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MLPA技术用于产前DMD基因诊断的应用探讨
假肥大性肌营养不良症是一种严重的神经肌肉疾病,分为杜氏肌营养不良症(DMD)和贝氏进行性肌营养不良症(BMD),均是由于DMD基因( Xp21.2)突变所致[1].由于本病目前无有效的治疗方法,产前诊断成为控制致病基因传递、防止患儿出生及降低发病率的主要措施.本研究对DMD产前诊断家系中具有高患病风险的2个胎儿,提取其羊水基因组DNA,采用多重连接探针扩增技术(MLPA)进行产前基因诊断的探索.
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无创产前基因诊断方法研究进展
产前诊断又称宫内诊断,是指在胎儿出生前,通过影像学、生物化学、细胞遗传学以及分子生物学等技术,了解胎儿宫内的发育状态,对先天性缺陷或遗传性疾病作出诊断.产前诊断是预防严重遗传性疾病或先天性缺陷胎儿出生的一项有效而可靠的措施,是优生和提高人口质量的重要保障之一.产前诊断方法根据采样途径或诊断方法是否构成对胎儿的影响可分为创伤性和无创性.前者主要包括羊膜腔穿刺、绒毛取样、脐血取样、胎儿镜和胚胎活检等,虽然诊断精确度较高,但可导致流产或感染等并发症,常在高危孕妇中实施;后者包括超声波检查、直接从母体外周血中获取胎儿细胞、胎儿游离DNA[1]或游离RNA检测,该法既能行产前诊断又无危险性,尽早发现和杜绝异常胎儿,亦适用于大群体筛查,达到优生目的.近年来,胎儿游离核酸和有核细胞结合基因检测取得较大进展,本文就无创产前基因诊断的研究材料、方法学及其产前诊断中的应用进行综述.
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地中海贫血产前基因诊断现状和发展趋势
地中海贫血(地贫)是一组常染色体隐性遗传病.它是由于珠蛋白基因突变,使珠蛋白生物合成受阻,产量不足或缺如所致.对于重型地贫,除了输血之外,目前尚缺乏有效的治疗手段,重点在于预防.通过产前基因诊断,可以发现重型地贫胎儿并及时终止妊娠,从而减少重型地贫患儿的出生率及围产期并发症,提高人口的健康素质,减轻家庭及社会的精神及经济负担.现将α-及β-地贫产前基因诊断的现状与发展趋势综述如下.
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常染色体显性遗传性多囊肾病的产前基因诊断技术
常染色体显性遗传性多囊肾病是一种常见的单基因遗传病,具有遗传异质性和延迟显性,危害性大。临床上可通过连锁分析和直接基因诊断早期发现,以隔断致病基因的遗传。本文综述了连锁分析和直接基因诊断在此病产前诊断的应用。
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孕妇小片段游离胎儿DNA进行β-地中海贫血无创性产前基因诊断
目的:探讨利用孕妇外周血浆中小片段游离胎儿DNA(cfDNA)进行β-地中海贫血无创性产前基因诊断的临床价值.方法:本研究收集了来我院进行产前诊断可能生育重型β-地中海贫血的孕妇24例,抽取绒毛或羊水进行常规的地中海贫血的产前诊断,另外收集孕妇外周血液标本8~10 ml,均使用ACD抗凝,对cfDNA进行二次PCR反应后,对胎儿的β-珠蛋白基因型采取反向斑点杂交(RDB)检测,并与有创伤性产前诊断结果进行比较,分析其结果.结果:所有小片段cfDNA均可顺利扩增,父母基因型相同的8例标本中,诊断符合率为87.5%(7/8),1例正常胎儿误诊为携带者;父母基本型不同的16例标本中,诊断符合率为87.5% (14/16),有2例误诊,其中1例正常胎儿误诊为β-地贫基因携带者,1例β-地贫基因携带者误诊为重型β-地贫患者.结论:利用cfDNA进行β-地中海贫血无创性产前基因诊断具有良好的临床价值.
