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沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位基因的免疫原性研究
目的 构建包含沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(major outermembrsne protein,MOMP)多表位基因的真核表达质粒PcDNA3.1-Ct MOMP168,检测其诱导BALB/c小鼠产生Ct MOMP特异性体液和细胞免疫反应的水平.方法 构建包含Ct MOMP多表位基因的重组质粒PcDNA3.1-Ct MOMP168并以肌肉注射方式免疫BALB/c小鼠,同时设置pcDNA3.1组和PBS组对照(每组12只,每只100μg/次).采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、乳酸脱氢酶释放法及细胞内细胞因子染色-流式细胞术(ICS-FACS)分别检测免疫小鼠血清中Ct MOMP特异性抗体的滴度及其抗体亚型、脾脏中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性及特异性分泌细胞因子,如γ-干扰素-(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)等的CD3+T细胞的水平.结果 同pcDNA3.1(A490=0.180±0.025)和PBS免疫(A490=0.110±0.015)相比,PcDNA3.1-Ct MOMP168免疫可刺激小鼠产生高效价Ct特异性IgG抗体(A490=0.973±0.136;血清滴度1:1000),且抗体亚型以IgG2a为主,差异有统计学意义(F=106.884,P<0.05);pcDNA3.1-Ct MOMP168免疫组小鼠脾细胞中CTL杀伤活性(41.71%±8.34%)高于pcDNA3.1组(18.40%±3.45%)和PBS组(14.50%±2.42%),差异有统计学意义(F=22.315,P<0.05;效靶比为50:1);pcDNA3.1-Ct MOMP168免疫组小鼠的脾细胞中Ct MOMP特异性CD3+IFN-γ+T细胞的水平(1.15%±0.16%)高于pcDNA3.1组(0.12%±0.08%)和PBS组(0.09%±0.03%),差异有统计学意义(F=99.638,P<0.05),而PcDNA3.1-CtMOMP168组IL-4+CD3+T细胞(0.13%±0.08%)和IL-10+CD3+T细胞(0.14%±0.08%)的水平与pcDNA3.1(0.07%±0.05%,0.13%±0.06%)和PBS(0.08%±0.04%,0.07%±0.04%)组比较差异无统计学意义(F值分别为0.886、1.112,P值均>0.05).结论pcDNA3.1-Ct MOMP168重组质粒能诱导BALB/c小鼠产生Ct MOMP特异性的体液免疫和细胞免疫应答.
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中国98株布鲁杆菌OMP25基因高度保守
目的 分析布鲁杆菌毒力相关基因OMP25(编码外膜蛋白OMP25)在中国布鲁杆菌中的多态性分布,为研究致病机制,预防和控制大规模暴发布鲁菌病的流行病学研究提供理论基础.方法 利用聚合酶链反应单链构象多态(single-strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)方法检测116株布鲁杆菌(18株标准菌株和中国98株野生菌株)OMP25基因,取不同带型菌株的OMP25基因进行测序.结果 116株布鲁杆菌呈现8种不同图谱(1～8型),其中2型和7型是个别中国野生株所特有.8种带型仅有10个不同碱基在对应类型中发生变异,对编码蛋白氨基酸的改变不多.中国98株布鲁杆菌的OMP25基因高度保守,具有比较稳定的抗原特征.结论 高度保守性有助于布鲁杆菌的流行病学检测,为研制更安全有效的疫苗提供了理论依据.
