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噬菌体生物扩增法、DNA序列分析及单链构象多态性分析检测结核分枝杆菌耐药性
目的探讨和评价噬菌体生物扩增技术(phage amplified biologically assay, PhaB)用于检测结核分枝杆菌耐药性的应用价值. 方法本研究共选取了91株利福平(RFP)耐药株(其中82株为耐多药结核分枝杆菌)、42株RFP敏感株、75株氧氟沙星(OFLX)耐药株、40株OFLX敏感株,应用PhaB、DNA序列分析法和聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)3种检测方法,同时对同一菌株应用该3种方法进行耐药性检测,以资分析与评价PhaB法的临床应用价值.结果以绝对浓度法药敏试验结果为标准,检测RFP的药物敏感性,PhaB法的准确性为93%,敏感性为92%,特异性为95%;DNA序列分析法的准确性为93%,敏感性为90%,特异性为100%;PCR-SSCP法的准确性为90%,敏感性为86%,特异性为100%.检测OFLX(OFLX)的药物敏感性,PhaB的准确性为95%,敏感性为95%,特异性为95%;DNA序列分析法的准确性为80%,敏感性为71%,特异性为98%;而PCR-SSCP法的准确性为75%,敏感性为63%,特异性为98%.结论 PhaB法是一种操作简便、快速、敏感、与绝对浓度法符合率高的结核分枝杆菌耐药性检测方法,在48～96 h内可获得试验结果,具有良好的临床应用前景.
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结核分支杆菌异烟肼耐药基因突变微通道电泳检测方法的建立
目的建立一种用微通道电泳芯片分析系统检测结核分支杆菌异烟肼耐药基因突变的方法.方法以丙烯酰胺及其衍生物的聚合物溶液作为筛分介质,溶液中掺入微量的吖啶橙作为荧光标记物,对结核分支杆菌的异烟肼耐药相关的katG和inhA基因进行单链构象多态性(SSCP)分析,检测其与耐药性相关的突变.对于突变部位附近没有二级结构的inhA基因,设计了特别的引物使扩增产物增加一个能与突变部位配对的区域,从而使野生型片段呈现独特的构象. 结果此方法可实现对katG基因野生型片段与315位密码子突变型片段的区分,以及对inhA基因调节序列野生型与突变型片段的区分.30个临床分离株中的23个耐药株有22个被检出,效率达95%. 结论微通道电泳方法用于结核杆菌耐药基因突变检测,具有快速、灵敏的优点,可望将之应用于临床耐药性检测.
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单链构象多态性与核酸杂交联合检测耐氧氟沙星的结核分枝杆菌
目的探讨聚合酶链反应-单链构象多态性分析 (PCR-SSCP)并Southern杂交检测耐氧氟沙星(OFLX)结核分枝杆菌的可行性,并探索结核分枝杆菌对OFLX敏感与耐药的界限.方法(1)体外筛选人工诱变的耐OFLX的耐药突变株,并检测OFLX对这些耐药株的低抑菌浓度(MIC)和低杀菌浓度(MBC).(2)扩增结核分枝杆菌的gyrA基因,包括H37Rv 1株、H37Ra 1株、临床分离的OFLX敏感株10株及人工诱变的耐OFLX H37Rv(17株)、H37Ra(17株)及临床分离菌株(51株)共计85株,并对此扩增产物进行SSCP分析及Southern 杂交,对比观察耐OFLX结核分枝杆菌的核酸单链条带位移的变化.为了验证PCR-SSCP并Southern杂交结果的可重复性,对36株临床分离的耐OFLX菌株的耐药界限进行初步检测.结果经PCR-SSCP及Southern 杂交,85株人工诱变的耐OFLX菌株,全部检测到gyrA基因突变.在OFLX 10 μg/ml这一点上,明显地存在着一个结核分枝杆菌对OFLX敏感与耐药并存的交叉区.对36株临床分离的OFLX耐药菌的PCR-SSCP合并Southern 杂交检测结果显示,对比标准株H37Ra,在临床分离的耐OFLX菌株间观察到了类似的因单链构象变化而引起的单链位移的结果.结论 PCR-SSCP合并Southern 杂交可以清晰地区分对OFLX敏感与耐药的菌株,以10 μg/ml为界作为判别结核分枝杆菌对OFLX是否已经产生耐药的标准是适宜的.
