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PCR-SSCP技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究
目的应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平(RFP)耐药性的意义.方法以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变.结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP 28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%.结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法.
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结核分枝杆菌耐喹诺酮临床分离株gyrA基因突变的研究
目的了解结核分枝杆菌喹诺酮(quinolones)耐药株耐药基因突变情况,评价其应用价值.方法通过16S rRNA聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术分析77株分枝杆菌临床分离株; 通过PCR-SSCP和直接测序技术分析结核分枝杆菌的gyrA基因突变的情况.结果 75株为结核分枝杆菌复合群.30株喹诺酮敏感株的gyrA基因的SSCP图谱中,11株与H37Rv相同,19株与卡介苗相同;与卡介苗gyrA基因的SSCP图谱相同的敏感株95位密码子为ACC,与H37Rv该图谱相同的敏感株95位密码子为AGC.45株喹诺酮耐药株中,34株(75.6%)gyrA基因SSCP图谱泳动异常,对25株泳动异常、出现频率较高耐药株测序证实15株(44.1%)为94位密码子GAC→GGC突变;10株(29.4%)为90位密码子GCG→GTG的突变.结论结核分枝杆菌耐喹诺酮与gyrA基因突变有关,PCR-SSCP可能成为测定结核分枝杆菌耐喹诺酮类药基因型的快速、简便的方法.
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结核分枝杆菌耐利福平药物机理的初步研究
目的 通过诱导试验观察结核菌产生耐利福平药物的全过程,初步分析结核菌耐该药的机理.方法 采用诱导试验、聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和序列分析,对经不同药物浓度传代培养后的结核菌强毒株(H37Rv)和36株临床耐药分离株进行分析.结果 在诱导到第7代时,H37Rv的PCR-SSCP电泳出现异常,经测序证实在513位点发生基因突变.36株临床耐药分离株中有23株发生突变,为63.9%(23/36);其中有5株与诱导株基因突变位点相同.结论 用药物不间断的刺激结核菌,是产生结核菌耐利福平药物的重要原因.
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三种结核分支杆菌耐药基因的检测方法
目的建立3种结核分支杆菌耐药基因的检测方法,了解耐药基因突变和耐药水平的关系.方法 108例临床痰标本分离株均做聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和传统梯度药敏试验.结果耐SM(rpsL)、RFP(rpoB)、INH(KatG)基因突变率分别为78.5%,68.2%,70.5%,其中,高耐SM,RFP,INH分离株分别为86.5%,89.3%,84.3%;低耐分离株分别为28.5%,16.5%,7.1%.结论结核分支杆菌耐药基因突变与耐药水平有密切联系,绝大多数结核分支杆菌耐药基因突变发生在高耐药株,少部分在低耐药株发生基因突变.
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中国98株布鲁杆菌OMP25基因高度保守
目的 分析布鲁杆菌毒力相关基因OMP25(编码外膜蛋白OMP25)在中国布鲁杆菌中的多态性分布,为研究致病机制,预防和控制大规模暴发布鲁菌病的流行病学研究提供理论基础.方法 利用聚合酶链反应单链构象多态(single-strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)方法检测116株布鲁杆菌(18株标准菌株和中国98株野生菌株)OMP25基因,取不同带型菌株的OMP25基因进行测序.结果 116株布鲁杆菌呈现8种不同图谱(1～8型),其中2型和7型是个别中国野生株所特有.8种带型仅有10个不同碱基在对应类型中发生变异,对编码蛋白氨基酸的改变不多.中国98株布鲁杆菌的OMP25基因高度保守,具有比较稳定的抗原特征.结论 高度保守性有助于布鲁杆菌的流行病学检测,为研制更安全有效的疫苗提供了理论依据.
