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家族性高胆固醇血症LDL-R基因点突变的初步研究
目的:建立一种快速、高效地检测LDL-R基因点突变的方法用于对家族性高胆固醇血症患者进行分析.方法:采用同一种程序和反应体系分别扩增家族性高胆固醇血症LDL-R基因包括18外显子和启动子在内的21个片段,琼脂糖电泳检测PCR产物,SSCP分析和PCR产物直接测序检测点突变.结果与结论:本方法可以快速、简便、有效地扩增LDL-R基因包括启动子在内的21个片段,PCR产物直接测序初步发现一家族性高胆固醇血症患者存在点突变.
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PCR-SSCP法检测非小细胞肺癌中FADD基因突变的研究
目的:检测Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associated death domain protein,FADD)基因在人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的突变情况,以探讨该基因在肺癌发生发展中的作用及机制.方法:采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(polymerase chain reaction and single-strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)检测74例NSCLC原发灶癌组织及13例癌旁正常肺组织中FADD基因突变情况.结果:74例NSCLC组织中检出5例发生FADD基因突变,FADD基因突变与癌的淋巴结转移呈显著正相关(rz=0.378,P=0.001),与其它临床病理特征无关.结论:NSCLC中存在着FADD基因突变.FADD基因突变在NSCLC的发生发展中可能起着重要作用.
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结核分支杆菌耐利福平耐药基因的检测
目的评估应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测rPOB基因突变在结核分支杆菌耐利福平(RFP)耐药性测定中的应用价值.方法采用PCR-SSCP方法对93株结核分支杆菌临床分离株(其中药物敏感株35株,耐RFP或含耐RFP耐多药株58株)和33例耐RFP肺结核病人痰标本rPOB基因突变进行检测,并对部分常规药敏试验耐药而用PCR-SSCP未检测到rPOB基因突变的PCR扩增产物阴性菌株用双脱氧末端终止法进行测序分析.结果以结核分支杆菌H37RV为对照,35株药物敏感株的rPOB基因PCR扩增产物258bp片段SSCP图谱正常;58株耐RFP分离株中,52株rPOB基因SSCP图谱异常,其敏感性为89.7%.SSCP图谱正常的5株耐RFP的PCR产物经测序证实,4株在531位密码子TCG→TTG,1株在526密码子CAC→TAC,1株未改变.33例耐RFP肺结核病人痰标本有30例PCR扩增阳性,23例SSCP图谱与H37RV株有差异,rPOB突变率为76.7%.结论 PCR-SSCP技术可以快速、准确地检测结核分支杆菌rPOB基因突变,该技术有望直接用于临床标本耐药性检测.
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基于ITS2条形码SNPs的人参和西洋参PCR-SSCP分子鉴别研究
目的:依据人参和西洋参ITS2条形码的专属性SNP鉴别位点,建立利用PCR-SSCP技术鉴别人参和西洋参的方法.方法:查找GenBank上已收录的人参和西洋参ITS2序列,进行比对分析,筛选人参和西洋参ITS2序列的专属性SNP鉴别位点,据此设计引物,采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法对11个人参样品和10个西洋参样品进行分析,对PCR产物进行测序验证.结果:人参和西洋参样品的PCR-SSCP谱带与各自的对照药材谱带一致,人参和西洋参的PCR-SSCP谱带有显著差异；PCR-SSCP鉴别结果和经测序鉴别结果一致.结论:和测序法相比,PCR-SSCP方法快速、准确,可用于人参和西洋参药材的鉴定.
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乳腺癌细胞动力学指标与相关基因表达、突变的关系
目的探讨乳腺癌细胞动力学及凋亡与相关基因表达、突变的关系. 方法采用流式细胞术检测54例乳腺癌DNA指数(DI)、S期细胞比例(SPF)、细胞增殖指数(PI)及细胞凋亡指数(AI),免疫组织化学法检测原癌基因c-erbB-2、Bcl-2、抑癌基因p53,增殖细胞核抗原PCNA、Ki67及托普DNA酶Ⅱ(Topo Ⅱ)的表达,PCR-SSCP法检测p53点突变及突变部位、类型; 结果高DI、异倍体率、SPF、PI、AI与c-erbB-2、p53、PCNA、Ki67、Topo Ⅱ高表达相关.低DI、SPF、PI、AI与Bcl-2高表达相关.高DI、SPF、PI、AI与p53高突变相关,高AI与p53突变类型之一--杂合性缺失(LOH)相关. 结论乳腺癌细胞动力学及凋亡的异常与相关基因的异常表达及突变密切相关.
