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中国脊髓灰质炎疫苗株病毒VP1区基因突变热点分析
目的 研究中国(未包括香港、澳门特别行政区和台湾地区)急性弛缓性麻痹(AFP)病例监测系统中分离到的脊髓灰质炎(脊灰)疫苗株病毒VP1区基因核苷酸突变热点及其分子生物学特征.方法 对从中国1996～2002年AFP病例中分离的693株单血清型脊灰病毒进行VP1区核苷酸序列测定和分析,并对序列结果进行比对分析和统计学分析.结果 VP1区核苷酸序列测定和分析结果,未检出脊灰野病毒,全部为脊灰疫苗株病毒.在所有疫苗株病毒中,发现了一些VP1区基因核苷酸突变热点,例如Ⅰ型病毒的nt2 747位点和nt2 795位点、Ⅱ型病毒的nt2 909位点、Ⅲ型病毒的nt2 636位点,突变发生率分别为34.8%、47.3%、84.8%、53.3%.4个突变热点共有8种核苷酸变异形式,其中3种核苷酸变异形式为转换(Ⅰ型A2795G、Ⅱ型U2909C、Ⅲ型G2636A),另外5种为颠换(Ⅰ型A2747U、A2747C、A2795U和Ⅱ型U2909A、U2909G).4个突变热点全部导致了编码氨基酸的突变.在编码氨基酸的突变中,除Ⅰ型A2747U、A2 747C、A2 795U导致相似性质的氨基酸之间发生替代外,其余都发生了极性氨基酸和疏水性氨基酸的替换.某些导致不同性质编码氨基酸替换的突变热点同时也是已知的神经毒力决定位点.结论 因为有突变热点的存在,说明在VP1区基因中突变的核苷酸并不是完全随机分布的;由于脊灰病毒的VP1区基因突变热点可能与它的生物学特性(如神经毒力)有一定的关联性,因此对VP1区基因突变热点的检测,可作为中国脊灰病毒学监测中的一个重要方法.
关键词： 脊髓灰质炎疫苗株病毒 VP1区基因 突变热点 -
中国2011年Ⅲ型脊髓灰质炎病毒基因特征分析
目的 研究中国(未包括香港、澳门特别行政区和台湾地区,下同)2011年急性弛缓性麻痹(Acute Flaccid Paralysis,AFP)病例粪便标本中分离到的Ⅲ型(Type 3)脊髓灰质炎(脊灰)病毒(Poliovirus,PV)(PVⅢ)分子生物学特征,为中国维持无脊灰提供实验室依据.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Pogymerase Chain Reaction,RT-PCR)对PVⅢ的衣壳蛋白VP1编码区基因进行扩增,并对PCR产物进行核苷酸序列测定和分析,对VP1编码区的核苷酸神经毒力位点和突变热点进行分析,并建立亲缘关系进化树,分析毒株间的进化关系.结果 中国2011年从AFP病例粪便标本中,共分离到159株PVⅢ,包括149株疫苗类似株PV和10株免疫缺陷相关的疫苗衍生(Immunodeficiency-associated Vaccine-derived) PV(iVDPV),未发现Ⅲ型野生型(Wild Type) PV(WPVⅢ).15株PVⅢ均在VP1编码区基因已知的神经毒力位点核苷酸2493发生突变.结论 突变热点的存在说明PVⅢ的VP1编码区的核苷酸变异并不是随机分布的,PVⅢ的VP1编码区基因突变热点可能与PVⅢ的生物学特性有一定的关系.从宁夏回族自治区发现的10株iVDPVs与以往发现的iVDPV基因进化上无相关性,证明是新发现的iVDPV.对VP1编码区的检测为继续维持中国无脊灰状态,为及时发现VDPCs传播和WPV的输入性爆发提供实验室依据.