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江西省脑膜炎奈瑟菌分离株分子分型和菌群结构分析
目的 分析江西省脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis,Nm)分离株的分子分型和菌群结构.方法 选取于1976-1987年和2005-2008年在江西省分离自患者、密切接触者和健康人群的123株Nm菌株作为研究对象.采用多位点序列分型(MLST)、外膜蛋白编码基因proA PCR扩增并测序等方法,检测Nm基因型特征及porA的序列特征.使用BioNumerics软件构建小生成树,分析菌株菌群结构.结果 1976-1987年分离67株Nm菌,血清群分布为A群(43株)、B群(18株)、C群(1株)和W135群(5株)；2005-2008年分离56株Nm菌,血清群分布为A群(3株)、B群(7株)、C群(45株)和不可分群(1株).123株Nm菌株分为40个序列(ST)型,46株A群菌株分为14个ST型,以ST-3型为优势型别,共29株菌,占A群菌株的63.0％(29/46),分离于1976年至1987年,分离自患者(14株)、密切接触者(9株)、健康人群(6株)；46株C群菌株分为5个ST型,以ST-4821为优势型别,共41株,占89.1％(41/46),分离于2005年至2008年,分离自患者(6株)、密切接触者(6株)、健康人群(29株).123株Nm菌株的porA基因分属于32个不同的型别,包含了24个不同VR1型和22个VR2型.1976-1987年的流行菌株为ST-3型A群Nm,PorA分型为P1.7-1,10,为优势型别,菌株数为18株,占A群Nm的39.1％ (18/46),分离自患者(11株)、密切接触者(4株)、健康人群(3株)；2005-2008年的流行菌株为ST-4821型C群Nm,PorA分型2005年以P1.20,9为主,共19株,占ST-4821型C群Nm流行菌株的46.3％(19/41),分离自密切接触者(1株)、健康人群(18株)；2006年开始以P1.7-2,14型为主,共22株,占ST-4821型C群Nm流行菌株53.7％(22/41),分离自患者(6株)、密切接触者(5株)、健康人群(11株)；B群菌株不存在优势序列群,呈多型性特点；W135群菌株5株均为ST-174序列群,PorA分型为P1.21,16,分离于1979年至1980年,分离自密切接触者(3株)、健康人群(2株).结论 江西省Nm分离株具有基因多态性,同时也存在优势克隆群,在不同时期存在不同的流行克隆；流行克隆已由A:ST-3:P1.7-1,10变迁为C:ST-4821:P1.7-2,14.
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淋病奈瑟菌主要外膜蛋白DNA疫苗的构建及免疫效果观察
目的 克隆淋病奈瑟菌孔蛋白IB型(PIB)基因并构建其真核表达载体pCI-PIB,了解pCI-PIB免疫接种后诱导小鼠特异性体液和细胞免疫反应的效果.方法 采用聚合酶联反应(PCR)扩增淋病奈瑟菌主要外膜蛋白PIB全长基因片段(960 bp),构建表达PIB的真核表达载体pCI-PIB.pCI-PIB肌内注射免疫BALB/c小鼠65只,100μg/次/只,亲和素-生物素-过氧化酶复合物(ABC)法检测其中10只pCI-PIB免疫小鼠肌细胞中PIB的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)和特异性淋巴细胞增殖反应(MTT)法检测余下pCI-PIB免疫小鼠的特异性体液和细胞免疫应答效果.采用玻片凝集试验和补体溶菌试验检测pCI-PIB免疫小鼠血清的抗菌活性.结果 PCR可扩增出预期大小的全长PIB基因片段(960 bp),与报道PIB基因序列(GenBank No:AF090801)比较,重组质粒pCI-PIB中目的 插入片段的核苷酸序列同源性可达99.28%.免疫小鼠的肌细胞能摄取pCI-PIB并表达PIB.pCI-PIB免疫小鼠的血清中可产生较高效价的特异性IgG(1:4000),并产生特异性T细胞增殖反应,增殖指数(4.031)明显高于对照组(1.127)(t=71.71,P＜0.05).pCI-PIB免疫小鼠血清及阴道冲洗液均有凝集淋病奈瑟菌的作用,在补体参与下可杀灭细菌.结论 本研究成功地构建了淋病奈瑟菌PIB基因重组真核表达载体pCI-PIB.pCI-PIB接种小鼠后可有效地引起特异性体液和细胞免疫反应,具有作为淋病奈瑟菌候选DNA疫苗的应用前景.