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鲁道夫对盲囊线虫rDNA ITS遗传标记的研究
本实验通过对鲁道夫对盲囊线虫(Contracaecum rudolphii)rDNA的第一及第二内转录间隔区(ITS-1及ITS-2)进行PCR扩增、PCR-SSCP分析及序列分析,以明确ITS-1及ITS-2是否可作为C.rudolphii分子分类的遗传标记.结果发现:C.rudolphii rDNA ITS序列存在种间差异,并且差异显著,但是种内序列一致,没有差异.本实验证明C.rudolphii确为由两个种(C.rudolphii A和C.rudolphii B)组成的复合种,ITS-1及ITS-2可作为两个姊妹种的遗传标志.
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PCR技术应用于寄生虫分类鉴定的研究进展
PCR技术对寄生虫病原体的检测和鉴定提供了一种强有力的工具.PCR分子分类方法 具有操作简便、特异性高和信息量丰富等优点,弥补了形态学分类上的不足.本文介绍了PCR-RFLP、RAPD和PCR-SSCP等技术的基本原理及用于寄生虫分类鉴定的研究进展.
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E-钙粘蛋白在胃癌演进过程中的改变及意义
目的 了解E-钙粘蛋白在基因产物水平异质化表达对胃癌发生发展中的作用.方法 以35例新鲜胃癌标本和10例癌旁组织标本中提取的DNA为模板,采用PCR-单链构象多态性分析法对E-钙粘蛋白的exon8和exon9的基因突变进行筛选,对筛选阳性标本行DNA序列测定进行确证;采用免疫组化法检测以上标本的E-钙粘蛋白表达情况;采用SPSS 12.0统计软件进行数据分析.结果 35例胃癌标本中有3例检出E-钙粘蛋白exon8突变,突变阳性率为8.6％(3/35),exon9未发现基因突变,检测出的突变全部位于分化不良型胃癌标本中.6例分化型胃癌和10例癌旁组织中未检出基因突变.E-钙粘蛋白在癌与癌周黏膜、肿瘤分化程度及Lauren不同分型中的表达差异均具有统计学意义(P均＜ 0.05).结论 E-钙粘蛋白是参与胃癌发生、发展的重要分子,其表达与胃癌的分化程度、浸润性生长、组织结构完整性和破坏程度等生物学行为具有较显著相关性,其发生基因突变是导致胃癌发生、发展的重要因素.
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矽肺结核病耐喹诺酮(gyrA)基因情况分析
目的研究矽肺结核耐喹诺酮药敏试验与gyrA基因突变的关系.方法通过药敏试验和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术鉴定31株分枝杆菌临床分离株的菌种,分析gyrA基因突变的情况.结果30株临床分离株的16S rDNA SSCP电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同.16株耐喹诺酮类药临床分离株中,11株异常,占68.75%.结论gyrA基因突变与结核分枝杆菌对喹诺酮类药物耐药有关,且gyrA基因突变在药敏实验高、低浓度区均可发生.
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散发性结直肠癌组织APC突变的研究
结直肠癌是我国常见的胃肠道恶性肿瘤,近年来发病率有逐年上升趋势在美国,每年死于结直肠癌的患者约有55000.目前结直肠癌的确切病因仍不清楚,与环境、饮食及遗传等因素均有一定的关系.家族性腺瘤性息肉病基因(adenomatouspolyposis coli gene,APC)为家族性腺瘤性息肉病(familialadenomatous polyposis,FAP)的致病基[1],与散发性结直肠癌的关系仍不很清楚,本文应用银染聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand crnformationpolymorphism,PCR-SSCP)检测散发性结直肠癌新鲜组织中APC突变,旨在研究中国人散发性结直肠癌与APC突变的关系.
关键词： 结肠直肠肿瘤 家族性腺瘤性息肉病基因 突变 抑癌基因 PCR-SSCP -
心脏移植中HLA-Ⅱ类抗原基因配型的实验研究
建立人类白细胞抗原(HLA)-Ⅱ型抗原4个基因位点DRB1、DQA1、DQB1、DPB1的聚合酶链式反应-单-链构象多态分析(PCR-SSCP)配型方法.实验分三部分:1.通过预实验确定使用PCR-SSCP检测HLA-DRB1、DA1、DQB1、DPB1 4个位点的实验条件;2.使用以上方法对1例拟行心脏移植的患者在127例健康人群中进行基因位点的检测配型;3.对配型一致及不一致的供体和受体,进行体外混合淋巴细胞培养(MLC),以检验这种基因配型方法的可靠性.通过PCR-SSCP的检测配型,在127例供体中,2例DRB1位点、2例DQA1位点、3例DQB1位点、2例DPB1位点与受体相一致.体外MLC证实与受体不一致的供、受体MLC中,受体淋巴细胞呈高度增殖反应;而与受体某一位点一致的供体,其MLC中受体淋巴细胞增殖反应明显降低(P＜0.01).PCR-SSCP是一种快速、准确的HLA-Ⅱ类抗原基因位点检测配型的方法.
