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MLPA技术用于产前DMD基因诊断的应用探讨
假肥大性肌营养不良症是一种严重的神经肌肉疾病,分为杜氏肌营养不良症(DMD)和贝氏进行性肌营养不良症(BMD),均是由于DMD基因( Xp21.2)突变所致[1].由于本病目前无有效的治疗方法,产前诊断成为控制致病基因传递、防止患儿出生及降低发病率的主要措施.本研究对DMD产前诊断家系中具有高患病风险的2个胎儿,提取其羊水基因组DNA,采用多重连接探针扩增技术(MLPA)进行产前基因诊断的探索.
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1例22q11微缺失合并先天性心脏畸形胎儿的产前分子遗传学分析
目的 了解孕育严重先天性心脏病胎儿和其父母基因组拷贝数变化,确定其发病的遗传学原因.方法 对胎儿及父母进行常规染色体核型分析,用多重连接探针扩增(MLPA)技术检测胎儿及父母22q11.21拷贝数变异,后采用微阵列单核苷酸多态技术(SNP-Array)进行全基因组拷贝数变化(Copy number variations,CNVs)的检测分析. 结果 经过MLPA及SNP-Array技术分析,在胎儿22q11.2区发现存在2.57 Mb的致病性缺失片段位于染色体18889490-21460220区段,其他染色体未见拷贝数变异.其父母基因组未发现同样的片段异常.结论 此胎儿22q11.21微缺失是新发的染色体结构改变,该变异是导致该家系孕育严重先天性心脏病胎儿的原因.MLPA及SNP-Array为准确性高的遗传学分析技术,能够发现核型分析不能发现的染色体微小结构改变,是临床遗传学研究的重要工具.
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一例假肥大型肌营养不良症患儿基因新突变报道和临床分析
目的 对一例假肥大型肌营养不良(DMD/BMD)患儿发生的DMD 基因突变(c.9760_9781dup22/p.Pro3261LeufsX5)进行报道,并对其临床表现进行分析.方法 联合应用多重连接探针扩增技术(MLPA)和基因测序技术的方法,对DMD 患儿进行DMD 基因分析.结果 MLPA 技术检测到患儿DMD 基因67 号外显子发生缺失突变,通过PCR 技术、基因测序技术检测,证实患儿发生的是67 号外显子的微小突变(c.9760_9781dup22/p.Pro3261LeufsX5).结论 67 号外显子的微小突变(c.9760_9781dup22/p.Pro3261LeufsX5)是一种新突变,此突变可能与DMD 疾病发生及智力障碍表现相关.
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多重连接探针扩增技术对假肥大性进行性肌营养不良症的基因诊断
假肥大性肌营养不良包括Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophies,DMD)和Becker型肌营养不良(Becker muscular dystrophies,BMD).DMD/BMD共同的分子基础是抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因的部分缺失、重复、点突变或者重组.
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结合多重连接探针扩增技术与第二代测序技术建立假性肥大型肌营养不良产前诊断技术平台
目的 应用多重连接探针扩增技术(MLPA)与第二代测序技术对假性肥大型肌营养不良(DMD/BMD)家系进行产前诊断,创建可靠的、高效的DMD产前诊断技术平台.方法 对2010年1月至2016年12月来自深圳市妇幼保健院产前诊断中心就诊的87个DMD家系,使用MLPA技术进行DMD基因外显子缺失或重复突变检测,应用第二代测序技术对未检测出外显子缺失或重复突变的家系进行DMD基因全外显子及侧翼序列检测.同时对这87个DMD家系进行产前诊断.结果87个家系先证者中,55例为DMD基因外显子缺失突变,23例为DMD基因外显子重复突变,9例为DMD基因微小突变.产前诊断结果为24例DMD患病胎儿,9例DMD基因突变携带胎儿,54例正常胎儿.结论 建立MLPA结合第二代测序产前诊断技术平台,可全面检测DMD基因缺失、重复及微小突变,提高DMD基因突变检测率.
关键词: 假性肥大型肌营养不良 多重连接探针扩增技术 第二代测序技术 产前诊断 -
比较MLPA与细胞遗传学技术在流产绒毛染色体分析中的应用
目的:对比多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)与染色体核型分析技术,明确两种技术在流产绒毛样本检测中的效能,以期建立优化的实验室检测方案。方法采集189例稽留流产绒毛样本,同步行 MLPA (SALSA P290-B1)和常规染色体核型分析检测,并对检测结果进行统计分析。结果两种方法综合分析成功187例,占98.94%。其中核型分析成功117例,占61.90%;MLPA 能够检测185例,占97.88%。核型分析与 MLPA 结论一致70例,占37.04%;42例多倍体或非探针目标区染色体异常,MLPA未能检出,占其独立检测样本的22.70%(42/185);72例因培养失败等因素未能成功核型分析,占38.10%。结论①独立采用核型分析或 MLPA技术均不能有效实现流产绒毛染色体异常的检测分析。②综合考虑检测成本和效能,先行染色体核型分析并同时留取流产绒毛样本,应用 MLPA作为核型分析失败的补充方案具有临床可行性。
关键词: 流产 绒毛 多重连接探针扩增技术 细胞遗传学 -
多重连接探针扩增技术在产前诊断中的应用
多重连接探针扩增技术(multiplex ligationdependent probe amplification, MLPA),是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术.