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高分辨熔解曲线技术在Wilson病致病基因突变鉴定中的应用
目的 在一个肝豆状核变性(WD)家系中进行致病突变鉴定和产前基因诊断.方法 酚-氯仿法提取外周全血或妊娠13周胎儿绒毛组织基因组DNA;利用PCR-Sanger测序技术对先证者ATP7B基因外显子及外显子/内含子衔接区序列进行突变分析;针对先证者携带的突变位点,应用聚合酶链反应(PCR)-高分辨熔解曲线(HRM)方法对先证者家系4名成员进行突变鉴定,并在此基础上为患儿母亲提供产前基因诊断.结果 先证者ATP7B基因第8外显子存在纯合致病突变c.2333G>T(p.R778L);该家系5名成员和4名群体正常样本分属于3种不同熔解曲线.HRM分析结果与测序结果一致,即:患儿本人为R778L的纯合子,其父母、姐姐和母亲产前诊断的胎儿均为突变杂合子,4名群体正常对照为纯合野生型.结论 在一个WD家系中检测到ATP7B基因热点突变c.2333G>T(p.R778L),并针对该突变建立了一种基于PCR-HRM技术的快速突变鉴定方法,成功为家系提供产前基因诊断.
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应用三联PCR技术产前诊断假性肥大型进行性肌营养不良的研究
目的 通过对两例散发的BMD家系中的先证者和胎儿进行DMD基因和SRY基因分析,拟建立一种快速、准确、适用于临床的DMD/BMD的产前基因诊断方法.方法 提取羊水细胞基因组DNA,通过检测SRY基因鉴定胎儿性别,以多重PCR方法对DMD基因缺失热区的18个外显子进行基因缺失的筛查,结合4对STR引物(内含子44、45、49、50)进行短串联重复序列多态性连锁分析(STR-PCR),分析结果经DNA测序验证.结果 SRY基因分析结果显示家系1胎儿为女性,家系2胎儿为男性,与超声诊断结果一致.两例BMD先证者均未检测到18个外显子的缺失,两家系的母亲及家系1的女性胎儿均为BMD基因STR-49位点杂合子,家系2的男性胎儿为BMD.同时发现了STR45、STR50的非常见基因型.结论 应用SRY基因检测胎儿性别及多重PCR方法对DMD基因外显子缺失的检测,结合STR-PCR技术检出非缺失型携带者并行产前诊断,此三联PCR方法具有快速、简便、直观可靠的特点,特异性高,实验可操作性强,适用于临床推广应用.
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一例成骨不全Ⅱ型高危胎儿的产前基因诊断
目的 对广东一疑似致死性侏儒症或成骨不全Ⅱ型的高危胎儿实施产前基因诊断,以阐明胎儿骨发育异常的真实病因,及时预防患胎出生.方法 对经超声检查初诊为致死性侏儒症或成骨不全、已孕25周的高危胎儿,在抽取脐血制备DNA模板后,采用PCR-DNA直接测序法,分别对胎儿的FGFR3基因和COL1A1基因进行突变检测,然后对所发现的突变进行分析和鉴定.结果 FGFR3基因未发现病理性突变,而COL1A1基因发现一典型的杂合错义突变(c.3065 G>T,PG1022V),经查HGMD数据库证实为成骨不全Ⅱ型的致病性突变.结论 (1)此高危胎儿为成骨不全Ⅱ型患胎,应及时终止妊娠(胎儿已经引产,经复查证实与产前基因诊断结果完全一致).(2)在超声初诊基础上,采用产前基因诊断可快速、有效对高危胎儿做出确诊,为出生缺陷的预防提供技术保障.
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聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳在苯丙酮尿症产前基因诊断中的应用
苯丙酮尿症(PKU)是常染色体隐性遗传病,因苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变致酶活性降低或丧失而造成高苯丙氨酸血症和智力低下.为进一步提高PKU产前基因诊断率,我们用s聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)对PCR短串联重复序列(PCR-STR)连锁分析,对家系的PAH基因的相对突变热点区域外显子6(e6)、e7和e12作突变检测,以探讨其在PKU产前基因诊断的应用价值.
