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蛹虫草中虫草素抗癌活性研究进展
虫草素是一种脱氧核苷类抗生素，具有多种生物学活性。本文综述了国内外虫草素抗癌活性的研究现状，主要概括了虫草素对癌细胞作用和虫草素抗癌机制的研究进展。虫草素的抗癌活性，它有望成为临床可用的抗肿瘤药物，但来源有限。
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反相高效液相色谱法测定大鼠全血中虫草素含量
目的 建立一种测定血液中虫草素含量的反相高效液相色谱法.方法 大鼠全血0.4ml,加入甲醇1.6ml,4℃12000 r/min离心10 min,取上清液50℃氮气吹干,用0.15 ml甲醇复溶,12000r/min离心15 min,取上清液10μl进样;色谱条件为ODS-SP C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以甲醇∶水=27∶73为流动相;流速0.8 ml/min;柱温35℃;紫外检测波长259 nm;检测血中虫草素含量.结果 虫草素浓度在0.1 ～5.0 μg/ml范围内线性关系良好,相关系数为0.9998;浓度为0.2、1.0、5.0 μg/ml时日内RSD(％)分别为5.38、0.63、2.95,日间RSD(％)分别为2.20、4.41、2.57;检出限(S/N=3)为0.05 μg/ml;全血中浓度为0.1、0.8、1.5 μg/ml时回收率为85％ ～ 102％.结论 该反相高效液相色谱法灵敏度高,重复性好,能有效分离检测血中虫草素含量.
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RP-HPLC法测定冬虫夏草发酵液冻干粉中虫草素和腺苷含量
目的 有效地控制冬虫夏草发酵液冻干粉的质量.方法 建立了测定虫草素和腺苷含量的反相高效液相色谱法(RP-HPLC).色谱条件:C18柱(250 mm × 4.6mm ,5μm);流动相为乙腈+水+甲醇(2+85+2);流速为1.0 ml/min;紫外检洲波长260 nm.结果 虫草素浓度在0.45～18.00 μg/ml范围内与峰面积呈线性相关,r=0.999 3,平均回收率为96.5%,RSD为2.3%.腺苷浓度在1.76-17.60μmg/ml范围内与峰面积呈现性相关,r=0.9990,平均回收率为97.3%,RSD为1.0%.结论 该方法样品处理简便,结果可靠,重现性好,可有效地控制冬虫夏草发酵液冻干粉的质量.
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虫草素的体内代谢特点及药理作用
虫草素(cordycepin)是一种具有广泛生物活性和药理作用的脱氧核苷类似物,对多种疾病都有潜在的治疗作用.但从50年代被发现以来有关其体内实验的报道甚少,主要是由于它在体内腺苷脱氨酶(ADA)的作用下快速脱氨基后会变为生物活性极小的3′-脱氧次黄嘌呤核苷.近几年的研究表明,ADA抑制剂能有效延缓虫草素在体内的代谢.本文介绍了虫草素体内代谢和药理作用的特点及其与ADA抑制剂联合应用的研究进展.
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不同产地蝉花中腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量比较
目的 分析比较10批不同产地蝉花中腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量,为蝉花的质量评价及生产用药的筛选提供方法和基础数据.方法 采用高效液相色谱法分别测定不同产地蝉花中腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量.结果 腺苷以江苏茅山的蝉花含量高,为44.957μg/g,广西玉林的低,为11.331μg/g;虫草素以四川宜宾的含量高,为191.725μg/g,江西九江的蝉花含量低,为25.437μg/g;各产地麦角甾醇含量差异相对较小,范围为120.024~301.652μg/g.结论 不同产地蝉花中的腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量差异较大;该方法适用于蝉花中腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量测定,为其质量评价提供参考.
