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绿色荧光转基因大鼠模型的建立
目的 随着干细胞研究的推进,大鼠干细胞的研究日趋迫切.本研究旨在为活体荧光影像系统、干细胞归巢、细胞移植体内示踪研究,提供绿色荧光蛋白EGFP转基因大鼠模型.方法 通过显微注射方式获得EGFP转基因大鼠,采用活体荧光影像系统、激光共聚焦显微镜,对EGFP转基因大鼠各个组织的荧光表达水平进行比较;采用流式细胞术检测转基因大鼠血液和骨髓细胞、骨髓干细胞的荧光标记率,筛选骨髓干细胞高效标记绿色荧光的转基因大鼠.结果 建立了心脏、肝脏、肌肉、肺、胰腺、脑、膀胱、胃、肾脏、肠和脾脏组织中,系统性表达EGFP的SD-TgN(ACT-EGFP-1)ZLFILAS转基因大鼠;流式细胞术检测表明,该品系血液细胞绿色荧光标记率为94.4%,骨髓干细胞绿色荧光标记率为97.8%.结论 建立了多组织系统性高表达绿色荧光,骨髓干细胞荧光标记率高达95%以上的转基因大鼠,为影像分析,造血干细胞的归巢等研究提供了大鼠模型.
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Nrf2抗氧化通路在CCl4所致大鼠急性肝损伤中的保护作用
目的 研究Nrf2氧化损伤通路在CCl4所致大鼠急性肝损伤中的保护作用.方法 将20只雄性Wistar大鼠随机分为溶剂对照组和CCl4组,每组10只,另选10只雄性Wistar大鼠,通过载体进行转基因大鼠雄原核显微注射,获得了目的基因Nrf2-tk整合与特异表达的转基因大鼠,作为CCl4+Nrf2整合组.溶剂对照组静脉给予1%聚山梨酯-80,共4 d,CCl4组和Nrf2-tk整合组静脉给予1%聚山梨酯-80,共4 d,第4天给予1%聚山梨酯-8030 min后,静脉给予7.5 mg/kg CCl4,24 h后处死大鼠.测定血清中AST、ALT和LDH的水平,分别测定肝脏组织中MDA、GSH、GSSG的含量,并计算GSH/GSSG比值.留取肝脏组织,常规石蜡包埋切片,HE染色,光学显微镜下观察肝脏组织的病理变化.结果 和溶剂对照组相比,CCl4组大鼠的血清AST,ALT和LDH的水平明显升高(P<0.05),Nrf2-tk转基因组大鼠的AST,ALT和LDH的水平亦有轻度升高,但差异无统计学意义(P>0.05).肝脏的MDA含量以及GSH/GSSG比值显示Nrf2-tk整合组可以有效降低CCl4造成的脂质过氧化损伤和谷胱甘肽的消耗,肝脏病理观察结果显示和CCl4组相比,Nrf2-tk整合组明显减轻了CCl4造成的损伤.结论 Nrf2抗氧化损伤通路在CCl4所致大鼠急性肝损伤中的起着重要的保护作用.
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人ATP7B基因在转基因大鼠的铜代谢通路中的功能分析
目的利用转基因大鼠模型,研究人Wilson病致病基因ATP7B在铜代谢通路中的功能.方法将构建的7.1 kb含有鸡β肌动蛋白启动子的人正常ATP7B cDNA,经显微注射法导入Wilson病动物模型LEC(long-evans cinnamon)大鼠受精卵的雄性原核.以RT-PCR和Western blot分析其在转基因大鼠各组织内的表达谱;用抗大鼠铜蓝蛋白抗体检测肝细胞全铜蓝蛋白(holoceruloplasmin)的合成;同时对6～30周龄的转基因大鼠血清铜蓝蛋白亚铁氧化酶活性、血清铜浓度、胆汁的铜分泌量、以及肝、肾和脑组织中的铜含量进行分年龄段连续测定和统计学分析.结果在转基因大鼠体内,ATP7B在各种组织中获得广泛表达,其中肝和肌肉中的表达水平较高,肝细胞恢复了全铜蓝蛋白的合成,血清中的铜含量及胆汁的铜排泄量增加,肝、肾组织中的铜蓄积减少.结论完整表达人ATP7B基因产物的转基因大鼠的肝细胞,通过CPN介导的铜向血清的分泌和调节铜向胆汁的排泄,恢复了ATP7B参与铜转运功能,Wilson病的铜蓄积与ATP7B基因的突变直接相关.
