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乙肝患者158例血清HBV DNA含量变化对比分析
目的:比较实时荧光PCR法与COBAS Amplicor法定量检测血清HBV DNA的准确性.方法:本研究参比血清来自国家药品生物制品鉴定所与国家临检中心,临床血清标本共158例.比较了两种方法的线性范围、准确度、重复性、实验时间及成本.结果:实时PCR的批内差和批间差分别为0.3%～3.8%和1.4%～8.1%.实时荧光PCR法与COBAS Amplicor法具有良好的相关性(r=0.948),实时荧光PCR法成本低且检测范围更宽.结论:实时PCR是监测慢性乙肝患者HBV DNA水平的有效方法.
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心肌缺血再灌注损伤模型大鼠心肌组织及血清肌钙蛋白Ⅰ表达和心肌肿瘤坏死因子α与重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的干预
背景:心肌缺血再灌注时生成大量的肿瘤坏死因子α直接造成心肌的收缩功能下降.目的:观察药物重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对大鼠缺血再灌注心肌损伤的影响.方法:成年雄性Wistar大鼠建立心肌缺血再灌注模型.药物干预组在再灌注前注射重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白,模型组给予生理盐水,并设立不造模的假手术组.再灌注后立即测量心肌梗死面积,ELISA检测再灌注后的心肌肿瘤坏死因子α及血清肌钙蛋白Ⅰ的含量,实时PCR检测心肌肿瘤坏死因子α mRNA的表达.结果与结论:与假手术组相比,模型组与药物干预组大鼠心肌肿瘤坏死因子α及其mRNA和肌钙蛋白的水平明显升高 (P < 0.05);与模型组相比,药物干预组心肌肿瘤坏死因子α及血清肌钙蛋白Ⅰ水平明显升高(P < 0.05),心肌梗死体积与肿瘤坏死因子α mRNA的表达减少(P < 0.05).提示重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白能够减轻心肌缺血/再灌注损伤作用,改善大鼠的心功能.
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在INS-1细胞中构建胰腺组织硫氧还蛋白相互作用蛋白过表达模型:两种腺病毒感染方法的差异
背景:目前,通过腺病毒感染方法在细胞中构建蛋白质过表达模型的方法主要有2种,一是在腺病毒感染细胞4 h后补充1640完全培养基,24 h后换为完全培养基,再继续培养到48 h(方法Ⅰ);另一种是在腺病毒感染细胞4 h后用PBS洗去含有腺病毒的1640培养基,更换4 mL完全培养基培养到48 h,中间不做任何处理(方法Ⅱ).前者病毒的作用时间较长,感染效果较好,但病毒本身对细胞的损害程度较大,对实验模型的稳定性产生干扰.而后者病毒的作用时间短,对细胞的毒性低,但有时病毒感染效率较低,目的蛋白的表达效果欠佳.目的:在大鼠INS-1胰岛β细胞中,通过比较相同腺病毒载体介导的不同感染细胞的方法而寻找一种更加稳定而高效的硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-interacting protein,TXNIP)过表达模型.方法:构建含有绿色荧光蛋白的腺病毒载体(Ad-GFP)和TXNIP过表达腺病毒载体(Ad-TXNIP-GFP).分别设立正常组、空病毒组和TXNIP过表达组,按照上述2种不同的方法进行病毒转染.结果与结论:①方法Ⅱ中的绿色荧光蛋白荧光强度和阳性效率高于方法Ⅰ;②方法Ⅱ中的细胞形态更好且细胞存活率更高;③方法Ⅱ中,目的基因TXNIP在mRNA水平和蛋白质水平的表达情况明显高于方法Ⅰ.由以上结果得出结论,腺病毒感染INS-1细胞4 h后,使用PBS将旧培养基洗去并更换新培养基,继续培养到48 h的方法更有利于在INS-1细胞中构建TXNIP过表达模型.