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虫草素治疗抑郁症的生物学机制及效果研究
抑郁症是一种高患病、高复发的精神类疾病.目前临床常用的抗抑郁药物,主要是基于上世纪50年代开发的三环类和单胺氧化酶抑制剂,其通过调节脑中5一羟色胺或去甲肾上腺素的水平,缓解患者的抑郁症状.新研发的抗抑郁药虽然特异性较以往有所提升,但仍然存在起效慢、患者应答率低和副作用严重等弊端.虫草素是我国传统中医药材冬虫夏草的主要活性成分.本文通过综述现有文献,讨论虫草素的抗抑郁效果及其涉及的生物学机制,为传统中医药材的研发应用和中医现代化进程提供新的思路和参考.
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工业化培育北虫草生物活性成分含量变化的研究
目的:明确工业化培育北虫草的主要生物活性成分在不同生长时期含量变化的规律.方法:采用HPLC和苯酚硫酸法,分别对不同生长时期的工业化培育的北虫草的虫草素、腺苷和虫草多糖含量的变化进行了跟踪.结果:培养周期内虫草素含量随生长期增长而不断增高,而腺苷和虫草多糖含量均在第40d达到高值.结论:本研究结果对工业化生产,合理有效地控制北虫草产品生物活性成分的含量,具有一定指导意义.
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虫草素晶体的红外光谱及粉末X射线衍射图谱分析研究
目的:建立虫草素晶体的标准图谱和特征图谱.方法:采用红外光谱及粉末X射线衍射法对两种虫草素晶体化合物进行分析,获得了两种虫草素晶体的特征峰值、标准红外光谱及粉末X射线衍射图谱.结果:证实了虫草素的多晶型现象,且不同虫草素晶体之间红外光谱及粉末X射线衍射图谱差异明显.结论:本方法为今后虫草素固体药物的深度开发和生产提供鉴定依据,同时为制定和规范固体药物晶型研究的有效方法和检测分析技术提供了借鉴.
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紫外诱变选育北虫草新菌种的研究
针对野生菌种在人工培养基上容易丢失产生子实体的能力,稳定性差,且野生型菌种虫草菌素等生理活性物质含量较低等影响北虫草规模化人工栽培的问题,本文探索利用紫外线对出发菌株P进行诱变处理,以生物转化率、虫草素、腺苷含量为指标,筛选出高产菌株89,其有性子实体中虫草素含量和腺苷含量分别是出发菌株的2.5倍和3.6倍.进一步对其进行传代稳定性试验测试后,可用于大规模工厂化北虫草培育用菌种.
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HPLC同时测定冬虫夏草中腺苷、虫草素和麦角甾醇
目的:建立同时测定冬虫夏草药材中腺苷、虫草素和麦角甾醇的方法.方法:Diamosil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相甲醇-水梯度洗脱,体积流量1.0 mL· min-1,柱温30℃,进样量10μL,检测波长260 nm.结果:腺苷、虫草素和麦角甾醇分别在0.032 2 ～0.805,0.015 4 ～0.385,0.084 3 ～2.107 5μg线性关系良好,回归方程分别为Y=2 573X+0.737 8;Y=2 631X +0.624 4；Y=2315X+0.4829,平均加样回收率分别为98.94％(RSD 1.16％),99.73％ (RSD 2.19％),99.55％(RSD 2.02％).结论:该方法准确性高,重复性好,可作为冬虫夏草药材的质量控制方法.
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UPLC-MS/MS同时测定蛹虫草中6种成分的含量
目的:建立同时测定蛹虫草中腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、腺嘌呤、虫草素含量的方法.方法:液质联用技术,以甲醇-0.1％甲酸溶液为流动相等度洗脱,采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱,通过电喷雾离子源,选择正离子模式多反应监测方式检测.结果:腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、腺嘌呤、虫草素的线性范围分别为37.5～1 200 μg·L-1(r=0.998 5),20 ～640 μg·L-1(r =0.996 4),40～1 280 μg·L-1(r=0.999 1),77.5 ～2 480 μg·L-1(r=0.993 5),27.5～880μg·L-1(r=0.992 4),90～2 880 μg·L-1(r=0.9937),加样回收率在92.1％～102.6％,RSD均＜8,1％.腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、腺嘌呤、虫草素在蛹虫草中的平均质量分数分别为268.33,11.28,185.66,1 421.44,10.67,812.21μg·g-1.结论:该法专属性强、快速灵敏,可用于蛹虫草中腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、腺嘌呤、虫草素的含量测定.