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中国钩端螺旋体强毒株017膜蛋白基因的质粒载体构建及表达
目的 构建表达我国钩体强毒赖型017株外膜蛋白的重组质粒.方法 用PCR方法扩增并回收017株钩体外膜蛋白基因片段OmpL1,将其与质粒pBK-CMV重组,通过菌落颜色和酶谱分析筛选出重组质粒.然后从该重组质粒切下OmpL1基因片段,重新克隆至质粒pBV220中,酶谱分析和DNA杂交鉴定出正向重组质粒.将含有正向重组质粒的宿主菌诱导表达生长后,提取全菌总蛋白进行SDS-PAGE分析.结果 筛选出4个与pBV220正向重组的质粒,其中一株带重组质粒pBLM1的菌株表达了一相对分子质量为33.5×103的新蛋白.结论 重组质粒pBLM1的构建和表达成功说明扩增得的OmpL1基因具有完整的阅读框架,并使简便获得大量天然的017株钩体OmpL1蛋白成为可能,为新型钩体疫苗的研究奠定了基础.
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钩端螺旋体疏水外膜蛋白(OmpL39)对豚鼠免疫功能影响的研究
目的 研究钩体蛋白抗原的免疫保护力及其机制.检定纯化的强毒017钩体相对分子质量为39×103的疏水外膜蛋白(OmpL39)对豚鼠的免疫保护力.对免疫应答期豚鼠红细胞免疫功能的变化进行观察,以期对钩体基因疫苗的研制提供依据.方法 用TX-114抽提钩体的不同蛋白成分,分三批对36只豚鼠进行免疫保护力试验,检测红细胞免疫功能RBC-C3b RR、RBC-ICR、RFER、RFIR的变化;用χ2检验、t检验处理数据,进行分析.结果 OmpL39 在豚鼠体内能产生高效价的显凝抗体 (MAT:1:3200).RBC-C3b RR、RBC-ICR均明显升高(P＜0.05); 红细胞免疫粘附因子促进率(RFER)上升,抑制率(RFIR)下降,两者比值显著增大(P＜0.05).结论 OmpL39对豚鼠有有效的免疫保护力,在免疫应答期除增强体液免疫外,在提高红细胞免疫功能方面也起到了积极的作用.
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阴沟肠杆菌外膜蛋白缺失与头孢西丁耐药的关系
目的了解阴沟肠杆菌外膜上的外膜蛋白与头孢西丁耐药的关系.方法参照美国临床实验室标准化委员会 M100-S9文件的确认试验测定超广谱β内酰胺酶(ESBLs);超声破碎法提取ESBLs和外膜蛋白(OMP),紫外分光光度法测定ESBLs活性,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析OMP的成分.结果头孢西丁耐药的9株阴沟肠杆菌菌株中,有6株菌株缺少分子量为18 000蛋白区带,不产生头孢西丁水解酶,其中有5株产生ESBLs;2株菌株有18 000蛋白区带,产生头孢西丁水解酶;1株菌株不缺少外膜蛋白,产生ESBLs,但不产生头孢西丁水解酶.对头孢西丁敏感的产ESBLs菌株,不产生头孢西丁水解酶,也不缺少外膜蛋白.结论 18 000外膜蛋白缺失与阴沟肠杆菌对头孢西丁耐药有密切关系.
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碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌耐药机制研究
目的 探讨碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)的耐药机制,建立获得性碳青霉烯酶流行监测体系.方法 收集华中科技大学同济医学院附属同济医院2007年1月至2010年6月临床分离非重复肠杆菌科细菌5604株,其中美罗培南抑菌环直径≤21 mm的肠杆菌科细菌100株.药物敏感性试验筛选出碳青霉烯类耐药菌株,采用聚合酶链反应(PCR)对碳青霉烯酶基因和基因附属结构进行分析；采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和Southern印迹杂交方法分析耐药菌质粒；采用多位点序列分型(MLST)方法对菌株进行分型及分析同源性；采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)方法对菌株的外膜孔道蛋白进行分析.结果 共检出CRE 11株,其中克雷伯菌属细菌7株.抗菌药物敏感性试验显示所有菌株对大多数抗菌药物耐药,低抑菌浓度美罗培南8～ 64 mg/L,亚胺培南4 ～ 64 mg/L,厄他培南4～64 mg/L,对氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗菌药物的敏感性则变化较大.PCR检出 IMP-4阳性菌株6株,KPC-2阳性菌株3株,其中1株ST476型肺炎克雷伯菌同时携带blaIMP-4和blaKPC-2.对基因附属结构进行分析,结果显示blaKpC-2基因位于由Tn3转座子和Tn4401部分片段构成转座子上.PFGE显示大多数CRE含有3个或3个以上质粒.MLST分型发现2株肺炎克雷伯菌同属于ST476型.SDS-PAGE提示1株产酸克雷伯菌(Kox656)存在外膜孔道蛋白(OmpK35和OmpK36)双缺失.结论 本院CRE主要是肺炎克雷伯菌,产生碳青霉烯酶是细菌耐药的主要原因,IMP-4是其主要酶型.碳青霉烯酶基因的出现和传播对治疗和感染控制造成巨大威胁,应重视医院细菌耐药性特点及耐药菌感染的临床流行病学资料,从而为临床合理用药提供参考.