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江西籍肝豆状核变性第八外显子突变的研究
肝豆状核变性又称Wilson's病(Wilson's disease,WD),是一种铜代谢障碍的常染色体隐性遗传病,该基因定位于13q14.3,它含有21个外显子及20个内含子,其基因表达产物为参与铜转运的三磷酸腺苷酶(ATP)7B,故该基因又称为ATP7B基因,ATP7B酶分为三个区,第一区为金属离子结合区,第二区为磷酸化区,第三区为跨膜区.基因突变方式多种,但以点突变为主.因基因突变导致ATP7B酶发生改变,从而不能有效地运输铜而形成铜蓝蛋白,因此使铜在组织器官存积,发生脑、肝、肾等多脏器受损.经国内外学者长期研究表明[1,2],在众多的点突变中,中国人肝豆状核变性以2273位点G→T突变为高发突变热点[3],上海二医大对60例WD患者进行了Arg778Leu突变的检测,突变频率达45.6%,因此我们对12例肝豆状核变性患者采用荧光定量PCR方法检测Arg778Leu基因突变,结果这12例江西籍肝豆状核变性患者中有10例存在该突变,他们均为杂合子.而5例正常体检者均正常.说明Arg778Leu突变为肝豆状核变性的高发突变位点,可作为肝豆状核变性众多突变中的首选.
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聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳在苯丙酮尿症产前基因诊断中的应用
苯丙酮尿症(PKU)是常染色体隐性遗传病,因苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变致酶活性降低或丧失而造成高苯丙氨酸血症和智力低下.为进一步提高PKU产前基因诊断率,我们用s聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)对PCR短串联重复序列(PCR-STR)连锁分析,对家系的PAH基因的相对突变热点区域外显子6(e6)、e7和e12作突变检测,以探讨其在PKU产前基因诊断的应用价值.
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帕金森病与LRRK2基因G2019S突变相关性研究
帕金森病(PD)是一种常见的神经系统变性疾病,临床主要表现为静止性震颤,肌强直,运动迟缓,姿势反射障碍等.随着PD的致病基因α-synuclein,Parkin,UCH-L1,PINK1,DJ-1,LRRK2相继被克隆,遗传因素在PD发病机制中的作用加大.近来,一个新的突变热点,LRRK2基因41号外显子的G2019S(6055G>A),引起国外许多研究者的关注[1-5].由于LRRK2基因克隆的时间较短,因此有关LRRK2基因的研究报道较少.我们对所收集的中国的常染色体显性遗传性PD家系和散发性PD患者进行研究,筛查是否存在LRRK2基因G2019S突变.
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Wilson病基因全长外显子的突变检测和分析
目的研究报道Wilson病(WD)基因7种新突变和5种新多态,结合前期在部分外显子发现并报道的突变和多态现象,进一步分析WD基因全长外显子的突变特征,以期对中国人WD基因的突变状况有一个完整的认识.方法研究对象包括60名无亲缘关系的正常对照和84例分别来自65个家系的WD患者.抽取上述研究对象的外周静脉血,用盐析法或过柱法抽提基因组DNA.用聚合酶链反应方法分别扩增全部的21个外显子顺序,以单链构象多态分析及DNA测序方法,检测上述研究对象的基因突变和多态.结果共检测到18种突变和17种多态,包括7种新突变和5种新多态.其中Arg778Leu 和Thr935Met为基因突变热点,突变频率分别高达37.7%和10.0%,其余突变的频率均低于4.0%.此次研究还发现曾作为突变形式加以报道的Ile1148Thr应考虑为一种多态现象.结论我国WD基因突变是以少数几个热点突变和广泛存在的罕见突变为特征.
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携带突变k-ras基因的重组腺病毒转染树突状细胞体外诱导的抗肿瘤免疫
近年来,肿瘤疫苗的研究已成为肿瘤免疫治疗的热点之一.肿瘤抗原的发现及确认为肿瘤的免疫治疗尤其是主动性免疫治疗提供了新的手段.有研究证实突变的ras蛋白质产物可被特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所识别[1,2].由于ras基因突变发生在多种类型肿瘤的实质部分,相对应的抗原决定簇也被发现存在于多种肿瘤组织中,有较为一致的突变热点(密码子12,13,61).许多研究已经证明肺腺癌中k-ras基因12位密码子点突变是频发、常见的,且与患者的预后有关.因此以ras为靶目标,建立肿瘤生物治疗的方法有重要的临床价值.树突状细胞(dendritic cells,DC)在免疫系统中有特殊的作用,DC疫苗在恶性肿瘤的生物治疗中也具有独特的地位.为此,我们在成功构建携带编码12位密码子突变的k-ras基因的重组腺病毒载体的基础上[3],探讨其修饰的DC能否诱导机体产生特异性CTL,为以DC为基础的肿瘤主动性免疫性治疗提供实验依据.
