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肝豆状核变性中医证型与ATP7B基因突变的相关性研究
目的 探讨肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration,HLD)不同中医证型与ATP7B基因突变位点之间的关系.方法 101例HLD患者中医辨证分型为痰瘀互结证、湿热内蕴证、脾肾阳虚证、肝肾阴虚证、肝气郁结证及其他证型,采用Sanger测序法行基因突变位点检测,并分析中医证型与突变位点的关系.结果 101例HLD患者中,痰瘀互结证是常见中医证型;ATP7B基因突变常见的外显子为8,1 3,2,ATP7B基因的基因型及等位基因在HLD不同中医证型的分布中无差异(P＞0.05),性别不能造成遗传差异(P＞0.05),而不同中医证型与突变外显子之间存在差异(x2 =29.57,P＜0.05);痰瘀互结证与外显子2呈正相关(P＜0.05),湿热内蕴证与外显子8,2呈负相关(P ＜0.05,P＜0.01).结论 HLD患者中医证型与突变外显子有一定的相关性,可为HLD患者的中医辨证提供客观化依据.
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高分辨熔解曲线技术在Wilson病致病基因突变鉴定中的应用
目的 在一个肝豆状核变性(WD)家系中进行致病突变鉴定和产前基因诊断.方法 酚-氯仿法提取外周全血或妊娠13周胎儿绒毛组织基因组DNA;利用PCR-Sanger测序技术对先证者ATP7B基因外显子及外显子/内含子衔接区序列进行突变分析;针对先证者携带的突变位点,应用聚合酶链反应(PCR)-高分辨熔解曲线(HRM)方法对先证者家系4名成员进行突变鉴定,并在此基础上为患儿母亲提供产前基因诊断.结果 先证者ATP7B基因第8外显子存在纯合致病突变c.2333G＞T(p.R778L);该家系5名成员和4名群体正常样本分属于3种不同熔解曲线.HRM分析结果与测序结果一致,即:患儿本人为R778L的纯合子,其父母、姐姐和母亲产前诊断的胎儿均为突变杂合子,4名群体正常对照为纯合野生型.结论 在一个WD家系中检测到ATP7B基因热点突变c.2333G＞T(p.R778L),并针对该突变建立了一种基于PCR-HRM技术的快速突变鉴定方法,成功为家系提供产前基因诊断.
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应用双重PCR-SSCP检测Wilson病患者的基因突变
目的 探讨应用双重PCR-SSCP技术检测Wilson病(WD)患者基因突变的可行性,以期建立一种快速、高效的WD基因诊断方法 .方法 应用双重PCR技术扩增140例无亲缘关系的WD确诊患者和30例正常对照组的ATP7B基因第8、12外显子并行SSCP筛查,对出现异常泳动带型的外显子进行DNA测序确定突变位点和形式.结果 正常对照组呈一种泳动带型,66例患者呈7种异常泳动带型,测序结果 证实异常泳动带型均发生了突变,突变率占47.14%(66/140),其中Arg778Leu/Gln突变率为37.14%(52/140),Thr935Met突变率为12.86%(18/140).结论 应用双重PCR-SSCP技术检测WD基因第8、12等外显子是行之有效的方法 ,且可明显提高检测效率.
关键词： Wilson病 ATP7B基因 基因突变 双重PCR-SSCP 基因诊断 -
人ATP7B基因在转基因大鼠的铜代谢通路中的功能分析
目的利用转基因大鼠模型,研究人Wilson病致病基因ATP7B在铜代谢通路中的功能.方法将构建的7.1 kb含有鸡β肌动蛋白启动子的人正常ATP7B cDNA,经显微注射法导入Wilson病动物模型LEC(long-evans cinnamon)大鼠受精卵的雄性原核.以RT-PCR和Western blot分析其在转基因大鼠各组织内的表达谱;用抗大鼠铜蓝蛋白抗体检测肝细胞全铜蓝蛋白(holoceruloplasmin)的合成;同时对6～30周龄的转基因大鼠血清铜蓝蛋白亚铁氧化酶活性、血清铜浓度、胆汁的铜分泌量、以及肝、肾和脑组织中的铜含量进行分年龄段连续测定和统计学分析.结果在转基因大鼠体内,ATP7B在各种组织中获得广泛表达,其中肝和肌肉中的表达水平较高,肝细胞恢复了全铜蓝蛋白的合成,血清中的铜含量及胆汁的铜排泄量增加,肝、肾组织中的铜蓄积减少.结论完整表达人ATP7B基因产物的转基因大鼠的肝细胞,通过CPN介导的铜向血清的分泌和调节铜向胆汁的排泄,恢复了ATP7B参与铜转运功能,Wilson病的铜蓄积与ATP7B基因的突变直接相关.
