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多重连接依赖性探针扩增技术及其在临床中的应用
多重连接依赖性探针扩增(Multiplex Ligation dependent Probe Amplification,MLPA)技术是一种高效、特异、快速、简便,针对待检核苷酸序列进行定性和相对定量分析的技术.2002年Schouten等[1]在多重扩增探针杂交(Multiplex amplifiable probe hybridisation,MAPH)技术基础上进行改进而建立了MLPA技术.该技术在一次性反应中可检测45个核苷酸序列拷贝数的改变,目前已广泛应用于染色体数目异常、基因缺失/重复、DNA甲基化检测等多个分子生物学诊断领域.
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多重连接探针扩增技术在产前诊断中的应用
多重连接探针扩增技术(multiplex ligationdependent probe amplification, MLPA),是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术.
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多重连接探针扩增技术在胎儿染色体非整倍体快速检测中的临床应用
染色体异常是临床上通过产前诊断可以预防的常见出生缺陷,染色体异常包括染色体非整倍体异常(如三体综合征、单体综合征、嵌合体等)、染色体非平衡结构异常(包括染色体缺失、重复)等,其临床表型为智力低下、生长发育异常、器官畸形等。细胞培养后进行染色体核型分析技术是诊断染色体异常的“金标准”,但操作复杂、报告周期长、有细胞培养失败风险等。分子诊断技术包括荧光原位杂交技术(FISH)、微阵列比较基因组杂交技术(aCGH)、短串联重复序列分析和荧光定量PCR技术、多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术等,在很大程度上促进了染色体异常的检测效率,其中,MLPA是2002年由荷兰学者Schouten研究建立的1种分子诊断技术,该技术结合分子杂交、连接和PCR技术半定量检测,于同一反应管内可同时检测出40个不同核苷酸序列的拷贝数变化[1]。与染色体核型分析技术相比,MLPA技术具有快速、高通量、特异度好、敏感度高的特点。本研究通过分析3651例行产前诊断的胎儿,对MLPA技术的临床应用进行评价。
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荧光原位杂交技术在产前诊断中应用的专家共识
目前,G显带的染色体核型分析技术仍然是细胞遗传学产前诊断的“金标准”,但该技术具有细胞培养耗时长以及耗费人力的局限性。随着分子细胞遗传学的发展,新的实验方法不断出现,并逐步走向临床,目前,在临床工作中已开展的有荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、荧光定量PCR(QF-PCR)、多重连接探针扩增技术(multiplex ligation dependent probe amplification, MLPA)、产前液相芯片技术(BACs-on-Beads, BoBs)等技术。这些分子遗传学诊断技术无需细胞培养,分析周期短,可以快速检出胎儿常见的染色体非整倍体异常,显示出高通量、快速、易于大规模开展的优势,对于解决当前以细胞遗传学核型分析为主流技术的产前诊断技术服务能力不足、诊断周期长等问题具有重要的现实意义。FISH技术是利用荧光标记的特异性寡核苷酸片段作为探针,与染色体、细胞或组织中的核酸按照碱基互补配对原则进行杂交,通过荧光系统检测,对待测DNA进行定性或相对定位分析。相对于传统的核型分析技术, FISH技术具有快速及特异性高的优点。更由于其直观性,成为众多遗传学诊断技术的有效验证方法,具有广阔的应用前景。
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产前诊断除外肌营养不良蛋白基因外显子44移码突变一例
先证者,男,1+岁,临床诊断为杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD).该病发生主要原因是编码肌营养不良蛋白(dystrophin)基因的大片段缺失或突变[1].首先采用多重聚合酶链反应技术针对先证者及其父母的肌营养不良蛋白基因26个外显子(包括3、4、6、8、12、1 3、16、17、19、32、34、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、60、Pm、pb)进行检测,未见上述外显子缺失.进而采用多重连接依赖的探针扩增(multiplex ligation-dependcnt probe amplification,MLPA)法检测肌营养不良蛋白基因79个外显子,均未见缺失或重复.终经全基因测序发现先证者第44号外显子一处移码突变:NM_004006.1:c.6391_6392delCA(p.Gln2131AsnfsX3),而先证者父母的44号外显子同步测序均未见异常,且此突变未见报道.通过寡核苷酸多态性数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)、国际人类基因组单体型图计划(www.hapmap,org)和“华大基因千人基因组计划( www.genomics.cn)”中72个中国人样本的数据分析排除多态可能,同时经PDB数据库(www.pdb.org)蛋白功能预测可能造成膜蛋白结构域的改变,因此考虑此突变为新发或生殖腺嵌合造成的致病突变.