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四株临床分离百日咳鲍特菌主要抗原基因序列分析
目的 了解石家庄地区分离的百日咳鲍特菌4种抗原基因百日咳毒素S1亚单位(ptxS1)、外膜蛋白(Prn)、凝集素2(Fim2)和凝集素3(Fim3)的基因特征.方法 收集4株临床分离的百日咳鲍特菌,这4株菌于2002年分离自河北石家庄地区.分别对这4株茵的ptxS1、Prn、Fim2、Fim3主要抗原基因进行PCR扩增和测序,并与我国的百日咳鲍特菌疫苗生产株抗原基因序列以及GenBank中收录的百日咳基因序列进行比较、分析.结果 序列分析显示,新近分离的4株菌的S1基因亚型与我国疫苗生产菌株不同,均为A亚型,发现3种Prn基因亚型和3种Fim3基因亚型,核苷酸和氨基酸序列与我国疫苗生产菌株同源性均在99%以上.基因进化树显示与其他菌株的同源性也较高.结论 我国的临床分离菌株与疫苗生产菌株的主要抗原基因序列存在一定变异,为百日咳的流行病学研究和疫苗的研制积累理论依据.
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幽门螺杆菌动力在胃黏膜定植中的机制研究
幽门螺杆菌能在人类的胃定植并且在胃内存活数十年甚至一生,幽门螺杆菌有很多潜在的致病因子使其定植在胃的特殊环境中.动力是必须的定植因子,依据于幽门螺杆菌无动力突变株不能感染无菌乳猪,动力不能作为定植因子是因为在活体胃腔内幽门螺杆菌的动力很快失去,幽门螺杆菌动力的作用尚未清楚.本文的目的 是探讨对定植与幽门螺杆菌动力之间的关系.
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人苍白杆菌分离株部分生物学性状的研究
目的对本院分离鉴定的1株人苍白杆菌进行16s rRNA基因序列分析以及脂多糖内毒素活性和外膜蛋白免疫性的初步研究.方法采用自行设计的引物对菌株做PCR扩增和16s rRNA基因序列测定;用酚水法提取脂多糖作相关生物学活性试验;提取外膜蛋白组分免疫动物,观察其对羊布氏杆菌是否有交叉保护作用.结果本院分离的人苍白杆菌与购自美国苍白杆菌ATCC菌株和购自北京的羊布氏杆菌之间核苷酸序列具有高度同源性(﹥98%);人苍白杆菌脂多糖具有内毒素生物学活性,但较大肠埃希菌脂多糖为弱;以人苍白杆菌外膜蛋白免疫小鼠不能抵御布氏杆菌的攻击.结论我院分离的人苍白杆菌在遗传学上与羊布氏杆菌具有非常密切的亲缘关系,但其外膜蛋白组分对羊布氏杆菌无交叉保护作用.人苍白杆菌脂多糖具有内毒素的活性,可能是一种重要的致病因子,但其毒性低于大肠埃希菌脂多糖.
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沙眼衣原体外膜蛋白2重组蛋白的表达纯化和免疫性鉴定
目的 表达沙眼衣原体外膜蛋白2,纯化表达产物,并对其免疫性进行鉴定.方法应用聚合酶链反应(PCR)技术获得沙眼衣原体D型外膜蛋白2第167～434位氨基酸的编码基因片段,将此片段克隆于表达载体pET28b(+),转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE、蛋白印迹试验分析表达产物,亲和层析法纯化重组蛋白;重组蛋白免疫家兔以检测其免疫原性.结果重组质粒酶切分析及DNA测序证实成功构建pET28b(+)/Omp2aa167～aa434表达质粒;通过优化表达和纯化条件,获得了相对分子质量约为35.0×103纯化蛋白产物,蛋白印迹试验证实该重组蛋白能与Ct 感染者阳性血清反应;ELISA法测定免疫血清特异性抗体效价在1:1 280以上.结论表达的重组外膜蛋白2aa167～aa434具有良好的免疫性.