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肝豆状核变性诊治中的若干问题及其建议
肝豆状核变性(hepatolenticuler degeneration,HLD)是一种常染色体隐性遗传病,由Wilson于1912年首次描述,故又称为Wilson病(Wilson's disease,WD),致病基因为ATP7B基因,编码ATP7B蛋白.ATP7B基因突变可导致ATP7B蛋白失去功能,引起机体排铜障碍,造成铜过度沉积于肝、脑、肾等重要脏器而引起相应组织变性,临床上主要表现为肝损害、锥体外系症状、精神异常、肾损害和骨骼畸形等.
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疑似肝豆状核变性ATP7B基因第8外显子的基因序列分析1例
肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration,HLD)又称wilson病(Wilson‘s disease,WD),是由铜代谢障碍引起的常染色体隐性遗传性疾病.肝豆状核变性的致病基因为ATP7B基因,该基因的缺陷将会影响所编码的ATP7B活性,使过量的铜沉积在肝、脑、肾和角膜等组织器官,导致急慢性肝病、神经系统疾病、肾病和角膜色素环等.
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Wilson病基因第8、14和18外显子突变检测的初步研究
目的:探索中国人群wilson病基因(ATP7B)第8、14、18外显子突变特征.方法:采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)银染技术初步研究了30例患者和15例正常人ATP7B基因第8、14、18外显子突变频率.结果:第8外显子有6例患者发现泳动异常(20%,6/30),且均为杂合子;14、18外显子及正常人未见异常迁移.结论:提示中国人ATP7B基因第8外显子可能为一突变热区.
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儿童肝豆状核变性38例临床分析
目的 探讨儿童肝豆状核变性(WD)的临床特征及诊断.方法 回顾分析38例WD患儿的临床资料.结果38例患儿中男15例、女23例,确诊时中位年龄6.0岁,起病到确诊时的病程平均5.7个月,中位病程2个月,长3年.以肝功能异常首发者为常见(71.1%),其中谷氨酸氨基转移酶>2 倍正常上限者27例(71.1%);血铜蓝蛋白明显降低36例(94.7%),铜氧化酶明显降低37例(97.4%);33例检测24小时尿铜均升高,其中32例(84.2%)>150 μg/24 h.存在K-F环10例(26.3 %).19例患儿行ATP7B基因测序,阳性率83.3 %.结论 儿童WD起病以肝脏病变为多,结合血铜蓝蛋白、铜氧化酶以及24 h尿铜测定基本可作出临床诊断.对于高度怀疑但依据不足的患儿行ATP7B基因检测有助于早期明确诊断.
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儿童肝豆状核变性临床表型及ATP7B基因突变关联性分析
目的 了解汉族儿童肝豆状核变性(WD) 患儿的临床表型与ATP7B基因突变的相关性.方法 以2005年7月至2012年12月就诊于复旦大学附属儿科医院确诊WD患儿为研究对象,按起病部位分为肝病型和神经型,以临床表现分为临床型和亚临床型.采用PCR技术扩增ATP7B基因全部外显子并直接测序.提取临床表型和基因型的信息;分析两者之间的相关性.结果 52个无亲缘关系家庭的53例WD患儿进行分析.肝脏损害52例(98.5%).肝病型41例,神经型12例;临床型19例,亚临床型34例.①肝病型ALT升高明显;神经型24 h尿铜水平、胆汁酸水平和K-F环阳性率均显著高于肝病型;亚临床型起病年龄、ALT或AST异常率显著高于临床型;24 h尿铜水平、胆汁酸升高比例和K-F环阳性率显著低于临床型.②53例WD患儿ATP7B基因外显子序列分析发现致病性突变等位基因97个,突变频率为91.5%.纯合突变8例,复合杂合36例,杂合突变9例.错义突变23种,插入/缺失突变8种,无义突变2种,剪接突变3种.③错义突变与非错义突变,纯合突变与杂合突变患儿在起病年龄、K-F环阳性率、铜蓝蛋白水平、24 h 尿铜水平和ALT、AST异常率等方面差异无统计学意义.④3种高发突变p.Arg778Leu(35.0%,34/97)、p.Pro992Leu (15/97,15.5%)和p.Ala874Val/Pro(5/97,5.2%)在临床型和亚临床型、肝病型和神经型间的分布差异无统计学意义.⑤纯合、错义和错义+剪接突变在临床型和亚临床型、肝病型和神经型间的分布差异无统计学意义.结论 WD患儿几乎均有肝脏受累,多以肝病表现起病.ATP7B常见突变为p.Arg778Leu、p.Pro992Leu和p.Ala874Val,常见基因型和临床表型间未发现显著相关性.p.Ala874Val/Pro突变患儿起病年龄较低,剪接突变对血清铜蓝蛋白影响较小.