关键词： 器官移植 HLA-Ⅱ类抗原基因配型 PCR-SSCP -
应用PCR-SSCP银染检测膀胱癌中H-ras基因突变
目的:了解膀胱癌中H-ras基因突变情况.方法:应用PCR-SSCP银染和DNA测序技术对31例膀胱癌组织进行检测.结果:H-ras基因突变发生率为38.7%,突变位点在H-ras基因的第1外显子的第12位密码子,由GGC变为GTC.结论:H-ras基因突变与膀胱癌的发生发展存在着一定的联系,H-ras基因突变可望作为膀胱癌早期临床诊断有价值的指标.
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甲状腺乳头状癌TRβ1基因第7外显子突变的研究
目的:检测TRβ1基因exon7在甲状腺乳头状癌中的突变率,探讨其在甲状腺癌发生发展中的作用.方法:采用多聚酶联反应-单链构象多态性分析( PCR-SS-CP)和DNA测序方法,对82例甲状腺乳头状癌和10例对照组TRβ1基因exon7进行检测.结果:经PCR-SSCP技术筛选,82例甲状腺乳头状癌中有2例出现异常条带,经DNA测序该2例样本未发现TRβ1基因exon7突变点.结论:甲状腺乳头状癌发生与TRβ1基因exon7突变无相关性,但研究报道该基因在波兰人乳头状癌中突变率较高,其突变的发生是否与民族和种族相关还有待进一步的研究.
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PCR-SSCP技术检测原发性胃腺癌石蜡标本p53第七外显子基因突变的初步研究
目的:研究PCR-SSCP技术检测原发性胃腺癌石蜡标本中p53第7外显子基因突变,探讨其与肿瘤发展的关系.方法:应用PCR-SSCP(聚合酶链反应-单链构象多态性)技术检测37例原发性胃腺癌标本中p53第7外显子的基因突变,同时应用免疫组织化学技术检测p53蛋白的表达.探讨其与肿瘤发展的关系.结果:37例原发性胃腺癌标本中,p53第7外显子基因突变率为19%(7/37),7例发生突变的标本,其p53蛋白表达亦呈阳性,低分化腺癌突变率高于高、中分化腺癌(P=0.0006),发生淋巴结转移组突变率高于未发生淋巴结转移组(P=0.0003).结论:临床检测胃腺癌原发灶中是否存在p53第7外显子基因突变,有助于识别高度恶性的胃腺癌.
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P16基因在涎腺肿瘤中表达的研究
目的:P16基因是新近发现的直接参与细胞周期的抑癌基因,研究发现在许多肿瘤中存在着突变和缺失,但在涎腺肿瘤中的研究尚未见报道.本实验通过对P16基因在涎腺肿瘤中的表达研究,从分子水平上探讨涎腺肿瘤的发生机制和从组织水平上探索P16基因与涎腺肿瘤生物学特性的关系,以期在判断预后及恶性度上为临床提供指导.方法:本研究用PCR-SSCP检测21例新鲜涎腺肿瘤组织及每一例相同病例癌旁的正常涎腺组织的P16基因点突变;用免疫组织化学ABC法检测62例正常涎腺及其肿瘤存档蜡块标本P16蛋白的表达情况.结果:全部新鲜组织标本的P16基因第1及第2外显子经PCR扩增后均出现相应扩增产物.SSCP分析结果显示21例涎腺正常组织、炎症和肿瘤均未发现外显子异常.从免疫组织化学染色结果可以看出,P16蛋白在涎腺及其肿瘤的几乎所有腺管和有腺管形成趋势的上皮结构中呈现阳性表达,且其表达有随着肿瘤恶性度的增加而减少的负性相关变化趋势.在全部涎腺肿瘤中,P16蛋白表达阳性率占68.3%(41/60);在26例良性肿瘤中,阳性表达率为92.3%(24/26);在34例恶性肿瘤中,阳性表达率为50%(17/34),三者之间差异显著(P＜0.01).结论:本研究表明P16基因在涎腺及其肿瘤中有规律地定位于腺管及有腺管结构形成趋势的上皮中,且其强度与分化呈负相关,表明P16蛋白可能与涎腺肿瘤的组织发生和分化程度、预后等生物学行为有关;PCR-SSCP分析未见P16基因的异常改变,表明P16基因的异常改变可能发生于涎腺肿瘤的晚期.