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散发性乳腺癌中BRCA1和BRCA2基因突变的研究
目的 检测BRCA1和BRCA2基因在散发性乳腺癌中的突变情况,探讨BRCA1和BRCA2基因突变与乳腺癌的关系.方法 选取2000年12月至2005年9月收治的144例乳腺癌患者标本作实验组,另取非癌乳腺组织标本30例作对照组.用酚-氯仿抽提法提取DNA.针对各个外显子的碱基序列特征,设计有助于筛查基因碱基突变的聚合酶链反应(PCR)引物.每例DNA标本均用PCR扩增BRCA1基因的全部22个外显子和BRCA2基因的exon10和exon14两个外显子.分别将每例外显子的PCR扩增产物进行单链构象多态性分析,对泳动变位或出现异常区带的PCR扩增产物进行DNA测序.结果 对照组未检测出BRCA1和BRCA2基因突变,实验组中检测出20例BRCA1基因碱基改变,总突变率为13.9%,其中错义突变率为11.1%.BRCA2基因exon10和exon14未检测出突变.结论 BRCA1突变与乳腺癌密切相关,筛查BRCA1基因突变对于中国人群乳腺癌患病风险评估、早期诊断及基因治疗具有重要意义.
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多囊卵巢综合征患者胰岛素受体基因外显子17的多态性研究
目的探讨胰岛素受体基因外显子17与多囊卵巢综合征(PCOS)发病的关系.方法对33例PCOS患者(PCOS组)和28例因单纯输卵管原因或男性不育的不孕妇女(对照组)的胰岛素受体基因外显子17进行PCR扩增、单链构型多态性电泳分析,及等位基因分布频率比较.同时对各基因型患者进行内分泌检测. 结果两组胰岛素受体基因外显子17的1008 bp处,均有T基因型向C基因型(T→C)的突变,均发现了3种基因型,即T/T、C/T、C/C基因型.PCOS组C/C基因型为39%,对照组为11%,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05);PCOS组C/C基因型肥胖患者为47%,非肥胖患者为33%,两者比较,差异无统计学意义(P>0.05).PCOS组合并胰岛素抵抗患者为50%,无合并胰岛素抵抗患者为36%,两者比较,差异无统计学意义(P>0.05).PCOS组患者胰岛素敏感指数,T/T基因型患者为0.038±0.016,C/C基因型患者为0.024±0.010,C/T基因型患者为0.028±0.014,C/T基因型及C/C基因型与T/T基因型患者比较,差异有统计学意义(P<0.05);T/T基因型与C/C基因型患者比较,差异无统计学意义(P>0.05).胰岛素受体β亚基表达及血清黄体生成素、睾酮水平,3种基因型患者比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 PCOS患者胰岛素受体基因外显子17多态性在1008 bp发生T→C的突变频率高于对照组;胰岛素敏感指数下降;外显子17位点突变不影响胰岛素受体β亚基的表达.
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钙黏素6基因在卵巢肿瘤组织中的表达及突变的研究
目的通过研究卵巢肿瘤组织中钙黏素(cadherin) 6基因的表达、突变及其临床意义,以寻找与卵巢肿瘤发生相关的分子水平标志物. 方法应用RT-PCR技术和PCR-单链构象多态性方法分别检测恶性卵巢肿瘤组织(41份)、良性卵巢肿瘤组织(15份)、正常卵巢组织(17份)中cadherin 6 mRNA的表达及cadherin 6基因的突变情况,并分析其临床意义. 结果正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织、恶性卵巢肿瘤组织中cadherin 6 mRNA阳性率分别为71%、53%、24%,前两者显著高于后者( P <0.05).cadherin 6 mRNA阳性率与恶性卵巢肿瘤手术病理分期有关,Ⅲ～Ⅳ期恶性卵巢肿瘤组织中,cadherin 6 mRNA阳性率(5%)显著低于Ⅰ～Ⅱ期(45%, P <0.01).41例恶性卵巢肿瘤患者中,2例出现cadherin 6基因突变,而在正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤组织中无cadherin 6基因突变.结论 cadherin 6 mRNA在晚期恶性卵巢肿瘤组织中表达缺失.提示cadherin 6 mRNA表达可作为判断恶性卵巢肿瘤预后的一个指标.