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多重连接探针扩增技术在胎儿染色体非整倍体快速检测中的临床应用
染色体异常是临床上通过产前诊断可以预防的常见出生缺陷,染色体异常包括染色体非整倍体异常(如三体综合征、单体综合征、嵌合体等)、染色体非平衡结构异常(包括染色体缺失、重复)等,其临床表型为智力低下、生长发育异常、器官畸形等。细胞培养后进行染色体核型分析技术是诊断染色体异常的“金标准”,但操作复杂、报告周期长、有细胞培养失败风险等。分子诊断技术包括荧光原位杂交技术(FISH)、微阵列比较基因组杂交技术(aCGH)、短串联重复序列分析和荧光定量PCR技术、多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术等,在很大程度上促进了染色体异常的检测效率,其中,MLPA是2002年由荷兰学者Schouten研究建立的1种分子诊断技术,该技术结合分子杂交、连接和PCR技术半定量检测,于同一反应管内可同时检测出40个不同核苷酸序列的拷贝数变化[1]。与染色体核型分析技术相比,MLPA技术具有快速、高通量、特异度好、敏感度高的特点。本研究通过分析3651例行产前诊断的胎儿,对MLPA技术的临床应用进行评价。
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荧光原位杂交技术在产前诊断中应用的专家共识
目前,G显带的染色体核型分析技术仍然是细胞遗传学产前诊断的“金标准”,但该技术具有细胞培养耗时长以及耗费人力的局限性。随着分子细胞遗传学的发展,新的实验方法不断出现,并逐步走向临床,目前,在临床工作中已开展的有荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、荧光定量PCR(QF-PCR)、多重连接探针扩增技术(multiplex ligation dependent probe amplification, MLPA)、产前液相芯片技术(BACs-on-Beads, BoBs)等技术。这些分子遗传学诊断技术无需细胞培养,分析周期短,可以快速检出胎儿常见的染色体非整倍体异常,显示出高通量、快速、易于大规模开展的优势,对于解决当前以细胞遗传学核型分析为主流技术的产前诊断技术服务能力不足、诊断周期长等问题具有重要的现实意义。FISH技术是利用荧光标记的特异性寡核苷酸片段作为探针,与染色体、细胞或组织中的核酸按照碱基互补配对原则进行杂交,通过荧光系统检测,对待测DNA进行定性或相对定位分析。相对于传统的核型分析技术, FISH技术具有快速及特异性高的优点。更由于其直观性,成为众多遗传学诊断技术的有效验证方法,具有广阔的应用前景。
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多重连接探针扩增技术在未培养羊水细胞染色体非整倍体快速诊断中的应用
染色体数目或结构异常是导致严重致残、致畸出生缺陷的常见原因.染色体非整倍体异常是指染色体数目异常,包括三体综合征、单体综合征等,其中常见的为13、18、21、X、Y染色体数目异常,占总的染色体数目异常的85%以上[1-2].近年来,我国公共医疗卫生事业发展迅速,产前血清学筛查和B超筛查逐步普及,高危孕妇筛出数量明显增多,对我国产前诊断技术服务提出了巨大需求.羊水细胞培养及染色体核型分析是传统的产前诊断"金标准",但是存在耗时、费用高、技术难度大、细胞遗传学专业人员不足等问题.
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多重连接探针扩增技术诊断鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症五例
目的 运用多重连接探针扩增技术(MLPA)检测鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC)基因大片段缺失和重复突变.方法 2012年7月至2014年10月上海交通大学医学院附属新华医院串联质谱检测疑似OTC缺乏症(OTCD)的患儿30例,其中男13例、女17例.进行Sanger测序,23例明确突变.未检测到突变的疑似OTCD患儿行MLPA检测,进行DNA变性、探针与样本DNA的杂交、杂交探针的连接、连接探针的PCR扩增、PCR产物的毛细管电泳.使用Coffalyser软件分析数据.结果 5例患儿Sanger测序未检测到突变,MLPA检测发现异常.例1女,9岁,外显子2~4杂合缺失;例2男,出生后10 d死亡,抽母血检测为外显子2~6杂合重复;例3男,出生10d,外显子7~10半合子缺失;例4女,2岁,外显子1~4杂合缺失;例5男,6岁时死亡,抽母血检测为外显子1~4杂合重复.结论 MLPA检测有助于提高OTC基因致病突变的检出,对于疑似OTCD患者,Sanger测序未检测到突变的患者需要进行MLPA检测.