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RSV毛细支气管炎的肺表面活性蛋白D多态性与TaqMan MGB探针
目的 探讨TaqMan MGB探针实时PCR技术检测肺表面活性蛋白D(surfactant protein,SP)-D基因变异是否与呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)毛细支气管炎易感性有关.方法 运用TaqMan MGB探针检测150例RSV毛细支气管炎和150例健康对照组SP-D基因多态性,并进行基因型、等位基因频率分析.各组的基因型、等位基因频率比较采用x2检验.结果 病例组SP-D Met1 1Thr位点TT、CT、CC三种基因型频率分别为7.3％、44.0％、48.7％,T、C等位基因频率分别为29.3％、70.7％.三种基因型及等位基因频率与对照组比较差异有统计学意义(x2=6.751、5.823,P＜0.05).结论 杭州地区汉族儿童存在SP-D基因多态性,SP-D Met11Thr位点与RSV毛细支气管炎疾病易感性存在关联,C等位基因可能是RSV毛细支气管炎的易感基因.TaqMan MGB探针实时PCR技术是基因诊断良好技术平台.
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人肺腺癌中RhoA的表达及临床意义
目的 检测人肺腺癌组织及其对应的癌旁肺组织中RhoA的表达,研究RhoA与肺腺癌发生和侵袭转移的关系,探讨其在肺腺癌发生、发展中的作用.方法 选取有完整临床资料的30例肺腺癌组织和30例对应的癌旁肺组织,应用实时PCR方法检测2组中RhoA mRNA的表达情况.结果 实时PCR结果显示:在30例肺腺癌组织中26例(86.7％) RhoA mRNA表达水平明显高于对应的癌旁肺组织,差异有统计学意义(P＜0.05).RhoA mRNA表达与病理分期、淋巴结转移有关.结论 RhoAmRNA表达可能与肺腺癌的发生有关,参与了肺腺癌的浸润转移及淋巴转移,有望作为肺腺癌预后和转移指标.
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c-FLIPL在白血病中的表达及临床意义
目的 探讨c-FLIPL在不同类型白血病中的表达水平及其临床意义.方法 应用实时PCR检测103例不同类型白血病患者骨髓单个核细胞c-FLIPL mRNA表达,包括急性淋巴细胞白血病(ALL)54例(其中初诊37例、复发5例、完全缓解12例)、急性髓细胞白血病(AML)38例(其中初诊24例、复发6例、完全缓解8例)、初诊急性未分化白血病(AUL)2例、初诊慢性粒细胞白血病(CML)6例、初诊慢性粒单核细胞白血病(CMML)3例.应用流式细胞术对所选病例进行免疫表型检测.结果 在初诊和复发的白血病中c-FLIPL mRNA呈异常高表达趋势,二者间差异无统计学意义(P>0.05).初诊AUL及初诊CML的c-FLIPL mRNA表达高于其他初诊组,但差异无统计学意义(P>0.05).初诊ALL、AML、AUL、CML、CMML与对照组、完全缓解组比较,c-FLIPL mRNA的差异均有统计学意义(P<0.05).c-FLIPL mRNA表达与患者危险度分级、初诊白细胞数、血乳酸脱氢酶(LDH)、血羟丁酸脱氢酶(HBDH)、CD45、融合基因TEL-AML1相关,与患者年龄、性别、血纤维蛋白原及染色体异常无关.结论 白血病患者c-FLIPL mRNA表达异常增高,并与危险度分级、初诊白细胞数、血LDH、血HBDH及预后密切相关.
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实时定量PCR检测类风湿关节炎滑液单个核细胞MIP-1α mRNA的表达
目的 了解类风湿关节炎(RA)患者滑液单个核细胞MIP-1α mRNA表达情况.方法 用实时定量PCR技术检测8例活动期RA患者滑液和血清单个核细胞(SFMC和PBMC)中巨嗜细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α) mRNA的表达水平.同时检测血清CRP和滑液白细胞数.结果 RA患者SFMC MIP-1α mRNA表达水平比自身PBMC表达水平明显增高(P＜0.01),并且与血清CRP和滑液白细胞数呈正相关(r分别为0.9028和0.9120,P＜0.01).结论 RA患者可能通过SFMC高表达MIP-1 α趋化炎性细胞向滑膜迁移,加重局部炎症反应.