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胃肠道间质瘤的临床与病理
胃肠道间质瘤(GIST)是发生于胃肠道黏膜下的一种罕见的肿瘤,它属于间叶肿瘤的一种.1 分子生物学机制大多数GIST都存在原癌基因c-kit的突变.有研究对12例确诊的GIST进行分子遗传学分析发现8例发生14号染色体的完全缺失或149的区域性缺失,8例发生22号染色体的完全缺失或229的区域性缺失,2例发生1号染色体的结构重排,而该突变热点多发生于c-kit的外显子11上也有少数突变发生于外显子9或13上.
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胃肠道间质瘤的临床与病理
胃肠道间质瘤(GIST)是发生于胃肠道黏膜下的一种罕见的肿瘤,它属于间叶肿瘤的一种.1 分子生物学机制大多数GIST都存在原癌基因c-kit的突变.有研究对12例确诊的GIST进行分子遗传学分析发现8例发生14号染色体的完全缺失或149的区域性缺失,8例发生22号染色体的完全缺失或229的区域性缺失,2例发生1号染色体的结构重排,而该突变热点多发生于c-kit的外显子11上也有少数突变发生于外显子9或13上.
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乙型肝炎病毒基因多态性检测芯片的临床应用
在乙型肝炎病毒(HBV)持续感染的过程中,其基因组可自然地或在治疗诱导下出现各种变异而呈多态性,给乙型肝炎的诊断、治疗及判断预后带来许多临床问题.DNA芯片技术是近几年发展起来的进行大规模遗传多态性检测的新方法,我们根据HBV基因多态性位点及突变热点的几种可能突变情况,设计了多条寡核苷酸探针,与聚合酶链反应(PCR)扩增的HBV基因相应区段杂交,根据特定位置上杂交信号的有无和与之相应的探针序列来判定基因突变的类型.同时,测定了99例临床样本和40例献血员样本,取得了较满意的结果,现初步报告如下.
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结直肠癌中SOX9基因突变的筛选及其功能解析
[目的]观察结直肠癌(colorectalcancer,CRC)中是否存在SOX9基因的突变位点.[方法]通过PCR及直接测序的方法,检测5个结肠癌细胞系DNA(HT29、SW480、SW620、RKO、Hce8693)和20个结肠癌组织DNA中的SOX9基因全部编码区段、启动子、核心区域及增强子区域的突变情况.[结果]在SOX9基因Intron 4的3519bp处发现SNPs位点1个(A/C),包括A/C杂合型、C/C纯合型以及A/A纯合型,但在全部的关键区域未发现突变热点.[结论]SOX9基因在CRC中不存在突变位点,但其在表达水平上明显升高,可推测SOX9基因不是在基因水平上,而是由表达水平的改变直接参与CRC的发生.
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中国人群Leber遗传性视神经病变线粒体ND1基因突变频谱分析
背景 Leber遗传性视神经病变(LHON)是一种常见的遗传性眼病,常导致患者双侧中心视力下降,其基因突变频谱并不完全清楚. 目的 筛查中国人群LHON线粒体ND1基因的突变位点并明确其突变频谱.方法 经温州医学院伦理道德委员会批准,所有受试者知情同意.收集临床诊断为LHON患者894例和正常对照者134名,抽取受检者的外周血提取基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)法对受检者线粒体ND1基因进行扩增和测序,并与修正的线粒体剑桥参考序列进行比对,筛查突变位点并分析其突变频率.结果 本研究在894例LHON患者的ND1基因中发现了7个与LHON相关的突变位点G3316A、T3394C、G3460A、C3497T、G3635A、G3733A、T4216C,携带这7个位点的患者共100例,占11.19％,其中与3个原发性突变位点共存者29例(3.24％).这几个突变位点在病例中的发生频率分别为2.57％、2.23％、1.45％、3.80％、0.67％、0.11％、0.34％,其中G3316A、T3394C、C3497T、T4216C在正常对照者中也可检测到,分布频率分别为4.48％、2.99％、4.48％和1.49％,经分析在LHON组和正常对照组之间差异均无统计学意义(x2=0.926,P=0.336;x2=0.052,P=0.820;x2=0.142,P=0.707;P=0.129),而其他一些在欧美人群中报道的位点,如G3376A、G3496T、G3700A、A4136G、T4160C、C4171A在中国LHON人群中并未发现. 结论 线粒体ND1基因是中国人群LHON的一个突变热点区域,约11.19％的中国LHON患者与ND1基因突变有关.G3635A、G3733A为中国人群中少见的致病突变位点,而G3316A、T3394C、C3497T、T4216C本身并不足以致病,但可能对LHON外显率和表型的表达起协同作用.