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结核分枝杆菌链霉素耐药基因rpsL的检测
目的 探讨结核分枝杆菌(TB)对链霉素(Sm)耐药的分子机制,建立快速检测结核分枝杆菌Sm耐药性的方法.方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测80株结核分枝杆菌临床分离株的rpsL基因.结果 以H37Rv标准株为对照,21株敏感株中,1株(4.76%)SSCP和RFLP分析存在rpsL基因异常;59株耐药株中,36株(61.02%)SSCP和RFLP分析存在rpsL基因异常.结论 结核分枝杆菌对Sm耐药与rpsL基因突变有关,PCR-SSCP和PCR-RFLP技术可快速、准确地检测结核分枝杆菌对Sm的耐药性.
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HMA-SSCP方法研究人类巨细胞病毒UL144基因在临床低传代分离株中的多态性
目的探讨人类巨细胞病毒(HCMV)UL144序列在临床患儿低传代分离株中的多态性及与临床疾病的关系.方法对65株HCMV临床低传代分离株及7例同年龄组HCMV-DNA定量PCR方法检测阳性无症状感染儿尿液进行HCMV-UL144 PCR扩增及HMA-SSCP分析,并对其中32份阳性标本进行测序.结果65株分离株中有55株UL144全序列引物PCR扩增阳性,7份QPCR检测HCMV-DNA阳性无症状感染儿尿液中5份UL144全序列引物PCR扩增阳性.60份UL144扩增阳性标本HMA-SSCP(异源双链泳动及单链构象多态分析)呈现3种典型带形,巨结肠患儿分离株序列、小头畸形患儿的序列分布以1型为主,巨结肠患儿分离株序列没有2型,黄疸患儿以3型为主.结论HCMV-UL144广泛存在于临床低传代分离株中,用HMA-SSCP检测HCMV-UL144基因在临床低传代分离株中的多态性是一种可行的方法.HCMV不同疾病类型的HCMV-UL144序列不同,提示UL144基因可能对HCMV致病性起一定作用.
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异源双链和单链构像多态法筛查基因突变
目的比较异源双链、单链构像多态(SSCP)、异源双链-SSCP法筛查突变的效率,寻找简便有效的基因突变筛查方法.方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增23个已知的杂合子突变,分别以异源双链、SSCP、异源双链-SSCP法分析突变,对比各方法对突变的检出情况.结果 23个杂合子突变中,异源双链法、SSCP法与异源双链-SSCP法检出突变分别为22个(96%)、20个(87%)和23个(100%).异源双链法结果比SSCP法结果稳定,重复性好,两种方法之间有一定互补性,异源双链-SSCP法兼有两种方法的特点.结论异源双链-SSCP法突变检出率高,经济、简便,值得在基因突变筛查中推广应用.
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分子信标与毛细管电泳--激光诱导荧光检测联合筛查野生型基因
目的利用毛细管电泳--激光诱导荧光检测系统(CE-LIF)和分子信标杂交理论,建立一种新的聚合酶链反应(PCR)产物分析方法,以应用于野生型基因的临床筛查.方法 PCR扩增30例胃癌组织DNA的p73基因第3外显子、p53基因第5外显子和p16基因第2外显子,所得PCR产物与分子信标杂交,利用CE-LIF检测杂交产物,检出野生型基因.对照方法为单链构象多态性(SSCP)分析.结果 CE-LIF分子信标法与SSCP分析相比较,测得p73第3外显子野生型百分率分别为100%和100%;测得p53第5外显子野生型百分率分别为60.0%和63.3%(P=0.99);测得p16第2外显子野生型百分率分别为20.0%和20.0%.结论利用分子信标与CE-LIF联合检测野生型基因,是一种良好的筛选方法,高效快速、简便、成本低,适宜应用于临床.