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阴沟肠杆菌外膜孔蛋白基因缺失合并β-内酰胺酶和Ⅰ类整合子所致多重耐药性分析
目的 了解临床分离阴沟肠杆菌膜孔蛋白基因缺失合并β-内酰胺酶和Ⅰ类整合子所致耐药的特点及其分布.方法 收集2008年1月至2011年5月自临床感染患者分离的112株阴沟肠杆菌.应用Vitek-2 Compact鉴定细菌,K-B法进行药敏试验,改良Hodge试验、美罗培南改良三维实验和EDTA-美罗培南纸片协同试验筛选产碳青霉烯酶菌株.多重PCR分别检测4种ESBLs基因、6种AmpC酶基因、4种碳青霉烯酶基因及4组OXA-like基因,单一PCR检测ISEcpl、OmpK35/36、NDM-1、OXA-48,并对Ⅰ类整合子可变区进行PCR扩增及序列分析.结果 6株(5.4％)改良Hodge试验阳性,14株(12.5％)美罗培南改良三维试验阳性,未检出碳青霉烯酶基因.29株(25.9％)ESBLs基因阳性,其中,CTX-M基因上游均检测到ISEcpl,并检测到2株产OXA-1型ESBLs阴沟肠杆菌.AmpC酶基因阳性45株(40.2％),以MIR-3型为主(37/45,82.2％).共检出22株Ⅰ类整合子基因阳性菌株,其中16株可变区扩增阳性.扩增出4种耐药基因盒,aadB-aadA2(1 000 bp)9株,dfrA 15 (700 bp)5株,aadAl(1 000 bp)2株,有l株菌同时携带4种耐药基因盒.所有菌株均合并有膜孔蛋白OmpK35和/或OmpK36基因缺失,并呈现多重耐药.结论 阴沟肠杆菌对碳青霉烯类抗生素的敏感性降低主要与其高产AmpC酶、ESBLs并存在膜孔蛋白OmpK35和/或OmpK36基因缺失有关,且Ⅰ类整合子参与阴沟肠杆菌的多重耐药.
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不同耐药性鲍曼不动杆菌分泌的外膜泡毒力比较
目的：比较不同耐药性鲍曼不动杆菌分泌的外膜泡（ OMVs）的毒力。方法提取、纯化4株不同耐药性鲍曼不动杆菌（菌株33、3237、B29和10）分泌的OMVs，BCA法定量后，使用不同浓度的OMVs刺激RAW264．7细胞24 h，CCK-8试剂检测OMVs的细胞毒性，q-PCR法检测细胞因子，包括肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、IL-1β、角化细胞源性生长因子（KC）和巨噬细胞炎性蛋白2（MIP-2）的表达，并采用单因素方差分析进行统计学比较。结果药敏试验结果显示，菌株10为泛耐药鲍曼不动杆菌（XDRAB），菌株B29为多重耐药鲍曼不动杆菌（MDRAB），而菌株33和3237为非MDRAB。将不同浓度OMVs与RAW264．7细胞共孵育24 h后，细胞存活率随着OMVs浓度增加而降低。其中，菌株10、B29、3237产生的OMVs在5μg／mL时可引起明显的细胞死亡，而菌株33产生的OMVs毒力明显低于其他菌株，在25μg／mL时细胞存活率仍未见明显降低。4株鲍曼不动杆菌分泌的OMVs均能刺激RAW264．7细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、KC和MIP-2，且随着OMVs浓度增加，细胞因子的表达水平也增加。菌株33分泌的OMVs促炎能力低，菌株10分泌的OMVs促炎能力高，且在5μg／mL时，菌株10产生的OMVs促进KC、MIP-2表达的能力急剧上升，明显高于其他菌株（F＝19．094和19．032，P＜0．05或＜0．01）。结论不同耐药性鲍曼不动杆菌分泌的OMVs毒力各不相同，其中泛耐药和多重耐药菌株分泌的OMVs具有较强的细胞毒力以及促炎能力。
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裂解酶片段长度多态性分析在母婴垂直传播沙眼衣原体主要外膜蛋白基因分型中的应用
