵袭能力相关,ANTXR1可能通过影响MMP2和MMP9的表达参与其中,有望成为食管癌早期诊断、分子治疗的靶点.
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5-氮杂胞苷对Eca109细胞增殖及RUNX3基因表达的影响
目的 探讨去甲基化制剂5-氮杂胞苷(5-azaC)干预对Eca109细胞增殖及其抑癌基因RUNX3表达的影响.方法 应用MTT法来观察5-azaC对Eca109细胞增殖的抑制能力;采用10 μmol/L、20 μmol/L和50 μmol/L 3种不同浓度的5-azaC处理Eca109细胞株,采用MSP检测干预前后RUNX3基因启动子区的甲基化状况;应用RT-PCR、Western blotting检测干预前后RUNX3基因的mRNA和蛋白表达水平的变化.结果 Eca109细胞RUNX3基因启动子区处于异常的高甲基化状态,经5-azaC处理后,高甲基化的RUNX3基因启动子部分去甲基化;处理前启动子高甲基化的RUNX3基因其mRNA或蛋白均不表达,去甲基化处理后能重新激活该基因表达,经3种不同浓度5-azaC处理后,Eca109细胞生长减慢.结论 启动子区高甲基化是食管癌Eca-109细胞RUNX3基因失活的主要原因之一, 5-azaC能逆转RUNX3基因甲基化状态, 从而调控RUNX3基因表达并抑制细胞生长.