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结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分离株embB基因突变的研究
目的了解结核分枝杆菌耐乙胺丁醇(EMB)分离株embB基因突变情况,研究其应用价值.方法通过聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)和PCR-直接测序技术分析102株结核分枝杆菌临床分离株embB基因.结果以H37Rv标准株为对照,102株结核分枝杆菌临床分离株的16S rDNA SSCP电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同.41株药物敏感株的embB基因SSCP均泳动正常,RFLP和测序分析与对照株相同.61株耐EMB分离株中,23株(37.7%)embB基因SSCP泳动异常;8株RFLP分析异常;测序分析23株均为306位密码子突变,其EMB MICs均≥20 μg/ml,其中8株为ATG→ATA或ATT突变,13株为ATG→GTG或CTG突变,后者EMB MICs均≥30 μg/ml.结论部分结核分枝杆菌耐EMB是由于其embB基因突变所致,PCR-SSCP技术可能成为测定部分结核分枝杆菌EMB耐药基因型,简便、快速的方法.
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汉族人多囊肾病1型致病基因突变检测体系的建立及初步应用
目的建立适合筛查汉族人多囊肾病1型致病基因(PKD1)突变的检测体系.方法利用设计的82对引物[8对针对PKD1 5′端多拷贝区的长链聚合酶链式反应(PCR)引物和57对巢式PCR引物,17对针对3′端单拷贝区PCR引物]分别对PKD1的46个外显子进行扩增,扩增产物通过单链构象多态性(SSCP)分析筛检出异常条带后,再经测序确定基因突变位点.利用建立的PCR-SSCP检测体系对汉族人2个常染色体显性遗传性多囊肾病患者家系进行PKD1突变检测,健康献血员为对照.结果用82对PCR引物,可成功扩增PKD1各个外显子区域,并经测序证实为PKD1目的片段.将建立的SSCP-PCR基因突变检测体系,分别从2个汉族人常染色体显性多囊肾病(ADPKD)家系检测出PKD1基因Del 3 bp(G49761-G49763)和C47629T 2个突变,其可分别导致编码产物第3827位缺失谷氨酸(Glu3827)和第3555位丝氨酸,而产生由苯丙氨酸(S3555F)替代的改变.结论本研究建立的PCR-SSCP检测体系,可完成 PKD1各外显子区域特异性扩增,并成功检测出了汉族人2个ADPKD家系基因突变位点,不仅为PKD1基因突变的致病机理研究提供宝贵资料,而且为下一步汉族人多囊肾病的大规模基因突变筛查和临床诊断试剂盒的研制奠定了基础.
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结核分枝杆菌耐多药的基因研究
目的 探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系。方法 用聚合酶链反应和聚合酶链反应单链构象多态性分析对128株结核分枝杆菌临床分离株耐利福平(rpoB)、链霉素(rpsL)和异烟肼(KatG)基因检测。结果 38株敏感株中，各有1株(2.6%)测出rpoB、rpsL和KatG突变；90株耐多药株中，分别有81株(90.0%)、71株(78.9%)和63株(70.0%)测出rpoB、rpsL和KatG突变；有77株(85.6%)同时测出2种以上耐药基因突变；10株耐其他药物株中，仅有1株测出KatG基因突变。结论 85.6%的耐多药结核分枝杆菌存在2种以上耐药基因突变，且耐药基因突变率与耐药浓度有关。
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检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究
目的建立聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法,并评价其临床应用的价值.方法依据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物,用PCR从临床分离株和直接从痰标本中扩增rpoB基因片段;对扩得的rpoB基因片段做DNA SSCP分析,并随机测定rpoB片段的序列.结果 PCR从所有212株结核分枝杆菌中均扩得230 bp片段,135份抗酸染色阳性的痰标本中,有113份扩得阳性片段(83.7%).在SSCP分析中,140份经L-J药敏试验检测为利福平耐受的结核分枝杆菌,有130份有rpoB基因突变(符合率为92.9%),72份经L-J药敏试验检测为利福平敏感的菌,有67份的rpoB基因无突变(符合率为93.1%).测序分析发现57份经SSCP检测为突变的rpoB片段均有序列改变,10份经SSCP分析为无突变的有8份无序列改变,SSCP与测序结果的符合率为94.0%.在本研究的菌株中,耐多药结核病(MDR-TB)占76.4%(107/140),有92.5%(99/107)耐多药菌株经SSCP检测有rpoB突变.结论建立的PCR-SSCP分析方法,是一种较准确和稳定的检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法,可用于临床快速分析患者结核分枝杆菌对利福平的耐药性,并可作为MDR-TB判断的一个重要指标.