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辐射致大鼠平滑肌细胞HPRT基因第7/8外显子突变分析
目的探讨辐射剂量与平滑肌细胞HPRT基因变异的关系,提供放射预防血管再狭窄的基础实验依据.方法不同剂量的放射性核素188Re内辐射平滑肌细胞后,应用6-TG筛选分离HPRT变异细胞,采用PCR-SSCP技术进行HPRT基因7/8外显子的变异分析.结果辐射后平滑肌细胞HPRT基因突变率为(5.5～13)×10-6;91株HPRT突变细胞克隆中,14.3%呈现7/8外显子缺失,16.5%呈现点突变,7/8外显子总变异率为30.8%;辐射剂量与HPRT基因突变率、第7/8外显子的总变异率及外显子缺失率呈正相关.结论辐射所致DNA分子的损伤,包括基因片段的缺失、断裂及点突变与辐射剂量呈正相关.
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室内氡暴露居民肺癌p53和k-ras基因突变
目的检测室内高氡暴露地区居民肺癌p53和k-ras基因突变.方法采用PCR扩增、PCR-SSCP电泳和序列分析方法.结果 9例标本中有5例p53PCR-SSCP电泳呈阳性结果,其中3例经克隆测序发现有碱基置换.结论室内氡浓度在200～350 Bq.m-3.a-1范围内的7例肺癌病例中有5例发生p53基因突变,p53基因突变还可能与肺癌患者的年龄及吸烟史有关.
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胃癌与幽门螺杆菌感染及p53、ras 基因突变的关系
目的 探讨幽门螺杆菌(Hp) 感染和p53、ras 基因突变在胃癌发生中的作用.方法 采用聚合酶链反应- 单链构象多态性分析法(PCR-SSCP) 进行p53( 外显子7) 及ras( 第12 密码子) 进行基因突变分析,并应用快速尿素酶试验(RUT) 法和HE 染色法检测Hp 感染.结果 83 例胃癌组织中,p53 基因与ras 基因发生突变阳性率分别为67.47%、63.86%,男女无差异,有远处转移中二者阳性率更高,而对照组中均无p53 与ras 突变发生.胃癌组织中Hp 感染率为71.08%,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01),且Hp 阳性感染组织中p53 和ras 的突变率明显高于Hp 阴性组织,差异均具有统计学意义(P<0.01 ;P<0.05).结论 Hp 感染和p53、ras 基因突变可能是胃癌的发生机制之一,Hp 感染可导致多基因联合突变.用PCR-SSCP 法联合检测胃黏膜组织中p53、ras 基因的突变将有助于胃癌诊断和预测胃癌远处转移.
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广西巴马小型猪ApoE基因外显子2片段的多态性分析
目的 克隆广西巴马小型猪载脂蛋白E(ApoE)基因外显子2片段并分析该片段的多态性,为建立广西巴马小型猪动脉粥样硬化模型奠定基础.方法 以广西巴马小型猪基因组DNA为模板,PCR扩增ApoE基因片段,应用PCR-SSCP方法分析其多态性.结果 克隆获得长237 bp的ApoE基因外显子2片段,测序结果比对参考序列同源性为100％.PCR-SSCP分析发现在该片段的229位点存在多态性,表现为AA型、AT型和TT型3种基因型.结论 成功克隆广西巴马小型猪ApoE基因外显子2片段,该片段存在多态性,有AA、AT和TT3种基因型,基因型频率分别为0.302、0.489和0.209.
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胃癌组织中p53基因突变和p53蛋白表达
目的 比较胃癌和癌旁组织中p53基因突变及p53蛋白的表达与淋巴结转移和预后的关系.方法 采用PCR-SSCP技术和免疫组织化学S-P法,对石蜡包埋组织进行p53基因外显子6、7和8,9以及p53蛋白的检测.结果 (1)p53蛋白的阳性表达在癌组织和癌旁组织中分别为47.6%和38.1%;有淋巴结转移的病例p53蛋白表达52.8%.(2)癌组织中p53外显子7的突变率为23.9%;癌旁组织中突变率为19.0%.癌组织中p53外显子6的突变率为10.5%;癌旁组织为8.6%.癌组织中p53外显子8,9的突变率为1.9%;癌旁组织为1.0%.结论 有淋巴结转移的病例中,p53外显子的突变率和蛋白的表达率均明显增高,提示p53外显子的突变在胃癌的发生发展中是一个重要因素,并促进肿瘤的转移.p53基因突变与p53蛋白高表达在癌组织和癌旁组织中无显著差异.