关键词： 类风湿关节炎 巨嗜细胞炎症蛋白-1α 滑液单个核细胞 实时PCR -
猪细胞因子SYBR Green实时PCR检测方法的建立
目的:建立一种用SYBR Green荧光染料检测猪细胞因子的实时PCR方法.方法:从猪外周血淋巴细胞中提取细胞因子mRNA,反转录成cDNA,利用SYBR Green荧光染料法实时检测IL8、IL10、IFNα、IFNγ和TNFα的mRNA表达水平.分别通过融解曲线和琼脂糖凝胶电泳分析各细胞因子检测的特异性;并对各细胞因子PCR产物进行梯度稀释后作为模板进行敏感性试验;利用建立的方法分别对正常猪和感染PRRSV的猪的外周血淋巴细胞中上述细胞因子进行检测,并以管家基因cyclophilin为内参照对各细胞因子进行定量分析.结果:建立的各细胞因子SYBR Green实时检测方法具有良好的特异性和敏感性,TNFα检测敏感性可达10个拷贝,其它细胞因子检测敏感性均可达100个拷贝.猪在感染PRRSV后,外周血淋巴细胞中IL8和IL10明显增加,而IFNα和TNFα略有下降.结论:建立了五种猪细胞因子SYBR Green实时PCR检测方法,并能成功地应用于临床检测.
关键词： SYBR Green 实时PCR 细胞因子 猪 -
实时定量RT-PCR检测博尔纳病病毒方法的建立
目的 建立检测博尔纳病病毒(BDV)RNA的实时定量RT-PCR(real-time RT-PCR)方法.方法 设计BDV-p40基因特异性引物和探针,优化反应条件;并以已知的BDV-p40基因扩增产物的克隆为标准品,建立标准曲线;然后对已知BDV RNA进行实时定量RT-PCR的特异性和敏感性检测.结果 建立了特异检测BDV RNA的实时定量RT-PCR技术,并且可以检测到感染细胞中1个拷贝以上BDV RNA.结论 本技术可以直接用于BDV感染的检测和定量分析.
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荧光定量 PCR 定量检测5种假丝酵母菌方法的建立
目的：建立并评价从血液标本中检测5种假丝酵母菌的荧光定量聚合酶链反应（ PCR ）方法。方法以5种假丝酵母菌共有的高度保守序列为靶序列，设计特异引物和探针进行检测，优化定量PCR体系，并进行方法学评价。结果建立的荧光定量PCR方法，其线性范围为101～109 CFU／mL；灵敏度为5 CFU／mL；批内和批间CV值均＜5％；对19份模拟血液标本进行检测，其中分别含有5种假丝酵母菌的标本均为阳性，而分别含有常见血液感染曲霉菌和细菌的检测结果均为阴性。结论建立的检测血中假丝酵母菌荧光定量PCR方法快速、准确，结果可靠，可对常见的临床血液感染假丝酵母菌进行定量检测。
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心肌病患者心肌中相关病毒的测定
目的:探讨炎症性心肌病、扩张型心肌病(idiopathic dilated cardiomyopathy,IDCM)、肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)与心肌中细小病毒B19(parvovirus B19,PB19)、腺病毒和肠病毒的关系.方法:利用多聚酶链反应(PCR),比较30例炎症性心肌病、36例IDCM、13例HCM及36例对照组患者心内膜活检标本中PB19、腺病毒及肠病毒的检出率,并用荧光素探针实时定量PCR检测PB19拷贝数.结果:30例炎症性心肌病患者中有4例PB19阳性(13.3%)、1例腺病毒阳性(3.3%)、10例肠病毒阳性(33.3%);36例IDCM中有3例PB19阳性(8.3%)、1例腺病毒阳性(2.8%)、7例肠病毒阳性(19.4%);13例HCM中有2例PB19阳性(15.4%)、1例肠病毒阳性(7.69%)、腺病毒阴性.而对照组未检出病毒序列.PB19量从70拷贝/μg至3 900拷贝/μg,炎症性心肌病PB19DNA拷贝数高于IDCM组和HCM组.结论:PB19和肠病毒一样是炎症性心肌病、IDCM病因之一,可能与HCM发生也有一定关系,而腺病毒为非主要致病病毒;炎症性心肌病的高拷贝PB19 DNA提示病毒感染是诱发心肌炎症反应的机制之一.