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应用多重PCR-单链构象多态性分析同时检测耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌
目的 探讨应用多重PCR-单链构象多态性分析(multiplexpulymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,multi-PCR-SSCP)方法快速、特异地同时快速检测结核分枝杆菌对异烟肼和利福平耐药性的效能.方法 根据结核分枝杆菌的inhA序列、katG序列、rpoB序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物.采用multi-PCR-SSCP技术,一次性检出耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌.新方法的有效性通过116株临床分离株(70株耐异烟肼,66株耐利福平)的验证.结果 名 Multi-PCR-SSCP方法检测临床分离株基因突变的有效性,以细菌培养和药敏试验结果为金标准.116株临床分离株和H37Rv标准株中除了4株katG缺失突变,其余菌株3个基因katG、inhA和rpoB在单基因PCR中都扩增成功.与H37Rv标准株相比,46株katG基因突变,14株inhA基因突变,58株rpoB基因突变.38株katG和rpoB,4株inhA和rpoB,4株inhA和katG同时突变,还有2株3个基因都有突变.multi-PCR-SSCP对于耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌检出的敏感度分别为80%、82%,特异度分别为100%和92%.结论 multi-PCR-SSCP方法敏感、特异,能同时快速有效地检测耐多药结核分枝杆菌,有望成为临床指导用药的好方法,为深入研究耐药基凶检测奠定了良好的基础.
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X-连锁迟发性脊髓骨骺发育不良家系的基因诊断
目的 探讨一个X-连锁迟发性脊髓骨骺发育不良(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDL)家系发病的分子机制,建立基因诊断方法 .方法 采用身高测量、影像学检查殚及家系分析进行临床诊断.收集相关家系成员的外周血标本.提取基因组DNA后,采用PCR-SSCP和DNA测序分析家系中先证者、携带者和健康人SEDL基因的第3～6外显子.利用微卫星位点DXS16进行连锁分析.结果 PCR-SSCP检测到先证者第4外显子有异常泳动带;第4外显子的序列分析表明3例先证者均存在C.218C＞T突变,导致氨基酸序列S73L改变,3例携带者均存在该核苷酸位点的杂合突变,健康人未见突变;先证者的第3、5和6外显子核酸序列未见突变.序列分析证实家系中3名未婚女性Ⅲ10、Ⅳ6和Ⅳ7为致病基因携带者.结论 C.218C＞T突变是导致该家系发病的分子机制,可采用第4外显子序列分析对该家系进行基因诊断和产前基因诊断.
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应用单链构象多态性和异源双链分析研究拉米夫定耐药变异
目的应用单链构象多态性/异源双链分析技术研究慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗前后乙肝病毒准种组成的改变.方法聚合酶链反应扩增6例患者治疗前后共12份血清标本中目的片段并逐一分析.结果拉米夫定治疗前患者体内乙肝病毒聚合酶基因序列准种组成较复杂,准种数在7～14(平均9.8),均高于治疗后准种数4～8(平均5.7),t=3.98,P＜0.05.6例患者治疗前的准种分布中有一种或两种优势准种,但比例较低(33.3%～81.8%);治疗后显著升高(78.8%～90.9%),t=3.24,P＜0.05.选择优势克隆测序,6例患者经拉米夫定治疗后2例在酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)序列出现M550V/L528M,3例为M550I变异,1例无变异.结论采用单链构象多态性/异源双链分析技术对人体内病毒作整体性的研究,可避免其他研究方法的片面性,为发现新的变异点提供机会,进一步解释拉米夫定的耐药机制.
