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应用单链构象多态性和异源双链分析研究拉米夫定耐药变异
目的应用单链构象多态性/异源双链分析技术研究慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗前后乙肝病毒准种组成的改变.方法聚合酶链反应扩增6例患者治疗前后共12份血清标本中目的片段并逐一分析.结果拉米夫定治疗前患者体内乙肝病毒聚合酶基因序列准种组成较复杂,准种数在7～14(平均9.8),均高于治疗后准种数4～8(平均5.7),t=3.98,P＜0.05.6例患者治疗前的准种分布中有一种或两种优势准种,但比例较低(33.3%～81.8%);治疗后显著升高(78.8%～90.9%),t=3.24,P＜0.05.选择优势克隆测序,6例患者经拉米夫定治疗后2例在酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)序列出现M550V/L528M,3例为M550I变异,1例无变异.结论采用单链构象多态性/异源双链分析技术对人体内病毒作整体性的研究,可避免其他研究方法的片面性,为发现新的变异点提供机会,进一步解释拉米夫定的耐药机制.
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特异性核酸内切酶检测结核分枝杆菌的乙胺丁醇耐药基因突变
目的 探讨Surveyor酶法在结核分枝杆菌耐药基因突变中的应用.方法 采用Surveyor酶法检测结核分枝杆菌临床分离株60株,其中已经测序证实有embB基因突变的乙胺丁醇耐药株45株,无基因突变的敏感株15株.经聚合酶链反应扩增,杂交形成异源双链,Surveyor酶切,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳判断其有无突变存在.结果 15株敏感株均无embB基因突变,45株耐药株均存在embB基因突变热点306位密码子的点突变,其中33株为ATG→GTG,3株为ATG→ATT,5株为ATG→ATA,2株为ATG→ATC,2株为ATG→CTG.经Surveyor酶法测定,45株embB基因突变株均呈现2条带形,15株敏感株均显示1条带形.结论 Surveyor酶法与测序法的结果完全相符.采用Surveyor酶法进行异源双链分析,具有简便、稳定、低耗、灵敏性和特异性高的特点.
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乳腺癌及卵巢癌组织BRCA1基因突变的检测
乳腺癌和卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤.1994年,第1个卵巢癌、乳腺癌易感基因BRCA1被成功克隆[1].为探讨BRCA1基因在乳腺癌、卵巢癌发生中的潜在作用,我们应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)及多重异源双链分析( MHA)方法对56例乳腺癌及34例卵巢癌患者的癌组织标本进行BRCA1基因突变的检测.
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血友病甲患儿及其家系凝血因子Ⅷ基因内含子重复序列多态性研究
目的探索一种更简便,更特异的方法,用于血友病甲的基因诊断及其家系的遗传咨询.方法应用聚合酶链反应(PCR)和双链异源泳动分析(HMA)对我国10个血友病甲患儿及其家系成员中FⅧ基因内13内含子二核苷酸重复序列(CA)n多态性和等位基因进行分析.结果 10个家系中,男性20例,女性10例,共40条X染色体,经PCR扩增、琼脂糖电泳均可显示出140～150 bp DNA条带,男性呈现单一的DNA条带,女性则根据等位基因的不同,出现两条DNA条带(杂合子)或者一条DNA条带(纯合子).结论二核苷酸重复序列广泛分布于中国人群FⅧ基因中,重复序列的多态性作为第二代遗传标志,结合等位基因分析和HMA杂交电泳泳动分析,可明确鉴别出血友病甲基因的携带者,可用于血友病甲的基因诊断和遗传咨询.
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异源双链分析和单链构象多态性分析在基因突变检测中的作用
评价异源双链分析(HET)和单链构象多态性分析(SSCP)在基因突变检测中的作用。方法：同时应用两种方法检测23例肺腺癌标本中p53基因和p16基因突变情况。结果：用HET法检出6例p53基因突变和5例p16基因突变，用SSCP法检出3例p53基因突变和1例p16基因突变，联合应用HET和SSCP方法检出7例p53基因突变和5例p16基因突变。结论：检测基因突变HET优于SSCP，联合应用HET和SSCP能提高基因突变检出率.
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镶嵌基因OMGP与Ⅰ型神经纤维瘤病发病的相关性研究
目的研究NF1基因27b内含子上的镶嵌基因OMGP与Ⅰ型神经纤维瘤病(NF1)的发病是否相关.方法设计5对互相嵌套能扩增OMGP基因整个表达序列的引物,应用PCR-SSCP(聚合酶链反应-单链构象多态性)/HA(异源双链分析)-银染-直接测序技术检测32例NF1患者与20例正常人中OMGP基因的突变.结果 3例NF1患者的3个片段在SSCP中出现泳动异常,经直接测序分析并无碱基的改变,与Genebank中报告的序列完全一致.结论 OMGP基因可能与NF1发病没有必然联系.
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单链构象加异源双链提高基因突变筛查准确性
[目的]比较单链构象多态性分析(SSCP)和异源双链分析(HA)在基因突变筛查中的意义.[方法]在帕金森病人和正常对照中,同时应用这两种实验方法筛查α-共核蛋白基因3、4外显子突变,电泳结果由测序考证.[结果]对照组第29号标本3号外显子SSGP存在单链泳动异常,但HA检测无双链泳动异常,测序证实无基因突变.其它标本SSCP和HA检测均未发现异常泳动.[结论]将单链构象分析和异源双链分析相结合应用于基因突变筛查,既不用增加试剂、设备和技术难度,又可以优势互补,利于提高检测的准确性.
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上海汉族人群MICA基因第5外显子微卫星多态性研究
目的了解上海地区汉族人群MICA基因第5外显子微卫星多态性分布,以及MICA基因与其紧密连锁的HLA-B基因位点的关系.方法用PCR-异源双链分析法,对175名正常无关个体的MICA基因第5外显子微卫星多态性的分布进行研究.结果 (1)上海地区汉族人群MICA基因第5外显子存在5种等位基因,其中MICA*A5为常见(39.14%),其次为*A5.1(22.29%);(2)MICA等位基因与HLA-B位点之间存在一定的连锁不平衡,如:MICA*A5与HLA-B15,MICA*A4与HLA-B27等.结论 MICA基因第5外星子多态性分布虽没有HLA经典Ⅰ类、Ⅱ类基因那样明显的人种和地区差异,但各群体之间仍然有差异存在.