目的建立沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白基因(omp1)上游引物5′末端地高辛标记裂解酶片段长度多态性(CFLP)分型方法;了解重庆地区近年来临产孕妇Ct感染和母婴垂直传播状况及常见基因型.方法取临产孕妇宫颈刮片及其新生儿鼻咽拭子组成母婴配对标本300对605份,采用Ct omp1套式聚合酶链反应(omp1-nPCR)检测Ct;用建立的CFLP方法对临床Ct分离株进行分型.结果孕妇宫颈Ct检出率11%(33/300),母婴传播率24.2%(8/33).生后24 h内和5～10 d采集Ct阳性母亲所生新生儿鼻咽拭子标本Ct检出率分别为3.0%(1/33)和38.9%(7/18),χc2=8.79,P<0.01.剖宫产和阴道分娩母婴传播率分别为8.3%(2/24)和66.7%(6/9),χc2=9.16,P<0.01.Ct阳性和阴性孕妇胎膜早破发生率分别为30.3%(10/33)和13.5%(36/267),χ2=6.40,P<0.05.8对Ct阳性母婴配对标本CFLP图谱呈4类,经测序证实分别为E、F、H、D型(各3、2、2、1对),各占37.5%、25.0%、25.0%和 12.5%,且每对母子CFLP图谱完全一致.结论本研究结果在一定意义上反映了重庆地区近年来临产孕妇Ct感染和母婴垂直传播状况及常见基因型;上游引物5′末端地高辛标记Ct omp1 CFLP分型方法灵敏度高、重复性好、操作简便、快速、花费相对低廉,没有放射污染,是一种极具潜力的Ct分型方法.
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甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白质组学参考图谱的建立
目的 建立甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白的蛋白质组学参考图谱.方法 甲型副伤寒沙门菌CMCC 50973培养至对数生长末期,收集菌体并破碎提取细菌的外膜蛋白,然后利用双向电泳(2-DE)将蛋白分离.分离后取蛋白点做MALDI-TOF-MS鉴定,根据质谱得到的肽指纹图谱在Mascot数据库中查询出匹配的蛋白.结果 在2-DE考马斯亮蓝染色凝胶上取77个蛋白点,鉴定成功了54个点,对应29种蛋白.29种蛋白中定位于外膜为13种,定位未知的有11种,胞质中有5种.结论 成功建立了甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白的蛋白质组学参考图谱,为进一步筛选疫苗抗原打下了基础.
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人幽门螺杆菌26 000外膜蛋白与热休克蛋白双价疫苗的构建和表达及抗原性研究
目的构建含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)和26 000外膜蛋白(OMP)编码基因的重组载体,进行核苷酸序列分析,并在大肠杆菌BL21中表达,研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础.方法利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中,扩增HspA编码基因片段,将目的基因HspA与载体pET32a(+)经kpnⅠ、BamH I 双酶切后,进行连接、测序;同时将重组载体pET32a(+)/HspA和pET32a(+)/Omp26分别经Hind Ⅲ、BamH I 双酶切, 通过凝胶电泳回收pET32a(+)/HspA和26 000 OMP DNA片段,经T4连接酶将HspA和26 000 OMP编码基因通过酶切粘端进行连接,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体,并在大肠杆菌BL21(DE30)中表达,表达产物经纯化后,以western 印迹法检测其抗原性.结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp HspA和26 000外膜蛋白编码基因,由951bp组成,与GenBank报道的相比较,有1.15%的bp发生变异,1.26%的氨基酸残基改变;经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白相对分子质量(Mr)为59×103 ,其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为20×103,可溶性表达产物占全菌总蛋白的19.96 %;重组蛋白经含Ni2+琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上;western 印迹法检测显示,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清及抗26 000 OMP单克隆抗体所识别,具有良好的抗原性.结论成功地克隆并融合表达了Hp HspA和26 000 OMP,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的基础.