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肝豆状核变性并发突发性耳聋2例分析
目的:探讨肝豆状核变性和突发性耳聋的相关性.方法:对2例住院治疗的肝豆状核变性合并突发性耳聋患者临床资料进行分析.结果:2例肝豆状核变性患者临床铜代谢异常、电测听提示为神经性耳聋,头颅MRI检查排除桥小脑角病变,临床确诊为肝豆状核变性和突发性耳聋.2例患者均在驱铜治疗的同时予以改善内耳循环、营养神经和激素治疗.1例患者获得临床痊愈,1例患者听力改善.结论:肝豆状核变性患者合并突发性耳聋临床尚未见报道,两者相关性尚不明确;突发性耳聋的治疗时机尤为重要,早期诊断和早期治疗可以获得临床痊愈.
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Wilson病的动物模型
无论是发病机制还是治疗策略的研究,合适的动物模型目前都已成为Wilson病研究的瓶颈.本文系统现有目前几种公认的模型及相关的研究进展.
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45例国人Wilson病基因第8外显子突变热区检测和序列分析
目的检测中国人群Wilson病基因(ATP7B)第8外显子突变频率并进行序列分析.方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)银染技术初步研究了30例患者和15例正常人ATP7B基因第8外显子突变频率,然后对突变个体直接测序,进而与临床表型作相关分析.结果SSCP发现有6例患者出现第8外显子泳动异常(20%,6/30),且均为杂合子;4例患者既存在2 273G→T,又同时伴有2 250C→G及2 280G→T;前者是错义突变(即Arg78Leu),累及Tm4区,后者由于氨基酸组成均为Leu,仅是一种保守改变,对Tm4区无影响;1例患者同时存在2 099A→G、2 273G→T、2 250C→G及2 280G→T 4个位点突变,前两者分别影响Tm3、Tm4区,后两者认为是保守改变;1例患者2 245G insertion是一种新的突变类型,影响Tm4区.结论提示中国人ATP7B基因第8外显子可能为一突变热区,2 273G→T(Arg 778Leu)是一种常见的突变类型,Tm4是常见受累功能区之一.
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肝豆状核变性患者ATP 7B基因外显子8、12、18的DNA测序突变
目的 对肝豆状核变性(WD)患者ATP7B基因外显子(exon)8、12、18进行PCR扩增测序,研究其突变特点.方法 对30例患者(WD组)和10例健康者(对照组)提取外周血基因组DNA,PCR扩增ATP7B基因外显子8、12、18相关片段,并对扩增产物进行测序和分析测序结果 .结果 对照组未见异常,WD组发现12例患者外显子8有突变,突变率为40.0%,测序发现有6例患者外显子Arg778leu呈复合杂合子突变;发现4例外显子12有突变,有2例患者存在双重突变,外显子18未检出突变.结论 WD的ATP7B基因外显子8、12为突变的热点区,18号外显子不是突变热点.
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中国人Wilson病ATP7B基因启动子区的研究
目的 研究中国人Wilson病(WD)ATP7B基因启动子区的序列和结构,发现存在的多态和突变情况.方法 检测60例无亲缘关系的WD患者和20例正常人的基因组DNA序列并进行分析.结果 (1)在正常对照和WD患者的启动子区-190位和-78位(转录起始点为+1)均发现存在单个碱基的不同;(2)60例WD患者中,3例发现存在-504位G→C的突变,其中2例为纯合突变,1例为杂合突变,在正常对照中未发现此改变.(3)60例WD患者中,2例发现存在-782位A→G的突变,其中1例为纯合突变,另1例为杂合突变,在正常对照中未发现此改变.结论 WD基因的转录直接受铜或其他重金属的调节.中国人WD基因启动子区序列存在的2个多态位点均位于已知的转录调控元件结构之外,提示核苷酸多态对启动子调控基因的表达不会产生影响.启动子区的突变也是WD的分子发病机制之一.提示WD基因的分子发病机制是多样又复杂.