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沙眼衣原体子宫内感染途径的研究
目的探讨沙眼衣原体子宫内感染的途径.方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)法和DNA测序法,对772例临产孕妇宫颈分泌物标本进行沙眼衣原体检测.对沙眼衣原体检测阳性孕妇,进行宫颈分泌物、羊水、脐血、新生儿眼结膜和鼻咽拭子等标本组成的母婴配对标本的检测;另选择24例沙眼衣原体检测阴性孕妇的母婴配对标本作为对照.结果 (1)772例孕妇宫颈沙眼衣原体检测有87例阳性,阳性率为11.3%.(2)对其中81例宫颈沙眼衣原体阳性的母婴配对标本检测显示,脐血中均未检出沙眼衣原体;新生儿沙眼衣原体阳性30例(羊水、新生儿眼结膜和鼻咽拭子等标本阳性),垂直传播率为37.0%(30/81).(3)新生儿30例阳性中,有26例经阴道分娩,4例经剖宫产分娩.两种分娩方式的垂直传播率比较,差异有极显著性(P<0.01).(4)羊水沙眼衣原体阳性11例,其配对新生儿均受沙眼衣原体感染.PCR-SSCP分析显示,同一组配对标本电泳图谱完全相同;DNA测序结果显示,配对标本沙眼衣原体DNA序列完全一致.(5)宫颈沙眼衣原体阴性孕妇的母婴配对标本均未检测出沙眼衣原体.结论沙眼衣原体经宫颈上行进入羊膜腔是胎儿宫内感染的重要途径;沙眼衣原体经胎盘传播途径未得到证实;剖宫产能显著降低宫颈沙眼衣原体阳性孕妇的垂直传播率.
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应用聚合酶链反应-单链构象多态性技术分析结节性硬化症基因突变
目的检测结节性硬化症基因外显子突变.方法应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术分析28例结节性硬化症患者TSC1和TSC2基因外显子突变情况.结果 28例中有4例发生TSC1基因突变,其中包括1个无义突变、2个错义突变和1个移码突变;有13例患者发生TSC2基因突变,其中包括2个无义突变、2个移码突变、1个缺失和8个错义突变.有2例患者在TSC1及TSC2基因上均发生突变,另有2例患者在TSC2核苷位1960上出现同样突变.TSC1突变患者和TSC2突变患者之间临床表现无明显差异.结论突变广泛分布于TSC1及TSC2基因各个外显子上,没有集聚于某个外显子,基因突变不能反映疾病的临床表现及严重程度.
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用镭射激光捕获技术研究LEC鼠p53基因突变和肝癌发生的关系
目的:研究p53基因突变与原发性肝癌发生发展的关系.方法:利用LEC鼠(long evan cinnamon)作为肝癌的动物模型.选取15、37、101周的LEC鼠17、15和12只,正常对照SD大鼠15只,取出肝脏组织进行切片.切片一部分用于谷胱甘肽S-转移酶(GST-P)免疫组化染色,另一部分利用镭射激光捕获技术(laser capture microdissection, LCM)定位切割,进行p53基因外显子5、6/7、8突变的分析.结果:37周龄LEC鼠和101周龄LEC鼠GST-P阳性率高于对照组(P＜0.05),15周龄LEC鼠GST-P阳性率与对照组相比差异无统计学意义,P＞0.05.p53基因在GST-P表达阳性肝炎组有3例突变(3/12),GST-P表达阳性肝癌组有12例发生突变(12/17), 肝癌组显著高于肝炎组,P＜0.05.结论:p53突变发生在肝癌形成的早期阶段,随着发展过程,突变率明显增高.GST-P虽然特异性不强,但是不失为一种灵敏的判断肝损伤的指标.