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Nucleostemin在结直肠癌和正常结直肠组织中的表达及其意义
背景:Nucleostemin(NS)是一个与细胞增殖相关的核蛋白,部分研究显示其仅高表达于干细胞和肿瘤细胞.成体组织分化细胞中未见NS表达.目的:探讨NS在结直肠癌和正常结直肠组织中的表达及其意义.方法:收集38例结直肠癌患者的癌组织及其相应癌旁正常组织标本,以实时RT-PCR和蛋白质印迹法检测NS mRNA和蛋白表达.结果:实时PCR扩增曲线显示结直肠癌组织和正常结直肠组织均有NS基因指数式扩增,癌组织NS mRNA表达量显著高于正常组织(1.8939±0.9529对1,P=0.011).蛋白质印迹法证实NS蛋白在正常组织中表达较微弱或几乎无表达,癌组织中其表达显著增高(1.5397±0.3625对0.6336±0.3443,P=0.001).结论:结直肠癌组织和正常结直肠组织中均存在NS基因,推测其微量表达可调节细胞正常增殖,而异常高表达则可通过某些机制促进细胞恶性增殖.
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采用实时PCR技术比较不同方法提纯隐孢子虫卵囊DNA效果
目的 比较不同方法提纯隐孢子虫卵囊DNA的效果.方法 将分离纯化的隐孢子虫卵囊分别加入美国Promega公司(简称Promega)和上海捷瑞公司(简称捷瑞)基凶组DNA纯化试剂盒的裂解液、2%Triton X-100和5%异硫氰酸胍,同时联合使用冻融法、蛋白酶K法和声裂法裂解卵囊,用试剂盒法或Chelex-100法提纯卵囊基因组DNA,用实时PCR测定隐孢子虫卵囊囊擘蛋白(COWP)基因拷贝数,以Promega试剂盒为参照比较不同纯化方法的提纯效果.结果 Promega试剂盒的裂解液裂解隐孢子虫卵囊的效果好.纯化所得卵囊COWP基因拷贝数可达(6.45～9.86)×106;其他依次为捷瑞试剂盒的裂解液[(2.38～3.69)×106、5%异硫氰酸胍[(1.27～2129)×105]和2%Triton X-100[(2.06～866.70)×103].冻融法+蛋白酶K法+声裂法提纯隐孢子虫卵囊DNA效果佳,其次为冻融法+声裂法和蛋白酶K法+声裂法,冻融法+蛋白酶K法效果差.结论 冻融法+蛋白酶K法+声裂法联合使用能使卵囊DNA的提纯效率达到大,捷瑞基因组DNA纯化试剂盒和5%异硫氰酸胍裂解法提纯隐孢子虫卵囊DNA可获得与Promega试剂盒相近的效果.
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OLETF大鼠脂肪组织chemerin及其受体1的基因表达
用实时定量PCR检测OLETF大鼠脂肪组织中chemerin及其受体1 mRNA的表达,结果两者表达水平较对照组明显升高(P<0.05或P<0.01),且网膜脂肪组织高于皮下脂肪组织(P<0.05或P<0.01),说明脂肪因子chemerin及其受体1基因表达的变化可能是肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病发病的机制之一.
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与肿瘤侵袭相关的Lewis抗原在人肝癌细胞H7721上的表达及其合成的酶学分析
目的研究人肝癌细胞H7721表面4种含岩藻糖类抗原一Lewis抗原的表达、它们与肝癌细胞在体外侵袭行为的关系,及其合成相关酶α1,3岩藻糖转移酶(FucT)5种亚型的基因表达.方法用单克隆抗体结合流式细胞仪测定Lewis抗原,用涂有Matrigel膜的转移小室测定细胞的侵袭行为,利用实时RT-PGR测定FucT的表达.结果 H7721细胞表面主要表达Slex和少量SDLex,而Lex和Slea表达极微.其中只有Slex和H7721细胞的侵袭明显相关.H-7721细胞中FucT的表达强度为FucT-Ⅳ＞FucT-Ⅲ＞FucT-Ⅵ≥FucT-Ⅶ,后两者表达少,而几乎完全缺乏FucT-Ⅸ.结论 Slex是H7721细胞表面多也是与细胞侵袭有关的Lewis抗原,因据报道FucT-Ⅵ催化合成Slex和SDLex的效率高于FucT-Ⅲ及Ⅶ,故可能是负责H7721细胞中Slex和SDLex合成的主要FucT,但也不排除FucT-Ⅶ和FucT-Ⅲ也参与Slex的合成.合成Lex中重要的FucT-Ⅸ的缺乏可能是Lex低表达的原因.