关键词: 鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症 基因测定 多重连接探针扩增技术 -
母系遗传性视网膜母细胞瘤家系RB1基因分析与产前诊断
视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB;OMIM 180200)是一种来源于未成熟视网膜细胞的恶性罕见肿瘤[1],是早发现的由基因突变而导致的肿瘤,该致病基因被命名为视网膜母细胞瘤基因1(RB1),因此RB1也成为了第一个被成功克隆的人类抑癌基因[2].已有研究表明,90%的双眼和15%的单眼RB患者外周血基因组DNA中均能检测到RB1基因致病性杂合突变[3].本研究采用Sanger测序与多重连接探针扩增技术(MLPA)相结合的策略[4]对一个中国汉族双眼RB家系开展了基因检测,并以检测结果为依据对该家系开展了两次产前诊断.现报告如下.
关键词: 视网膜母细胞瘤 RB1基因 多重连接探针扩增技术 产前诊断 -
MLPA与基因测序技术检测联用检测地中海贫血基因缺陷分析
目的 对深圳地区地中海贫血(简称:地贫)人群及正常人群进行HBA、HBB基因突变的筛查,旨在提高地贫基因确诊率,发现传统基因诊断技术易漏检的地贫相关基因突变类型.方法 选取2009年4月~2010年10月送检本实验室疑似地中海贫血基因缺陷血样100例,采用 MLPA技术和基因测序技术联合检测.结果 (1)成功检测出β合并α地贫双重杂合子;(2)β地贫中,41-42杂合子基因型占53.57%,β合并α地贫双重杂合子,占28.6%,α1地贫中一SEA/αα基因型占96.9%;(3)α2地贫以αcs/αα、α3.7/αα和αWS/αα基因型居多;(4)进一步经MLPA检测后另发现α地贫缺失型及β地贫β基因缺失型占12%.结论 联合应用MLPA技术、PCR技术和基因测序技术,可以提高地中海贫血基因缺陷检测的准确率,为本病家系成员的遗传咨询和产前基因诊断提供准确的依据.
关键词: 地中海贫血 基因诊断 多重连接探针扩增技术 基因测序技术 -
多重连接探针扩增技术检测常见线粒体疾病
目的 探讨多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)用于常见线粒体疾病基因检测的可行性.方法收集2010年5月至2012年8月北京协和医院281例可疑线粒体异常病例,包括神经科存在神经系统损伤的患者233例及眼科疑诊Leber遗传性视神经病变的患者48例,运用MLPA法对常见线粒体疾病突变位点进行检测,并使用线粒体基因序列测定方法进行验证.结果281例标本中共38例检测到线粒体基因突变,总检出率为13.5%.眼科48例标本中,3460G>A、11778G>A和14484T>C 3种突变共检测到19例,检出率为39.6%;神经科233例标本中,3243A>G、8344A>G、8993T>G和大片段缺失共检测到19例,检出率为8.2%.除1例大片段缺失暂无PCR测序验证外,其余MLPA结果均经序列测定验证为相符.结论MLPA法是一种可行的快速、准确、简便的基因诊断方法,可作为筛查常见线粒体疾病的检测工具,为临床诊断和治疗提供依据.
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多重连接探针扩增技术在凝血因子Ⅸ基因大片段缺失的血友病B基因携带者诊断中的应用
目的 探讨多重连接探针扩增技术(MLPA)在血友病B(HB)基因诊断中的应用.方法 采用MLPA和短串联重复序列(STR)基因连锁分析对由于凝血因子Ⅸ(F9)基因大片段缺失导致测序失败的2个HB家系进行基因诊断.结果 MLPA检测结果显示,2例HB患者F9基因存在1或2个外显子的缺失,缺失位置Ratio值<0.10;患者母亲相应位置Ratio值为0.50±0.05,可判断为携带者;其他女性受检者Ratio值为0.71~1.30,可排除携带者.基因连锁分析与MLPA判断结论一致.结论 MLPA为HB的直接基因诊断提供了一种新的方法,可用于测序无法检出的F9基因大片段缺失的携带者诊断.