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肝硬化及肝癌p53基因突变的实验研究
目的:研究肝硬化及肝癌p53基因的突变情况.方法:选择80例肝硬化、肝癌标本,分别以PCR-SSCP法,双链DNA序列测定法研究其p53基因外显子的突变情况及突变位点.结果:62例肝癌标本p53总突变率为19.4%,其中,早、中、晚期突变率分别为10.5%、15.0%、35.0%;18例肝硬化标本p53总突变率为5.6%;第7外显子的突变发生在249位密码子第3号碱基上,为G:C→T:A的颠换突变;第8外显子的突变发生在273位密码子第1号碱基上,为C:G→T:A的转换突变.结论:p53基因突变发生在肝细胞发生形态学改变之初,随着肝癌的进展逐渐积累,突变率呈上升趋势,故p53基因突变很可能是启动癌变过程的重要因素之一.肿瘤防治杂志,2001,8(4):365-367
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散发性乳腺癌患者BRCA1基因突变分析
目的:探讨BRCA1基因突变在散发性乳腺癌发生和发展中的作用及在乳腺癌临床诊断和治疗中的应用前景.方法:应用PCR-SSCP和直接测序法检测30例散发性乳腺癌和15例正常乳腺组织中BRCA1基因外显子2、11和20的突变情况.结果:15例正常乳腺组织在3个外显子上部未显示电泳异常,30例乳腺癌中有6例在外显子2上显示电泳条带异常,其中4倒经测序证实有突变,1例在外显子2上,3例在内含子拼接区.BRCA1基因突变率在初诊年龄、临床分期和肿瘤体积上差异无统计学意义,但与肿瘤转移密切相关.结论:BRCA1基因突变与散发性乳腺癌的发生和发展密切相关,该基因突变筛查可作为一种预后指标.
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被动吸烟对大鼠肺组织转化生长因子β1表达和p53基因突变的影响
目的 研究被动吸烟对肺组织转化生长因子β1(TGF-β1)和p53表达和p53突变的影响.方法 用Wistar大鼠建立被动吸烟动物模型.免疫组织化学SP法检测TGF-β1和p53在肺组织中的表达,反转录-聚合酶链反应( RT-PCR)观察TGF-β1mRNA在肺组织中的表达.PCR-单链构象多态性分析p53基因第5、6、7-8外显子突变情况.结果 TGF-β1在正常肺组织中有少量表达,随着被动吸烟月份的增加,TGF-β1表达明显增多,每月间比较差异具有统计学意义(P＜0.05).p53阳性表达率均随被动吸烟时间的延长而升高(P＜0.05).p53基因第5、6、7-8外显子均有突变,随被动吸烟时间延长,突变率增高.结论 TGF-β1和p53表达和p53突变均随被动吸烟时间延长而增高,可作为肺癌诊断的参照指标.
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结节性硬化症TSC1基因编码外显子全长的突变检测与分析
目的研究结节性硬化症(TSC)TSC1基因所有编码外显子的基因突变特征和多态现象.方法采用聚合酶链反应-单链构象多态(PCR-SSCP)技术结合DNA测序对来源于21个家系的23例TSC患者、22名父母及60名健康对照进行TSC1基因编码外显子全长的基因突变和多态的检测.结果共检测出10种异常的SSCP带型,经DNA测序后证实为4种突变和6种多态,突变包括2种移码突变(352insA和2332insT)、1种剪接突变(729+1G→T)、1种无义突变Tyr761Ter (2504C→A),其中2332insT,729+1G→T及Tyr761Ter为新型突变.以上突变均见于散发型患者,突变频率为4/15.6种多态包括4种单核苷酸多态(347A→C,1186T→C,1556A→G,1947T→C),1种内含子区多态(2218+71delAG)及1种3'UTR区多态(3716+36T→C),其中3种为新多态.结论本组结果对研究我国TSC1基因突变特征提供了重要资料,未发现TSC1基因突变热区,且TSC1基因突变多见于散发型患者,提示中西方TSC1基因突变可能存在差异.