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8个假肥大型肌营养不良症家系产前基因诊断
假肥大型肌营养不良症(DMD)是一种严重的常见致死性X-连锁隐性神经肌肉系统遗传病,发病率约为1/3 500,我们用18对外显子引物[1,2]、6对内含子(CA)重复序列引物[3]和性别决定基因SRY引物,有效地对8个DMD家系进行产前基因诊断.
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从孕妇外周血富集胎儿细胞技术的进展
目前,应用胎儿细胞进行产前基因诊断的主要方法有羊膜腔穿刺、绒毛活检和脐静脉穿刺术.这些有创性检查导致的孕妇流产率均为1%左右,且与操作者技能密切相关.虽然可结合孕龄、血清生化及超声技术等指标进行产前筛查(阳性预测值2.3%),有选择性的进行上述产前检查,仍造成许多健康胎儿的夭折,对孕妇和家庭造成严重不良影响.
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产前诊断泰国缺失型α地中海贫血1引起的胎儿巴氏水肿
地中海贫血(地贫)是由于珠蛋白基因缺失或突变导致珠蛋白链合成减少或缺乏,所致的一种遗传性溶血性贫血,是我国南方地区常见、危害大的遗传病,临床上主要分为α地贫和β地贫两种,以α地贫更为常见.目前,国内报道的α地贫产前基因诊断主要是针对常见的3种α地贫缺失型和非缺失型基因突变类型的胎儿产前基因诊断.本研究报道2例极为少见的泰国缺失型α地贫1和东南亚缺失型α地贫1双重杂合的产前诊断.
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家族性淀粉样变性多发神经病家系的产前基因诊断一例并文献复习
家族性淀粉样变性多发神经病( familial amyloid polyneuropathy,FAP)是以细胞外特异性淀粉样物质聚集、主要累及外周神经和白主神经系统为特征的常染色体显性遗传性神经系统疾病[1],是具有广泛种族分部的家族性综合征.FAP的临床症状多样,主要表现为进行性的周围运动神经和感觉神经障碍,以及自主神经功能异常,可出现肾病综合征、充血性心功能衰竭、心律失常等,多种症状可单独或合并出现,患者往往因心、肾损害而死亡.FAP的致病基因为转甲状腺素蛋白(transthyretin,TTR)基因[2],位于染色体18q12.1,约7 kb,含有4个外显子.TTR负责转运甲状腺素和视黄醇,但基因发生突变时该蛋白的四聚体裂解为单体,形成淀粉样纤维,并在多种组织聚积而导致发病.目前,无有效消除淀粉样物质沉积的方法,主要以对症治疗来推迟靶器官的功能衰竭[3],但通过基因检测可以尽早识别症状出现前的患者,对于该病的防治具有重要意义.本研究对来自已明确诊断为TTR基因杂合突变的FAP家系[4]的第三代患者的子代进行产前基因诊断,为其提供遗传咨询及发病风险评估.
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产前基因诊断白化病携带者一例
患者32岁,孕2产0,宫内妊娠19周,因孕妇本人系白化病患者,要求做产前基因诊断,于2003年11月17日住院.孕妇父母为姨表亲近亲婚配,表型正常,育有男女各一,家族中仅该孕妇为白化病患者,毛发、眉毛、虹膜、皮肤色素均完全缺失,其兄表型正常.考虑孕妇为白化病1型(oculocutaneous albinism type Ⅰ,OCA1)可能性大,故于孕早期提取了孕妇及其母外周血DNA,针对酪氨酸激酶(tyrosinase,TYR)的基因序列,设计了八对引物,扩增该基因的全部(5个)外显子,并对扩增产物进行了基因序列的测定(由中国北方基因中心诺赛基因测序部完成).