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冬虫夏草及其代用品中腺苷和虫草素的LC-MS-MS定量分析研究
目的:建立定量测定冬虫夏草及其代用品中腺苷和虫草素的LC-MS-MS方法.方法:HPLC-ESI-MS-MS法,用90%甲醇为提取溶剂,采用多反应监测(MRM)模式测定.结果:腺苷的回归方程Y=89.04X+506.85,r=0.999 7,虫草素的回归方程Y=99.66X+1 251.34,r=0.998 8,线性范围均为5.0～1000.0 μg·L-1;腺苷和虫草素的检出限(LOD)分别为0.44,0.31 μg·L-1,加样回收率分别为98.12%,97.94%.结论:该法灵敏、选择性好、快速,可用于冬虫夏草及其代用品中腺苷和虫草素的定量测定和质量控制.
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用蛹虫草固体发酵法高效生产虫草素的研究
目的:研究并建立用蛹虫草固体发酵方式高效生产虫草素的佳方法.方法:通过对不同菌株在固体发酵过程中各生长期的虫草素含量变化进行跟踪测定以及正交旋转组合设计、正交试验设计等方法埘影响虫草素产量和含量的各影响因子(包括菌种、生长期、培养基配方和环境条件等)进行系统优化.结果:JF-1是虫草素生产的佳菌株,现蕾期是收获提取虫草素的佳时期;佳的培养基配方为水料比1.1:1(mL·g-1),营养水中酵母膏、蛋白胨、葡萄糖的用量分别为22.6,6.0,25.4 g·L-1,营养水pH 6.6;佳的环境条件为:光照强度4 400 lx,每日光照时间18 h,温度18～22℃.结论:用以上方法固体发酵生产虫草素,经过约13 d的培养,培养基中虫草素达到0.60%,比传统液体发酵方法的高产量高近2倍,并且培养时间缩短2 d.
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蚕虫草不同部位营养与活性成分分析
目的:明确蚕虫草不同部位的营养与活性成分,以便开发利用.方法:对蚕虫草、子座、菌核和蚕粉进行分析研究.虫草素和腺苷测定采用高效液相色谱法,虫草多糖测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法,虫草酸测定采用高碘酸钠比色法,蛋白质测定采用考马氏亮蓝比色法,粗脂肪测定采用索氏提取法.结果:蚕虫草的多糖含量达86.49 mg·g-1;子座的腺苷含量达6.82 mg·g-1;菌核的虫草素和虫草酸含量分别达到13.28 mg·g-1和44.07 mg·g-1.结论:不同活性成分在蚕虫草及其不同部位的含量不同,其中蚕虫草活性成分总量高,菌核虫草素和虫草酸含量高;研究还表明蛹虫草菌对蚕体脂肪和蛋白质的分解利用能力很强.
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虫草素调控eIF2α/TGF-β/Smad信号通路改善肾间质纤维化的机制
目的:观察冬虫夏草主要有效成分——虫草素(cordycepin)对肾间质纤维化及其eIF2α/TGF-β/Smad信号通路的干预作用和机制.方法:将15只C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组和虫草素组,建立小鼠单侧输尿管结扎(unilateralureteral obstruction,UUO)肾间质纤维化模型,虫草素组小鼠经皮下注射虫草素(5 mg·kg-1·d-1),同时,以生理盐水干预对照组和模型组,共5d.实验结束后,取小鼠结扎侧的肾脏,观察肾间质纤维化病理特征,并测定肾组织Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,Col Ⅰ)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)核酸表达(Northern blot);另外,在体外培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E细胞),在转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β联合或不联合虫草素干预后,观察Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原(collagen type Ⅳ,Col Ⅳ)核酸表达的变化(Northern blot),并检测eIF2α、磷酸化eIF2α(phosphorylated eIF2α,p-eIF2α)以及Smad2/3、磷酸化Smad2/3(phosphorylated Smad2/3,p-Smad2/3)蛋白表达的变化(Western blot).结果:虫草素在体内改善模型鼠肾间质纤维化,包括纤维化的病理特征以及Ⅰ型胶原、α-SMA核酸的表达;虫草素在体外促进NRK-52E细胞p-eIF2α的高表达,抑制TGF-β诱导的p-Smad2/3以及Ⅰ型、Ⅳ型胶原的表达水平.结论:虫草素在体内有改善肾间质纤维化的作用,它可能是通过诱导eIF2α磷酸化,抑制TGF-β/Smad信号通路中的关键信号分子——p-Smad2/3表达,减少肾组织胶原和α-SMA表达等途径而改善肾间质纤维化.