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喉鳞癌p53基因第7外显子的测序分析
目的探讨p53基因与喉鳞状细胞癌的关系。方法应用聚合酶链反应-单链构像多态性分析（polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）银染系统和PCR产物直接测序技术，检测喉鳞状细胞癌新鲜或冰冻组织中抑癌基因p53第7外显子的突变情况。结果 60例喉鳞状细胞癌组织中使用SSCP检测发现25例显示电泳迁移率的改变。对25例SSCP阳性样本随机抽出8例进行PCR产物直接测序，8例第7外显子均在250密码子上第1、3位碱基缺失一个C。同时，2例在248密码子上第1位碱基缺失一个C，从而导致移码突变；3例在261密码子上第1、3位碱基发生A→G的转换和T→G的颠换,导致错义突变。1例在249密码子上缺失一个G，1例存在254密码子上第1位碱基A→T的颠换,1例262密码子上GGT→TCA。结论提示p53基因第7外显子的248、250和261位密码子可能在中国人喉鳞状细胞癌中突变率较高。
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喉鳞状细胞癌蛋白酪氨酸磷酸酶基因第5和第8外显子的突变分析
目的探讨蛋白酪氨酸磷酸酶(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10/mutated in multiple advanced cancer1/ TGF-β regulated and epithelial cell-enriched phosphatase,PTEN/MMAC1/TEP1,以下简称PTEN)基因突变与喉鳞状细胞癌(简称鳞癌)的关系. 方法应用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)分析银染系统和PCR产物直接测序技术,检测喉鳞癌新鲜或冰冻组织中PTEN基因第5、第8外显子的突变情况,对有电泳迁移率改变的进行PCR产物测序. 结果第5、第8外显子的突变均发生在声门上型喉癌,声门型喉癌未发现突变.其中,第5外显子有6例发生突变,突变率15%(6/40).直接测序发现2例在85密码子第2、3碱基子之间发生了插入A突变,即TT→TAT,2例86密码子第3碱基缺失一个A,从而导致移码突变;1例同时存在以上两种突变,导致错义突变;1例85密码子第2、3碱基之间插入A,同时86密码子第2碱基缺失,即GCA→GA导致无义突变.这6例中有低分化3例,中分化3例,无高分化;淋巴结转移5例占83.3%(5/6),无淋巴结转移1例,占16.7%(1/6).第8外显子仅有1例发生突变,突变率为2.5%(1/40),直接测序发现276密码子第2碱基A缺失,即AAT→AT;336密码子与337密码子之间插入l个C,该病例虽无淋巴结转移,但病理为低分化. 结论 PTEN基因第5外显子中85、86密码子在人喉鳞状细胞癌中突变率较高,该基因突变可能与喉鳞癌淋巴结转移及病理中、低分化有关.
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中国Y连锁遗传性聋DFNY1家系POU3F4基因突变的检测
目的进行Y连锁遗传性聋(Y-linked hereditary hearing impairment)家系的候选基因--POU3F4基因的突变分析.方法在POU3F4基因的全部编码序列设计5对引物进行聚合酶链反应 (polymerase chain reaction,PCR)扩增反应.应用PCR-单链构像多态性(single-strand conformation polymorphism SSCP)方法对DFNY1家系中的43名成员进行突变检测及鉴定.结果POU3F4基因的5对引物均有较好的扩增效果,PCR-SSCP的多态性分析显示所有家系成员在POU3F4基因中均未检测到多态及突变. 结论本研究通过对一个位于X染色体与Y染色体存在同源交换区域的耳聋基因POU3F4基因的检测排除了该基因易位到Y染色体导致DFNY1家系耳聋的可能性,说明中国Y连锁遗传性聋家系的致病基因更多可能是位于Y染色体上的基因突变所致.