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用孕妇外周血胎儿细胞进行产前诊断研究进展
目前对遗传性疾病的产前诊断有数种方法.根据采样途径或诊断方法是否构成对胎儿的影响可分为侵入性产前诊断和非侵入性产前诊断.前者包括羊膜腔穿刺术、绒毛细胞吸取术及胎儿脐血穿刺等,虽然诊断精确度较高,但易导致流产等并发症,只能在高危孕妇中实施;后者的优点是既能行产前诊断又无危险性,适用于低风险的孕妇大群体筛选,尽早发现和杜绝异常胎儿,达到优生目的.利用孕妇外周血的胎儿细胞进行产前基因诊断即是具潜力的非侵入性产前诊断方法之一,近年来研究十分活跃,临床医师应注意这一领域的进展.
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与《产前基因诊断白化病携带者一例》作者商榷
<中华围产医学杂志>2004年11月第7卷第6期刊登的<产前基因诊断白化病携带者一例>一文,阅读后发现文内可能存在一些疏误和值得商榷之处.现将我们的意见和观点整理成文,藉此与该文作者及读者就有关问题进行一些学术探讨.
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对"与《产前基因诊断白化病携带者一例》作者商榷"的答复
关于提到的<产前基因诊断白化病携带者一例>一文中的疏误之处,经核对,发现的确存在疏误:(1)tyrosinase,TYR应译为酪氨酸酶;(2)所检测到的突变位点为896位核苷酸,故对应的密码子为299位,核苷酸改变仍为精氨酸→组氨组;(3)TYR基因编码529个氨基酸.
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Alport综合征的产前基因诊断
Alport综合征(AS)是常见的遗传性肾脏疾病,临床主要表现为血尿和进行性肾功能减退,伴随感音神经性耳聋和眼部异常等.
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21三体综合征的快速基因诊断及产前基因诊断
在以智力低下为主要临床表现的常染色体疾病中,21三体综合征是常见的一种。我们将细胞遗传学与基因探针技术结合起来,利用21号染色体特异性探针采用细胞原位杂交的方法对21三体综合征进行基因诊断及产前基因诊断,具有敏感性高、快速准确等优点。 对象 经本室细胞遗传学检定核型诊断的21三体综合征患儿10例;自愿人工流产者10例及产前诊断者1例(其第1胎子代为标准型 21三体综合征)。人工流产者收集妊娠6~10周绒毛进行染色体检查核型均为正常;取1例产前诊断者第2胎子代妊娠11周的绒毛、妊娠22周的羊水及生后外周血,跟踪检测染色体核型。 方法 1.探针及标记:人 21号染色体特异性探针118D12(德国Adinolfi博士惠赠)定位于21号染色体末端(21q22.3),克隆至Cosmid 中。采用整个Cosmid以随机引物法标记地高辛(Dig-11-dUTP)[1]。 2. 所有检测对象取外周血、绒毛或羊水按本室常规方法分离及制备单个核细胞[1]。 3.细胞原位杂交及显色:标本经蛋白酶 K和RNase处理(其中每例标本取1片以DNaseI消化作为阴性对照)及变性后,滴加变性杂交液 60 μl,其中含Dig-DNA探针1~2 μg/ml。50℃杂交过夜。抗原抗体复合物显色反应及镜检均按已报道的方法进行[1]。
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不同遗传型Alport综合征的产前基因诊断
Alport综合征(Alport syndrome,AS)是常见的遗传性肾脏疾病之一,临床主要表现为血尿和进行性肾功能减退,伴随感音神经性耳聋和眼部异常等.AS是一种遗传异质性疾病,目前已证实存在3种遗传方式:X连锁显性遗传(Xlinked dominant Alport syndrome,XLAS)为常见,约占80%~85%,因COL4A5基因突变或COL4A5和COL4A6两个基因突变所致;常染色体隐性遗传(Autosome recessive Alport syndrome,ARAS)约占15%,常染色体显性遗传(Autosome dominant Alport syndrome,ADAS)非常少见,二者均因COL4A3或COL4A4基因突变所致[1-2].我们继往研究中对不少AS家系进行了基因诊断[3],并在国内开展了AS的产前基因诊断[4].在此,我们结合临床实施的几例不同遗传型AS的产前基因诊断家系,探讨此类疾病的产前基因诊断方法以及需要注意的问题.