关键词： Leber遗传性视神经病变 线粒体DNA ND1基因 突变热点 -
河南省杜氏肌营养不良患者dystrophin基因突变的MLPA检测
目的:探讨多重连接依赖式探针扩增技术(MLPA)在杜氏肌营养不良(DMD)患者基因诊断中的应用价值,了解河南省DMD患者dystrophin基因突变热点.方法:采用MLPA检测48例河南省DMD患者及13例缺失型患者母亲dystrophin基因突变.结果:48例DMD患者中,有31例(64.6％)检测出dystrophin基因外显子缺失,4例(8.3％)检测出外显子重复.河南省DMD患者dystrophin基因缺失/重复热点区域为第46～53外显子和第8～18外显子.13例患者母亲有11人检测出杂合突变,突变类型与患者相同,余2人未检测出突变.河南省DMD患者基因外显子缺失、重复分布与北京相似(x2=0.256,P=0.880),但与香港和台湾地区有着较大差异(x2分别为11.470和11.303,P分别为0.003和0.004).结论:MLPA在DMD患者及携带者基因诊断中有很高的应用价值.河南省DMD患者dystrophin基因的突变热点与国内其他地区有差异.
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结肠腺瘤样息肉病基因在结肠癌患者中的突变热点研究
目的 探讨结肠腺瘤样息肉病基因在结肠癌中的突变热点及对肿瘤的影响.方法 通过公共数据库cBioportal调取结肠癌突变位点结果,根据其中的一段突变热点区域,构建对应结肠腺瘤样息肉病基因过表达载体及RNAi,采用Western blot检测并证实此区域的功能.结果 结肠腺瘤样息肉病基因在结肠癌中的突变率高达73.9％,显著高于其他肿瘤(P＜0.05);其中3 454～4 662 bp区域突变发生率占总突变次数的56.1％;构建RNAi后在正常肠上皮细胞中发现β-catenin、CD44、Ki67出现显著上调;在结肠癌细胞中过表达野生型APC(wt-APC),缺失APC(hotdel-APC)的情况下发现,wt-APC可以有效抑制c-myc、β-catenin、CD44、Ki67等致癌基因的表达,但hotdel-APC不能.结论 APC基因中3 454 ～4 662 bp这段区域编码的蛋白可能在结肠癌发生过程中发挥重要作用.
关键词： 结肠腺瘤样息肉病基因 结肠癌 突变热点 -
EXT1基因Y271H突变致多发性外生性骨疣
目的:经家系分析探索多发性外生性骨疣的相关基因变异. 方法:采用聚合酶链式反应结合DNA直接测序法检测EXT1以及EXT2基因的突变热点区域,并利用PCR-RFLP检测技术进行突变筛查. 结果:该家系中2例患者的EXT1基因编码区第811位碱基处发生T→C的杂合突变,导致第271位的酪氨酸被组氨酸取代(Y271H),而家系内正常个体无此突变,在100例遗传非相关正常个体中也没有此突变,表明该突变是一种尚未见报道的新突变. 结论:EXT1基因的Y271H杂合突变是导致该家系发生多发性外生性骨疣的致病突变.
关键词： 多发性外生性骨疣 EXT1 限制性片段长度多态性 突变热点 -
双错配碱基ARMS结合RE法快速检测FGFR3基因的突变超热点
目的 建立快速简便、特异灵敏的鉴定FGFR3基因c.1138 G＞A突变超热点的基因诊断方法,为软骨发育不全(ACH)的产前基因诊断或植入前遗传学诊断(PGD)创造条件. 方法 针对突变率高达95%以上的FGFR3基因的突变热点c.1138 G＞A,设计双错配碱基的ARMS特异引物,对已经临床确诊的先证者家系及正常对照和非c.1138 G＞A突变的患者对照,分别用普通引物和特异引物进行PCR扩增和直接鉴定,然后对扩增产物进行DNA序列分析及SfcI酶切鉴定. 结果 用普通引物扩增,对照组和先证者均扩增阳性.SfcI酶切后,对照组仍为一条513 bp的带,而患者切出205bp、308bp和513 bp三条带;而用ARMS特异引物扩增,则先证者扩增阳性,而对照组扩增阴性,阳性者酶切后产生27bp和418 bp两条带.这一切都与预期的结果完全吻合. 结论 该法快速、特异、准确性高,结合DNA序列分析和酶切鉴定(RE),可用于ACH高危胎儿的快速产前诊断.