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银屑病相关细胞因子在K14-VEGF转基因小鼠皮肤的表达
目的:检测K14-VEGF转基因小鼠皮肤基因组内银屑病相关细胞因子表达水平.方法:通过实时(real-time)PCR和免疫组化的方法,测定VEGF、IL 6、IL-17、Stat-3等细胞因子mRNA与Stat-3蛋白的表达.结果:转基因小鼠皮肤中银屑病相关细胞因子Stat-3mRNA、VEGF mRNA以及Stat-3蛋白表达水平与野生型小鼠相比显著增高(P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01).结论:K14 VEGF转基因小鼠皮肤基因组内上述银屑病相关细胞因子表达上调.
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甲状腺良恶性病变组织中钠碘同向转运蛋白mRNA的表达变化
目的 探讨良恶性病变甲状腺组织中钠碘同向转运蛋白(NIS) mRNA的表达变化.方法 取甲状腺切除术中的新鲜组织标本,根据病理学检查结果分为结节性甲状腺肿组、甲状腺腺瘤组、甲状腺癌组和瘤周甲状腺组织对照组,采用Real-Time PCR技术测定各组甲状腺组织中NIS mRNA表达.结果 与对照组相比,结节性甲状腺肿组、甲状腺腺瘤组、甲状腺癌组甲状腺组织中NIS mRNA的相对表达量显著减少(P＜0.01).在不同病变组,甲状腺癌组NIS mRNA的相对表达量下降更为明显(P＜0.01);结节性甲状腺肿组与甲状腺腺瘤组NIS mRNA的相对表达量比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 甲状腺良恶性病变均存在NIS mRNA表达的下调,且以恶性病变更为明显.提示甲状腺病变时甲状腺“碘泵”功能存在不同程度的损害.
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实时PCR技术在龋易感儿童牙菌斑致龋菌定量检测中的应用
目的 建立定量检测致龋菌的快速、敏感、特异的方法.分析牙菌斑中主要致龋菌数量与乳牙龋失补牙面(dmfs)指数的关系.方法 牙菌斑组织取自45例学龄前儿童,其中无龋(dmfs=0)中龋(dmfs=4～6)和高龋(dmfs＞8)组各15例.应用SYBR Green I模式的实时PCR技术,对各组儿童牙菌斑中4种主要致龋菌(变异链球菌、远缘链球菌、黏性放线菌和内氏放线菌)进行定量检测,并计算各致龋菌所占总菌的比例.对各组所获数据进行统计学分析.结果 高龋组中4种致龋菌所占总菌的比例均高于无龋组(P＜O.01),其中变异链球菌和远缘链球菌的数量之和所占总菌的比例与dmfs指数具有良好的线性关系.结论 实时PCR技术可作为一种细菌定量检测方法,应用于致龋菌的定量分析和龋齿活跃性的评估.
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未获培养微生物AU126与牙周病关系的定量分析
目的 运用实时PCR技术,对未获培养微生物AU126与牙周病的关系进行定量分析.方法 设计基于16S rRNA基因的AU126特异引物,测序鉴定其PCR产物的特异性.运用实时PCR技术分别对侵袭性牙周炎(n=17)、慢性牙周炎(n=25)和单纯性龈炎(n=26)患者的龈下菌斑中AU126进行定量分析,以牙周健康者(n=38)作为正常对照.结果 实时PCR定量分析显示,侵袭性牙周炎、慢性牙周炎和单纯性龈炎患者龈下菌斑中AU126(8.72±0.44、8.46±0.67、8.47±0.47)均显著多于正常对照者(7.91±0.88)(P＜0.05).结论 实时PCR定量分析证实AU126在牙周病患者龈下菌斑中明显增多,提示其与牙周病的发病相关.
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口腔常见微生物不同定量分析方法的比较
目的 探索口腔微生物定量分析的理想方法.方法 选择3种口腔常见微生物变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的标准菌种厌氧培养24 h,经倍比稀释,涂板菌落形成单位(CFU)计数.将相应体积的菌液固定后,分别运用3种非培养方法对上述细菌进行定量分析(实时PCR、激光共聚焦显微镜和流式细胞仪).结果 细菌定量结果由大至小排列,分别为实时PCR分析、激光共聚焦显微镜观察、CFU计数、流式细胞仪检测.每种细菌的实时PCR标准曲线均显示具备较好的线性关系.结论 本研究中的3种非培养方法均适用于口腔微生物的定量分析.其中实时PCR分析和激光共聚焦显微镜观察的结果显著优于传统的CFU计数方法,而以实时PCR的敏感度高.