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单链构象多态性技术在家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白受体基因13外显子点突变筛查中的应用
目的 探讨单链构象多态性(SSCP)技术在家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白受体(LDLR)基因13外显子点突变筛查上的应用价值.方法 以16例临床诊断为家族性高胆固醇血症(FH)患者为研究对象,提取外周血DNA,扩增LDLR基因第13号外显子片段,组合优条件进行SSCP电泳并银染.对异常条带进行DNA序列测定确定其突变性质和位置.结果 优化SSCP电泳条件为:不含甘油8%凝胶,在10℃条件下电泳;含5%甘油的8%凝胶,在常温条件下电泳(交联度均为49:1).凝胶厚度均不超过0.4 mm,电泳电压为5 V/cm,在此条件下进行SSCP电泳均可以得到满意电泳图谱.对发现的异常条带,结合DNA测序证实有4例患者LDLR基因第13外显子分别发生A606T,D601N,Y601D,或G636V错义突变,同时均存在1959碱基C→T同义突变.另外4例患者13外显子仅存在1959碱基C→T同义突变.结论 通过优化各种条件进行的PCR-SSCP银染方法,是高胆固醇血症病LDLR基因13外显子点突变初步筛查的有效手段.
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高分辨熔解方法的建立及在真菌感染患者CYP2C19遗传多态性检测中的应用
目的 探讨高分辨熔解方法 (high resolution melting,HRM)检测真菌感染患者CYP2C19遗传多态性的可行性.方法 建立HRM方法 检测CYP2C19 * 2和CYP2C19 * 3两个多态性位点的基因型,并与传统方法 PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)及序列分析结果 相比较,进一步应用于47例真菌感染患者基因型的检测与分析.结果 2种方法 检测CYP2C19 * 2和CYP2C19* 3基因型结果 完全一致,与DNA序列分析结果 也相吻合,而HRM方法 操作更为简便,耗时更短.47份临床标本检测结果 显示,CYP2C19的2个多态性位点存在不同基因型,CYP2C19 * 1/ * 1所占比例为48.9%(23/47),CYP2C19 * 1/ * 2为25.5%(12/47),CYP2C19 * 1/ * 3为6.4%(3/47),CYP2C19 * 2/ * 2为12.8%(6/47),CYP2C19 * 2/ * 3为6.4%(3/47).结论 HRM方法 能有效检测CYP2C19基因多态性,且较PCR-RFLP方法 更为简便、快速.此外,CYP2C19基因在真菌感染患者中存在明显的遗传多态性.
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聚合酶链反应-单链构象的多态性技术鉴定解脲脲原体生物群和基因型鉴定中的应用
本研究通过对解脲脲原体(UU)的14个标准血清型的聚合酶链反应-单链构象的多态性(PCR-SSCP)电泳分析,直接鉴定UU生物群和基因型.
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多重聚合酶链反应-单链构象多态性分析检测耐异烟肼结核分枝杆菌
目的建立耐异烟肼(isoniazid, INH)结核分枝杆菌多重聚合酶链反应-单链构象多态性分析(multiple-polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism, multi-PCR-SSCP)方法,快速、特异地同时检出aphC启动子、inhA、katG基因的突变情况,用于快速诊断结核分枝杆菌对INH的耐药性.方法根据结核分枝杆菌的aphC启动子序列、inhA序列、katG序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用multi-PCR及SSCP技术,同时检测对结核分枝杆菌耐INH起作用的这3个基因的突变情况.结果对H37 Rv标准株、临床分离INH敏感株(23株)及INH耐药株(35株)分别采用常规PCR和multi-PCR同时进行扩增,两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段,且结果符合率达100%;采用单基因PCR-SSCP,aphC启动子序列突变检出率17%(6/35)、inhA序列突变检出率20%(7/35)、katG序列突变检出率66%(23/35);multi-PCR-SSCP突变检出率83%(29/35). 结论耐药基因检测指导治疗是一种新探索,multi-PCR-SSCP方法敏感、特异,能同时快速有效地检测结核分枝杆菌aphC启动子、inhA、katG 3个INH耐药基因的突变,提高检验效率,有望成为临床指导用药的好方法.
