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北京地区侵染菘蓝的黄瓜花叶病毒分子鉴定
为了鉴定中国医学科学院药用植物研究所栽培地中菘蓝花叶病样品中可能的病毒,采用反转录(reverse transcription,RT)-PCR方法,以马铃薯Y病毒属Potyvirus、马铃薯卷叶病毒属Polerovirus和烟草花叶病毒属Tobamovirus的通用检测引物,蚕豆萎蔫病毒2号(broad bean wilt virus 2,BBWV2)和黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)的特异检测引物进行分子检测.结果表明,用CMV特异引物扩增到1条657个核苷酸(nt)的条带,测序后经BLAST分析发现,该条带与CMV-Vi的核苷酸相似度高达99％,氨基酸相似度为100％,命名为CMV菘蓝分离物(CMV-It).根据CMV CP基因的核苷酸序列构建系统发育进化树表明,CMV-It与CMV-K分离物的亲缘关系较近,属于CMV I亚组.该研究首次用RT-PCR方法鉴定了菘蓝花叶病样品被CMV侵染,并分析了其CP基因序列特征,为菘蓝病毒病的研究及田间防治提供了依据.
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番木瓜环斑病毒畸叶株系的CP基因克隆和序列分析
采用RT-PCR方法合成了本研究室保存的番木瓜畸叶病毒(PMaLV)的外壳蛋白(CP)基因,将其CP基因克隆进Promega公司的pGEM-T and pGEM-T Easy Vector System(简称T-载体),并进行了序列分析.结果表明,PMaLVCP基因核苷酸序列全长为861nt,推导其编码287个氨基酸.与番木瓜环斑病毒(PRSV)美国夏威夷HA株系和澳大利亚W株系的CP基因相比,在第66nt处开始连续缺失3个核苷酸.与PRSV的华南Ys、Sm和G株系以及夏威夷的HA和澳大利亚的W株系相比,其CP基因序列同源率分别为96%、98%、95%、89%和89%.其推导的氨基酸序列同源率分别为98%、97%、97%、96%和95%.此结果表明,PMaLV属于PRSV的一个株系,不是一种新病毒.因此,我们称其为番木瓜环斑病毒畸叶株系(ML株系).
关键词： 番木瓜畸叶病毒 番木瓜环斑病毒 番木瓜环斑病毒畸叶株系 CP基因 -
侵染浙贝母的浙贝母病毒Y(FVY)CP基因的原核表达及抗血清制备
目的:制备抗侵染浙贝母的浙贝母病毒Y(Fritillary virus Y,FVY)CP血清,为大田检测FVY和研究FVY与其他病毒之间的血清学关系奠定基础.方法:根据Genbank报道的FVY CP基因序列设计引物,扩增其CP基因.Blast分析FVY CP基因核苷酸序列与其他马铃薯Y病毒属成员CP基因的同源性.将CP基因插入表达载体pSBET,转化大肠杆菌BL21 (DE3) Plys E菌株,通过IPTG诱导表达.经12％ SDS-PAGE和5％ - 20％梯度SDSPAGE两次纯化CP,免疫小鼠获得抗CP血清,采用Western blot分析抗体的特异性.用原核表达的17种马铃薯Y病毒属病毒CP蛋白作为抗原,检测抗FVY CP血清是否能与其进行交叉反应.采用ELISA分析抗体能否与天然FVY病毒离子结合.结果:FVY CP基因与油点草病毒Y(TrVY)CP基因、大豆花叶病毒半夏分离物CP基因和小西葫芦黄花叶病毒六安分离物CP基因分别有81.2％、68.1％和67.2％的同源性.制备的抗体对FVY CP具有高度特异性,同时能与大豆花叶病毒半夏分离物(SMV-P)CP蛋白有中等强度的结合,与小西葫芦黄花叶病毒CP蛋白有弱的结合.结论:抗体能够与天然FVY病毒离子结合,因此可以作为该病毒的大田检测.
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SYBR Green荧光定量PCR检测外源ATP7B对于内源CP基因转录的影响
[目的]应用SYBR Green荧光定量PCR检测在正常BRL细胞中短暂转染人ATP7B cDNA后CP基因的转录情况.[方法]分为空质粒组(转染空质粒Kbpala/Alb)和处理组(转染野生型Kbpala/Alb-ATP7B),分别于转染后0、4、8、12、24、48、72、168 h提取mRNA,逆转录后行SYBR Green荧光PCR检测人ATP7B cDNA及大鼠CP基因的转录情况.SAS11.0统计软件进行数据处理和分析.[结果]人ATP7B cDNA在短暂转染后约48h转录达高峰,可持续至转染后7 d以上;经方差分析,空质粒组转染后各时间点CP基因的转录水平与t=0 h相比较P＞0.05;处理组亦是.[结论]外源ATP7B cDNA的转染及表达对于内源性CP基因的转录无影响.