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重庆地区开角型青光眼患者及其亲属和正常人群中小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白基因突变的研究
目的研究开角型青光眼患者及其亲属和正常人群中小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白(TIGR)基因突变的情况.方法 (1)应用聚合酶链反应(PCR)方法,对15例开角型青光眼患者及其10例一级亲属和20例正常对照者的TIGR基因的3个外显子、部分内含子及部分启动子(7对引物)的各个片段进行扩增,应用单链空间构象多态(SSCP)分析法,筛选可能存在突变的PCR产物.(2)将筛选出的PCR产物交上海基康公司测序.(3)对突变片段行生物信息学分析.结果 (1)在重庆地区15例原发性开角型青光眼患者中,共发现TIGR基因突变者5例,其中青少年型青光眼4例;在10例青光眼患者亲属中发现TIGR基因突变者2例;正常对照者20例中未发现TIGR基因突变.(2) PCR产物测序共发现4个序列改变,其中编码区2个,非编码区2个.编码区的2个突变位点(Ser55Thr、Asp247Stop)及第二内含子区bp35c→t的突变,均未见文献报道;而在启动子区域bp-83c→t的突变有文献报道为1个多态位点.(3)生物信息学分析结果显示编码区的突变可导致氨基酸序列、蛋白质的二级结构及等电点、抗原结合位点等发生改变.结论 TIGR基因突变与青少年开角型青光眼的发生密切相关,由此可推测青光眼患者的亲属发病率较正常人高.TIGR基因突变可引起TIGR蛋白结构及理化特性的变化,这些改变可能是引发开角型青光眼的危险因素之一.
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绞股蓝影响白斑癌变过程中Ha-ras基因突变的实验研究
目的 观察绞股蓝对白斑癌变过程中Ha-ras癌基因突变的影响,从分子水平探讨绞股蓝防癌、抑癌的机理,并对Ha-ras基因与白斑癌变动态变化过程的关系进行研究.方法 采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析法,检测经绞股蓝总甙、甙元、C20-OH皂甙等处理的金地鼠颊囊白斑癌变模型标本,观察 Ha-ras基因含第61位密码子突变的阳性信号.结果 白斑癌变模型组突变率达 22.96%,绞股蓝处理组平均为7.59%;绞股蓝各组抗突变率效佳依次为C20-OH组、总甙组、甙元组,其突变率分别为5.32%、6.25%、11.00%;DMBA诱导癌变4～8周时白斑模型组突变率为11.10%～40.00%,绞股蓝处理组为0～10.70%.结论 绞股蓝具有显著的抗癌基因突变功效,其有效成分与C20带游离羟基有关.Ha-ras基因突变在白斑癌变中起重要作用.
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用分子生物学技术快速检测耐多药结核分枝杆菌
目的:用PCR-SSCP技术检测耐INH、RFP、SM结核分枝杆菌分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变,评价其在快速检测结核分枝杆菌耐药性方面的临床价值.方法:以结核分枝杆菌H37RV为对照,20株耐多药菌株和20株敏感株,分别用PCR-SSCP方法检测KatG、rpoB、rpsL基因突变,并将SSCP结果与药敏试验结果作对照分析.结果:PCR-SSCP方法检测20株敏感株SSCP带谱均与H37RV标准株相同,而20株耐多药结核分枝杆菌KatG、rpoB、rpsL基因突变的阳性率分别为70%,100%和75%.发现20株耐多药菌株中有11株(55%)共INH、RFP、SM 3种耐药遗传标志均发生突变,7株(35%)有2种耐药遗传标志突变,2株(1 0%)只有RFP耐药标志突变.结论:PCR-SSCP方法敏感、特异,可快速检测结核分枝杆菌KatG、rpoB、rpsL耐药基因突变,有利于耐多药结核分枝杆菌耐药性的快速检测.
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肿瘤抑癌基因PTEN在骨及软组织肿瘤中的突变
目的探讨肿瘤抑癌基因PTEN在骨及软组织肿瘤发生中的作用。方法应用聚合酶链反应（PCR）分析骨及软组织肿瘤患者110例肿瘤标本，3个肿瘤细胞系PTEN基因第4～9外显子有无纯合性缺失。应用单链构象多态性分析（SSCP）及基因测序技术观察有无基因突变。对照为瘤旁正常组织。结果 PTEN基因第4～9外显子经扩增后均有产物，无基因纯合性缺失改变。SSCP分析未发现变异带，无基因突变。但外显子8表现出两种不同带型，该基因存在多态性，6例肿瘤在内含子8距拼接部32 bp处存在两种不同碱基，基因型为g/t。结论在DNA水平肿瘤抑癌基因PTEN在骨及软组织肿瘤的发生中不起作用；该基因在国人中存在多态性。