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HIV-1转基因大鼠的肾脏氧化应激与凋亡基因的表达
目的 检测HIV-1转基因大鼠和F344大鼠肾脏COX3、COX5a、SOD2、GPx4、Caspase-1、Bax、BCL2L1、FasLg基因表达水平,探讨相关基因表达与HIV-1致肾脏病理变化的相关性. 方法 以GAPDH为内参照,应用SYBR Green染料法进行相对实时荧光定量PCR检测COX3、COX5a、SOD2、GPx4、Caspase-1、Bax、BCL2L1、FasLg在HIV-1转基因大鼠和F344大鼠肾脏中的表达情况. 结果 HIV-1转基因大鼠肾脏组织中氧化应激相关基因COX3、COX5a、SOD2、GPx4基因表达水平分别是F344大鼠的0.440,0.791,1.703,0.346倍,其中SOD2基因表达水平显著升高(P＜0.05),COX3、COX5a、GPx4显著降低(P＜0.05).HIV-1转基因大鼠肾脏组织中凋亡相关基因Caspase-1、BCL2L1、Bax、FasLg的基因表达水平分别是F344大鼠的1.389,1.145,0.400,0.590倍,其中,Caspase-1和BCL2L1基因表达水平显著升高(P＜0.05),Bax和FasLg显著降低(P＜0.05). 结论 HIV-1通过下调抗氧化酶基因表达水平使肾脏发生氧化应激,通过调控凋亡基因表达水平来拮抗肾脏细胞凋亡.
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mSOD1转基因阳性家族性肌萎缩侧索硬化症模型大鼠的生物学特征
目的:家族性肌萎缩侧索硬化症转基因大鼠模型的鉴定及生物学特性的检测.方法:实验于2006-06/12在北京市虹天济神经科学研究院完成.从国外购来mSOD1转基因的肌萎缩侧索硬化症大鼠模型及其野生型进行繁殖扩增;PCR筛选mSOD1基因阳性鼠作为实验观察对象;观察其行为学变化、绘制生长曲线;记录神经传导速度及肌电情况;苏木精-伊红染色法观察股二头肌标本病理学变化;尼氏染色法进行中枢神经系统的神经元计数.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.结果:繁殖并扩增了肌萎缩侧索硬化症模型的种群;PCR法成功筛选出了mSOD1基因的阳性鼠,mSOD1阳性鼠在生长过程中逐渐出现四肢运动障碍、体质量急剧降低且很快死亡;发病鼠神经传导速度减慢、肌电显示出自发的纤颤电位;肌纤维发生萎缩;中枢神经系统的神经元丢失明显且有部分神经元发生空泡样变.结论:mSOD1转基因阳性的肌萎缩侧索硬化症模型大鼠可表现出与人类疾病的相似症状,生物学各项指标变化明显,是理想的肌萎缩侧索硬化症研究模型.