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外排泵高表达和外膜蛋白缺失在铜绿假单胞菌对碳青霉烯耐药中的作用
目的探讨铜绿假单胞菌(PA)外科监护室(SICU)分离株对碳青霉烯的耐药机制.方法用Western 印迹和逆转录PCR测定外膜蛋白OprD、OprN表达水平和基因mexA的mRNA水平;用PCR扩增IMP、VIM金属酶基因和主动外排系统MexAB-OprM调控基因mexR,并测序.结果从SICU分离的49株PA,42株对碳青霉烯耐药,其OprD表达除PA42外均有不同程度的降低或缺失,而正常表达OprD的7株菌,均对2种碳青霉烯敏感.27株菌高表达主动外排系统MexAB-OprM,高表达组对亚胺培南耐药率81.5%(22/27) 与低表达组耐药率86.4%(19/22)比较差异无统计学意义(χ2=0.005, P=0.943);而高表达组对美罗培南耐药率44.4%(12/27)与低表达组耐药率13.6% (3/22) 比较差异有统计学意义(χ2=5.417, P=0.020).14株表达了MexEF-OprN,但表达组对亚胺培南和美罗培南耐药率与未表达组耐药率比较差异均无统计学意义(χ2=0.000, P=1.000).8株高表达MexAB-OprM主动外排系统的调控基因mexR发生变异,其中7株出现氨基酸替换,1株提前出现终止密码子.未发现产IMP、VIM金属酶菌株.结论本院SICU分离的PA,对碳青霉烯耐药主要是由外膜蛋白OprD表达降低或缺失引起,与IMP、VIM金属酶无关;主动外排系统MexAB-OprM的高表达对美罗培南的耐药起重要作用;其高表达与调控基因mexR变异有关.
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O157:H7大肠杆菌外膜蛋白对小鼠免疫保护作用的实验研究
目的研究经不同免疫途径,O157:H7大肠杆菌外膜蛋白(OMP)对小鼠接受致死剂量该菌攻击后的免疫保护作用.方法用外膜蛋白分别通过鼻腔、口腔和皮下途径对雌性BALB/c小鼠免疫3次,采用ELISA测定血、阴道冲洗液和粪便内抗体水平;用Western-印迹方法分析诱导小鼠产生抗外膜蛋白特异性抗体的抗原;用致死剂量O157:H7 大肠杆菌活菌经口腔攻毒,观察记录动物的发病与死亡情况;观察受染动物器官病理变化.结果 ELISA结果表明,经鼻腔与口腔免疫,能有效诱导抗外膜蛋白 IgA和IgG免疫应答,鼻腔免疫更为有效.经皮下免疫仅能诱导血中产生高水平的特异性IgG抗体.攻毒后,鼻腔和口腔免疫组小鼠存活率明显高于对照组(86.7% 比40%, P<0.01和73.3%比40%, P<0.05),鼻腔免疫组更高(86.7%比73.3%,P<0.05).而皮下免疫组存活率甚至低于对照组(13.3%比40%, P<0.05).结论 O157:H7大肠杆菌外膜蛋白对实验小鼠的该菌株致死剂量攻击有较强的保护作用.鼻腔免疫途径为O157:H7 大肠杆菌外膜蛋白诱导机体产生免疫保护的佳途径.
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羊布鲁氏菌外膜蛋白质的组成鉴定
目的:通过蛋白质组技术阐明羊布鲁氏菌外膜蛋白的主要组成.方法:提取并纯化羊布鲁氏菌的外膜蛋白,应用双向电泳技术进行分离,选取双向电泳图上主要的蛋白点进行质谱分析,同时主要蛋白质点的肽指纹图谱利用Mascot在NCBInr蛋白数据库中进行检索.结果:共鉴定到67个蛋白点,主要外膜蛋白为Omp25和Omp31,其他外膜蛋白如Imp、Frp、GroEL等,功能涉及物质运输、能量代谢、应激等.结论:对主要外膜蛋白Omp25和Omp31的识别与分析不仅有助于对布鲁氏菌致病机制的研究,而且为布鲁氏菌病的疫苗研制提供靶标蛋白.