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虫草素增强顺铂诱导的食管癌细胞系Eca109凋亡
目的 研究虫草素与顺铂联合用药对食管癌细胞Eca109凋亡的影响及其作用机制.方法 将食管癌细胞Eca109分为对照组、不同浓度虫草素处理组、不同浓度顺铂处理组和虫草素(70 μg/mL)与顺铂(0.8 μg/mL)联合处理组.MTS法检测Eca109细胞增殖;Hoechst 33258染色法及流式细胞术检测Eca109细胞凋亡;Western blot法检测细胞核内NF-κB P65及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达水平;ELISA法检测细胞核内NF-κB P65与DNA的结合活性.结果 虫草素与顺铂联合应用使顺铂对Eca109细胞的抑制率由29.30％增加至70.41％ (P ＜0.05),增强了顺铂对Eca109的敏感性;与顺铂单独用药相比,联合用药能够显著增加顺铂诱导的细胞凋亡(P＜0.05);与对照组相比顺铂能够增加细胞核内NF-κB P65的活性,而虫草素却能抑制NF-κB P65的活性,联合用药后NF-κB P65的活性下调;与虫草素和顺铂单独用药相比,联合用药组能够使抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低(P＜0.05),而促凋亡蛋白Bax表达则显著增高(P＜0.05).结论 虫草素可能通过抑制NF-κB途径,调节下游信号分子Bcl-2和Bax的表达,增强顺铂对Eca109的凋亡诱导效应.
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虫草素对结肠癌细胞体外增殖、迁移能力的影响及其诱导细胞凋亡的作用
目的 研究虫草素在体外对结肠癌细胞增殖、迁移能力的影响,及其诱导肿瘤细胞凋亡的作用.方法 按血清药理学实验原则,将20只BALB/c裸鼠随机分为两组,分别喂饲虫草素或生理盐水,3 d后处死取血清,将血清按下列不同处理方法在体外与人结肠癌细胞株SW1116共培养:(1)虫草素组;(2)化疗组;(3)虫草素+化疗组(下称:联合用药组);(4)空白对照组(下称:对照组).以CCK-8法检测细胞增殖抑制作用,Transwell小室观察检测细胞迁移能力,荧光染色和流式细胞检测法观察细胞凋亡情况.结果 (1)SW1116细胞经虫草素+顺铂联合作用96 h、120 h后,细胞增殖的抑制率显著高于其余三组(P=0.02);(2)虫草素联合顺铂能显著减少肿瘤细胞迁移数(P＜0.05);(3)经Hoechst 33258荧光染色,在联合用药组中见大量被染成亮蓝色的凋亡细胞,流式细胞仪定量分析显示该组细胞凋亡率明显高于其余三组(P＜0.05).结论 虫草素及铂类化疗药(顺铂)对人结肠癌细胞株SW1116有显著抑增殖、抗迁移和促凋亡作用,虫草素与顺铂合用可显著提高这一疗效,提示虫草素有一定的化疗辅助作用.