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一个先天性白内障家系基因突变热点分析报告
目的:对一个来自广东兴宁的四代先天性白内障家系进行常染色体显性基因突变热点的分析,了解这个家系在热点上是否有相应的改变.方法:该家系19名成员(包括患者8人,非患者11人)知情同意进入本研究.8例患者在中山眼科中心接受全面的眼部及全身检查,以排除存在白内障以外眼部及全身疾患.11例非患病亲属仅接受眼部检查.对这19例研究对象各抽取外周血5ml,提取基因组DNA.针对国外文献报道(截至2003年1月为止)的与常染色体显性遗传先天性白内障相关的10个基因(CRYAA、CRYAB、CRYBA1/A3、CRYGD、GJA8、CRYGC、CRYBB2、GJA3、MIP及BFSP2)的17个突变热点,设计引物使聚合酶链反应扩增的片段覆盖这17个位点,对扩增产物进行测序和序列分析,了解这19名研究对象在17个突变热点上是否有相应的序列改变.结果:19例研究对象,在国外文献报道的17个与常染色体显性遗传先天性白内障相关的突变热点,均未发现相应的序列改变.结论:初步排除这个常染色体显性遗传先天性白内障家系与国外文献报道的17个突变热点相关.
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两个常染色体显性遗传先天性白内障家系突变热点筛查
[目的]对2个常染色体显性遗传先天性白内障中国家系进行基因突变热点筛查,以了解这两个家系的先天性白内障是否与文献报道的17个突变热点相关.[方法]对两个家系共20名成员(包括患者11人,非患者9人)抽取外周血提取基因组DNA,针对截至2003年1月为止国外文献报道的与常染色体显性遗传先天性白内障发病相关的10个基因上的17个突变热点,包括CRYAA(ARG116CYS),CRYAB(del450A),CRYBA1(EX3-4 DEL),CRYBB2(GLN155TER),CRYGC(THR5PRO,5-BP DUP at NT226),CRYGD(ARG14-CYS,PRO23THR,ARG58HIS,ARG36SER),GJA3(ASN63SER,PRO187LEU),GJA8(GLU48LYS,PRO88SER),BFSP2(ARG287TRP)及MIP(GLU134GLY,THR138ARG),设计引物使PCR扩增片段涵盖上述热点,对扩增产物进行序列分析,检测这11名患者在突变热点上是否有相应的序列改变.[结果]20名被检者的10个基因片段序列与GenBank发表序列相同,在17个突变热点均未发现相应基因突变.[结论]初步排除这个家系的先天性白内障与17个突变热点相关.
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异常血红蛋白81例基因分析
目的 研究我国两广地区异常血红蛋白(Hb)的基因突变热点.方法 对广东、广西籍患者外周血样本进行血红蛋白碱性琼脂糖凝胶电泳,收集电泳异常标本进行基因检测.结果 共收集到81例异常血红蛋白样本进行基因分析,发现以异常Hb E、Q-Tailand、New York突变频率高,同时Hb G-Coushatta、Hb G-Chinese、Hb J-Bangkok也较常见.Hb G-Taipei、Hb D-Punjab、Hb Ottawa也有分布,另外Hb Haringey、Hb Ube-4及Hb Ube-2为我国首例报道.结论 我国两广地区异常血红蛋白以E、Q-Tailand、Hb New York为主,异常血红蛋白型别丰富.
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BRAF基因突变与甲状腺癌关系的研究进展
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK),也叫细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK),是MAPK信号传导通路RAS→RAF→MEK→ERK的下游蛋白激酶,在肿瘤形成和生长、转移过程中起重要作用.70℅甲状腺癌与MAPK通路串联激酶的激活有关[1].甲状腺腺瘤、滤泡状腺癌(follicular thyroid cancer, FTC)主要与RAS基因突变有关;甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer, PTC)与染色体重组致癌基因融合(RET/PTC1,RET/PTC3),BRAF基因突变等有关.目前,基因分型诊断已成为甲状腺癌的重要研究内容.散发性成年人PTC的BRAF基因突变率高,且有BRAF T1799A(V600E)突变热点,本文就BRAF T1799A突变基因型甲状腺癌的临床病理特性、预后以及临床应用前景综述如下.