关键词: 多重连接探针扩增技术 血友病B 基因诊断 大片段缺失 -
唐氏综合征的产前诊断分子技术研究进展
唐氏综合征是人类常见的染色体疾病,经典的细胞遗传学方法是诊断唐氏综合征的金标准,但其局限性不适合大规模的产前诊断.随着分子细胞遗传学技术发展,荧光原位杂交技术(FISH)、定量荧光PCR(QF-PCR)、微阵列-比较基因组杂交(Array CGH)、多重连接探针扩增技术(MLPA)、引物原位标记技术(PRINS)等被用于唐氏综合征快速产前诊断,各种方法各有优劣,改进后会大力推进唐氏综合征的产前诊断速度和准确性.
关键词: 唐氏综合征 产前诊断 定量荧光PCR 荧光原位杂交 多重连接探针扩增技术 -
遗传性痉挛截瘫1例
遗传性痉挛性截瘫(HSP或SPG)是一组具有高度临床和遗传异质性的罕见的神经系统变性疾病,其发病机制复杂,临床多表现为缓慢进展的双下肢无力及痉挛性截瘫[1].随着病程的进展终丧失劳动能力,目前尚无有效的方法预防或延缓该种疾病的发生及进展.该病发病率低,基因检测作为诊断的金标准.我们报道1例单纯型遗传性痉挛性截瘫病例.
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儿童发育障碍相关疾病的病因鉴别和诊断
注意缺陷多动障碍(ADHD)、孤独症谱系障碍(ASD)和智力障碍(MR)是儿童发育门诊常见的几种疾病.病因非常复杂,包括生物医学因素和社会心理文化因素,其中生物医学因素又包括遗传学因素等.随着这几年遗传学技术的迅速发展,越来越多发育障碍相关疾病的染色体异常或基因异常病因被不断发现.这些遗传学技术包括已经成熟的常规染色体核型分析、遗传代谢病筛查、一代基因测序技术、新发展起来的二代测序技术和多重连接探针扩增技术(MLPA)及微阵列比较基因组杂交(aCGH).二代测序技术又包括全基因组测序、全外显子测序(WES)和疾病靶向序列测序技术(DTS).临床医生可根据不同临床表现选择相应技术,以便查出遗传学病因.
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多重连接探针扩增技术的研究进展及其应用
多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术.该技术仅需20 ng/μl DNA,即可通过简单的杂合、连接、PCR扩增及电泳步骤,在同一反应管中对四十多个不同的靶基因进行检测和定量分析.这一技术先于2002年由荷兰的Schouten等[1]报道.如今短短几年中,该技术已被欧洲、亚洲等几十个实验室采用.迄今为止,已有150多篇不同领域采用该技术方法的报道在重要刊物上发表.
关键词: 多重连接探针扩增技术 基因缺失 基因重复 突变检测 甲基化 -
原发性肉碱缺乏症患者临床特点和SLC22A5基因突变分析
目的 探讨12例原发性肉碱缺乏症患者临床表现与生化代谢特点,并分析其SLC22A5基因突变类型.方法 对12例患者病历资料进行回顾性分析;SLC22A5基因突变分析则采用PCR扩增产物直接测序法和多重连接探针扩增技术.结果 在12例患者中,3例有明显感染因素,6例患者临床表现有抽搐,5例患者表现有肝脏肿大,8例患者表现有高氨血症,9例表现有不同程度的心肌损害.12例患者通过DNA直接测序法检测出双等位基因致病突变,其基因突变类型有9种,包括:IVS2+1G>T、c.3G>T(p.Met1Ile)、c.760C>T(p.Arg254X)、c.1400C>G(p.Ser467Cys)、c.844dupc(p.Arg282fs)、c.338G>A(p.Cys113Tyr)、c.51C>G(p.Phe17Leu)、c.659A>T(p.Glu220Val)和c.1365dupC(p.Thr456fs).在检测到的9种基因突变类型中,c.659A>T(p.Glu220Val)和c.1365dupC(p.Thr456fs)为新发突变.1名病例为成年女性原发性肉碱缺乏症患者,其刚出生的新生儿筛查结果呈阳性.在检测到的基因突变类型中,c.760C>T(p.Arg254X)和c.1400C>G(p.Ser467Cys)等位基因频率高,分别为37.5%(9/24)和29.2%(7/24).12例原发性肉碱缺乏症患者多重连接探针扩增技术检测结果未见异常.结论 原发性肉碱缺乏症患者临床表现复杂多样.SLC22A5基因突变类型以点突变为主,其中c.1400C>G(p.Ser467Cys)等位基因频率较高,也可能为中国原发性肉碱缺乏症患者热点突变类型.
关键词: 原发性肉碱缺乏症 SLC22A5 游离肉碱 酰基肉碱 多重连接探针扩增技术