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虫草素对小鼠慢性哮喘模型支气管平滑肌收缩的作用及机制研究
目的 评价虫草素及虫草素与糖皮质激素联合应用对慢性哮喘模型小鼠气道平滑肌收缩的调节作用及可能机制.方法 将32只C57/BL6小鼠随机分成对照组和慢性哮喘模型组,利用肌动描记仪比较p38蛋白激酶抑制剂SB239063(10-6M)、虫草素(10-6M)以及糖皮质激素地塞米松(10-6M)单独或联合孵育前、后由乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)诱导的支气管收缩反应,同时应用蛋白印迹检测支气管组织中p38蛋白激酶和热休克蛋白27(heat shock proteins 27,HSP27)的磷酸化状态.结果 模型组小鼠的支气管收缩较对照组加重,有统计学意义.对照组和模型组p38蛋白激酶抑制剂SB239063孵育1 h后对Ach介导的收缩反应较空白对照组下降(P<0.05),地塞米松单独和地塞米松联合虫草素在模型组小鼠Ach诱导支气管平滑肌收缩力的作用均较对照组降低(P<0.05);地塞米松单独和地塞米松联合虫草素孵育后,对照组和模型组小鼠支气管组织p38蛋白激酶和HSP27磷酸化水平较Ach单纯作用组降低,而且在模型组,使用虫草素干预后p38蛋白激酶和HSP27磷酸化水平较Ach单纯作用组下降(P值均<0.05).结论 Ach诱导的离体支气管收缩反应具有良好的可重复性,卵清白蛋白吸入可导致Ach诱导的支气管收缩反应加重,糖皮质激素联合虫草素治疗较糖皮质激素单独治疗更有效抑制Ach诱导的气道平滑肌收缩,此种潜在的协同作用可能通过更大程度地抑制p38蛋白激酶信号通路为机制.
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两种促渗方式对虫草素的透皮影响的实验研究
目的 以含角质层的离体大鼠腹皮为体外模型,通过Franz透皮系统,考察微针、促渗剂两种促渗方式对虫草素透过角质层的影响.方法 建立了高效液相色谱法测定虫草素方法,并测定了接收液中虫草素的含量,通过计算虫草素单位面积累积渗透量Q、稳态渗透常数J、增渗倍数ER、滞后时间Tlag,并建立了渗透模型,比较出微针组、促渗剂组、虫草素组的差异.结果 虫草素透皮行为符合零级动力学模型.与未处理的虫草素组相比,150μm微针组和0.2％氮酮组均能显著增加虫草素单位面积累积渗透量,并提高经皮渗透速率(P<0.01),渗透行为符合零级动力学模型(J分别为0.8929,0.8025),即虫草素以恒定的速率穿过.其中,150μm微针组和0.2％氮酮组存在组间差异,但差异不显著(P<0.05),对应时间点下的微针组的渗透效率略优于0.2％氮酮组,可通过进一步研究优化实验参数.
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虫草素诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡及对端粒酶活性影响的研究
目的:研究虫草素(Cordycepin)对人肝癌细胞HepG-2诱导凋亡作用及对端粒酶活性的影响.方法:虫草素处理人肝癌HepG-2细胞株后,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞生长抑制效应;倒置相差显微镜下观察肝癌细胞形态变化;用透射电镜观察超微结构的变化及荧光显微镜观察细胞凋亡效应;应用流式细胞仪(FCM)检测细胞周期变化及凋亡率;免疫组化方法测定NF-κBp65的表达;用TRAP-PCR-银染法对肝癌细胞端粒酶活性进行检测.结果:不同浓度的虫草素对HepG-2有明显抑制作用,P= 0.002,且呈剂量依赖性;形态学观察也发现,大量细胞的染色质边集、凝聚、核碎裂及凋亡小体产生;免疫组化示,NF-κBp65的表达下调,P=0.000 1;FCM检测结果显示虫草素作用后,使细胞阻滞于S期,P=0.000 1,并出现典型的"亚二倍体"凋亡峰,同时伴随端粒酶活性下调,P=0.000 1.结论:虫草素对人肝癌细胞具有明显抑制作用,其诱导细胞凋亡的机制可能与下调NF-κB的表达并抑制端粒酶活性有关;虫草素与5-FU 联合对肝癌细胞无明显协同抑制作用.
关键词： 虫草素 肝癌细胞 HepG-2 细胞凋亡 端粒酶 NF-κBp65