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绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞的分离鉴定
背景：转基因动物提取的间充质干细胞自身携带绿色荧光蛋白，与传统病毒、质粒转染相比，能在活细胞中稳定地表达，可较快筛选其修饰的细胞。目的：观察绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法：取2周龄的绿色荧光蛋白转基因大鼠双侧长骨骨髓，采用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞。流式细胞术分析第5代绿色荧光蛋白阳性骨髓间充质干细胞的细胞表型，并分别加入成骨及成脂条件培养液进行体外多向诱导分化，采用茜素红钙盐染色和油红O染色进行鉴定。结果与结论：成功获得了稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表达 CD90和CD105，不表达或弱表达CD14和CD45。经成骨诱导3周后茜素红染色可见有橘红色钙盐沉积，经成脂诱导3周后油红O染色见红色的脂滴。结果表明稳定表达的绿色荧光蛋白未影响到骨髓间充质干细胞的多向分化潜能，可作为良好的示踪因子。
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血管内皮特异性过表达microRNA-155对大鼠妊娠过程的影响
目的:建立血管内皮特异过表达microRNA-155(miR-155)转基因大鼠模型并观察其血压、蛋白尿等表型及妊娠负荷施加后的变化.方法:把外源miR-155基因插入血管内皮细胞特异表达VE-cadherin启动子下游,构建转基因表达载体,将所得载体线性化后,通过受精卵显微注射技术,构建miR-155转基因大鼠,并利用特异引物PCR法鉴定转基因大鼠基因型.通过尾套法、生化检测、组织学检查对未孕和妊娠雌性转基因大鼠的表型进行初步分析.结果:血管内皮特异性过表达miR-155转基因大鼠在胸主动脉、腹主动脉、肾脏、心脏组织miR-155表达较野生型鼠增高2.3、3.3、2.9、3.3倍.未妊娠时miR-155转基因雌性大鼠血压、尿蛋白、血管壁和肾脏结构与非转基因型大鼠比较,差异均无统计学意义.但妊娠后miR-155转基因雌性大鼠血压轻度增高、蛋白尿增加、胎儿生长受限发生率增加,胸/腹主动脉的血管壁结构紊乱和肾小管上皮空泡样变等.结论:血管内皮特异性miR-155转基因大鼠妊娠负荷增加后,表现出子痫前期表型.
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转基因亨廷顿病大鼠与基因型相关的进展性认知和运动功能障碍
目的 探讨转基因亨廷顿大鼠模型是否表现进展性和基因型相关的认知和运动功能障碍.方法 转基因亨廷顿大鼠和同窝出生正常大鼠在15个月龄和20个月龄时接受选择反应时间任务和开放领地试验行为学检测.结果 亨廷顿大鼠比同窝出生正常大鼠有更多不成熟反应(基因型:F(2,13)=10.34,P＜0.01).随着动物月龄增加,不成熟反应率增加(月龄:F(1,14)=62.31,P＜0.01).在15个月时,纯合子亨廷顿大鼠的不成熟反应率比正常大鼠多68%(P＜0.05),20个月时,纯合子亨廷顿大鼠的不成熟反应率比正常大鼠多111%(P＜0.05).随着月龄增加,正确反应率下降(月龄:F(1,15)=28.32,P＜0.01).15个月时,各组间正确反应率相同,20个月时,纯合子亨廷顿大鼠的正确反应率比同窝出生的正常大鼠低27%(P＜0.05).另外,在训练过程中,反应偏倚也逐渐增加.15个月时,纯合子亨廷顿大鼠的偏倚明显高于同窝出生的正常大鼠230%(P＜0.05),20个月时,纯合子亨廷顿大鼠的偏倚明显高于同窝出生的正常大鼠350%(P＜0.05);另外,纯合子亨廷顿大鼠头部出现明显的不自主运动.结论 由于具有渐进发展的认知和运动功能障碍,转基因亨廷顿大鼠是研究亨廷顿疾病很有价值的动物模型.
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显微注射法建成HLA-B27转基因大鼠
目的 构建带HLA-B27基因的转基因大鼠,进一步研究HLA-B27 与强直性脊柱炎(AS)的发病原因及其机理.方法 应用转基因技术,把已克隆的人类AS基因HLA-B27基因组DNA导入Wistar大鼠受精卵中,并移植到假孕母鼠输卵管内,21 d后,出生27只原代大鼠.结果 经过PCR检测阳性后,再继续进行Southern印迹分析,确认3只大鼠为带HLA-B27基因转基因大鼠,整合率为11.11 %,其中1只转基因大鼠出现外周关节炎及脊柱强直表现.结论 本研究进一步表明HLA-B27 与AS的强相关性,为研究AS病因病理及治疗打下了基础.