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7例肝豆状核变性患儿ATP7B基因突变的检测与分析
目的 探讨肝豆状核变性患儿ATP7B基因全长外显子基因突变类型及其与临床表型的相关性.方法 对7例肝豆状核变性患儿的ATP7B基因进行全外显子检测.结果 7例肝豆状核变性患儿中1例ATP7B基因未检测出突变,6例检测出6种突变,分别为R778L、G711W、N1270S、A887LfsX14、de1930I、V1121A,R778L和V1121A检出率为28.6％,其他突变检出率均为14.2％.结论 肝豆状核变性患儿ATP7B基因突变呈多样性,R778L突变与临床表型不存在明确相关性.
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基因诊断一家系3例Wilson病报道
一家系3例以肝病为主要临床表现的患者,经ATP7B基因分析确诊为Wilson病.提示ATP7B基因分析对临床表现不典型的Wilson病患者具有重要的诊疗意义.
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以肝病为首发表现的Wilson病患者病理及突变位点分析
目的 对以肝病为首发表现的Wilson病(Wilson's disease,WD)患者ATP7B基因外显子进行PCR扩增并测序,研究WD患者基因突变的特点.方法 研究对象包括20名无亲缘关系的正常对照者和45例WD患者,提取基因组DNA,扩增外显子的部分片段,并对扩增产物进行测序分析.结果 健康对照者未见异常,WD组检测到21种突变,包括4种新发突变,其中12号外显子Lys952Arg和16号外显子Val1140Ala突变频率均为30.2％,为突变热点.肝脏病理主要表现为不同程度的肝脏损伤,48.9％有脂肪变性,所有患者均有不同程度的肝纤维化,86.7％铜染色阳性.结论 我国以肝病为首发表现的WD患者ATP7B基因突变是以少数几个热点突变为主和其他广泛存在的少见突变为辅为特征.
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中国人肝豆状核变性ATP7B基因8号外显子突变研究
目的 分析肝豆状核变性(WD)ATP7B基因8号外显子在中国人中的突变特点.方法 提取141个无血缘关系家系的146例中国人WD患者和50例健康对照者的外周血DNA,聚合酶链反应(PCR)扩增ATP7B基因8号外显子,并对产物进行直接测序.应用Sequencing AnalysisTM软件分析测序结果.结果 146例WD患者中共发现93例存在基因突变,c.2333G>T(Arg778Leu)错义突变频率为40.78%,包括26例纯合突变,63例杂合突变,且均伴c.2250C>G(Leu770Leu)多态;1例c.2294A>G(Asp765Gly)错义突变发生频率为0.35%;5例c.2298_2299insC(Pro767Pro)插入突变发生频率为1.77%,其中2例并c.2333G>T(Arg778Leu)杂合突变.50例健康对照者均未发现突变.结论 在146例中国人WD病患者中,除Arg778Leu热点突变和c.2294A>G错义突变外,c.2298_2299insC为中国患者中未曾报道的新型插入突变.
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肝豆状核变性的分子诊断与治疗
肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration,HLD)又称Wilson病(Wilson's disease,WD),是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍性疾病,位于13q14.3的ATP7B基因是其致病基因.WD是少数可以治疗的神经遗传病之一,患者如果能在发病早期或症状前期得到及时诊治,大多预后良好,反之病情逐渐加重甚至危及生命.早期诊断尤其是对有先证者的家系成员进行症状前期诊断对WD患者的预后至关重要.在判断临床表现和实验室检查结果不典型的WD疑诊患者或有WD先证者的家系成员是否患病抑或是杂合子时,基因诊断有着十分重要的价值.随着WD基因的克隆以及基因诊断的应用和普及,基因诊断在WD的临床诊断中愈益受到重视,与之相关的基因治疗研究也方兴未艾.本文将近年来WD分子诊断和治疗的研究进展综述如下,以期对WD患者的临床诊疗有所裨益.
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SYBR Green荧光定量PCR检测外源ATP7B对于内源CP基因转录的影响
[目的]应用SYBR Green荧光定量PCR检测在正常BRL细胞中短暂转染人ATP7B cDNA后CP基因的转录情况.[方法]分为空质粒组(转染空质粒Kbpala/Alb)和处理组(转染野生型Kbpala/Alb-ATP7B),分别于转染后0、4、8、12、24、48、72、168 h提取mRNA,逆转录后行SYBR Green荧光PCR检测人ATP7B cDNA及大鼠CP基因的转录情况.SAS11.0统计软件进行数据处理和分析.[结果]人ATP7B cDNA在短暂转染后约48h转录达高峰,可持续至转染后7 d以上;经方差分析,空质粒组转染后各时间点CP基因的转录水平与t=0 h相比较P＞0.05;处理组亦是.[结论]外源ATP7B cDNA的转染及表达对于内源性CP基因的转录无影响.
