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原花青素对大鼠离体肝细胞的影响
原花青素是近年来我国广泛用于保健食品的原料,它以其优越的抗氧化特性而倍受保健食品生产厂家的青睐[1].它的抗氧化作用机制主要是由于清除自由基的功能[2].为从亚细胞水平探讨其作用机制,我们利用特异性标记内质网荧光分子探针--D-273(DIOC6),在ACAS575型激光共聚焦显微镜上,采用离体实验方法,观察了不同浓度的原花青素水溶液对肝细胞内质网的影响.
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电针对神经病理性痛大鼠脊髓背角细胞内钙离子浓度以及钙-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的影响
目的:通过观察坐骨神经分支选择性损伤(SNI)大鼠脊髓背角神经细胞内钙离子([Ca2+]i)浓度以及钙-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的变化和电针干预对其的影响,探讨电针干预神经病理性痛的脊髓机制.方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组、N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂(AP-5)组和一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)组,每组22只.采用SNI法制备神经病理性痛模型,假手术组仅分离不结扎.电针组电针大鼠损伤侧“委中”“环跳”穴30 min,1次/d,AP-5组予AP-5 0.7 mg· kg-1·d-1腹腔注射,L-NAME组予L-NAME 60 mg · kg-1·d-1腹腔注射,连续7d.造模前及SNI后10 d、16 d分别测定机械痛阈.激光共聚焦显微镜技术观察脊髓背角[Ca2+]i的荧光强度;Western blot和免疫组化法测定脊髓CaMKⅡ的表达.结果:与假手术组比较,SNI后10 d各组机械痛阈值均降低(P＜0.01);与模型组比较,电针组、AP-5组和L-NAME组SNI后16d时机械痛阈值均升高(P＜0.01,P＜0.05).与假手术组比较,模型组脊髓背角[Ca2+]i浓度与CaMKⅡ表达均升高(P＜0.01,P＜0.05);与模型组比较,电针组、AP-5组和L-NAME组脊髓背角[Ca2+]i浓度均被逆转(P＜0.05,P＜0.01),而CaMKⅡ的表达仅电针组被逆转(P＜0.05).结论:电针减轻大鼠神经病理性痛的机制之一,可能与其有效下调脊髓背角[Ca2+]i浓度及CaMKⅡ的表达,继而抑制其一系列后效应有关.
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参麻益智胶囊对大鼠海马神经细胞内游离钙离子动态变化的影响
目的:观察大鼠海马神经细胞在正常状态以及药物干预作用下游离钙离子的分布变化,从而探讨参麻益智胶囊改善学习记忆的作用机制.方法:采用培养5～7天细胞之间突触连接成网状的大鼠海马神经细胞,给予参麻益智胶囊含药血清,并与吡拉西坦组对照,通过激光共聚焦显微镜观察大鼠海马神经细胞内游离钙离子动态变化.结果:参麻益智胶囊可以降低神经细胞内游离钙离子的含量.结论:参麻益智胶囊可以改善实验动物的记忆和认知功能,其机理与抑制神经细胞钙离子内流、拮抗钙超载有关.
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环维黄杨星D对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用和对心肌细胞内游离钙浓度的影响
目的:研究环维黄杨星D(CVB-D)对培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用和对急性分离大鼠心肌细胞内游离Ca2+浓度的影响.方法:采用培养的乳鼠心肌细胞建立缺氧/复氧损伤模型,测定心肌细胞搏动频率、细胞存活率、肌酸激酶(CK)的含量;应用特异性荧光指示剂Fluo-3/AM负载急性分离的大鼠心肌细胞,用激光共聚焦显微镜检测胞内游离钙的变化.结果:缺氧/复氧损伤+环维黄杨星D组(H/R+CVB-D)乳鼠心肌细胞搏动频率、细胞存活率与缺氧/复氧损伤组比较明显升高,CK含量与缺氧/复氧损伤组比较明显下降.对急性分离大鼠心肌细胞内[Ca2+]i逐步升高,并呈剂量依赖性;在有外钙和无外钙时,CVB-D对胞内钙的升高有显著差异(P<0.05);在无外钙并加入内罗啶孵育后,CVB-D引起的胞内[Ca2+]i轻度升高,但与无钙组相比无显著性差异(P>0.05).结论:环维黄杨星D对培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤有保护作用,对急性分离大鼠有升高心肌细胞内游离钙离子浓度的作用,[Ca2+]的升高既源于内钙释放又源于外钙内流.
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葛根素对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响
目的:观察葛根素对外周血内皮祖细胞的影响.方法:采用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被培养板,培养7 d后,收集贴壁细胞,加入不同浓度葛根素(分别为0.1,0.5,1,3 mmol·L-1)培养一定的时间(6,12,24,48h).通过激光共聚焦显微镜鉴定FTTC-UEA-Ⅰ和DiI-acLDL双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPC,并在倒置荧光显微镜下计数.然后分别采用MTT比色法、改良的Boyden小室、黏附能力测定实验和体外血管生成试剂盒观察EPC的增殖能力、迁移能力、黏附能力和体外血管生成能力.结果:葛根素显著增加外周血EPC数量,并且EPC数量随葛根素浓度增加及作用时间延长而增加,3 mmol·L-1浓度葛根素作用24 h对EPC数量的影响为显著(较对照组增加了1倍,P《0.01).葛根素也显著改善了外周血EPC的黏附能力、迁移能力、增殖能力和体外血管生成能力.结论:结果提示葛根素可增加EPC的数量且伴随着EPC功能的改善.
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激光共聚焦显微镜在生物医学研究中的应用
共聚焦显微镜是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术相结合的产物,是现代化的光学显微镜,它对普通光镜做了多方面的技术改进:用激光做光源并采用了共聚焦技术消除了透镜的色差和球差;运用点扫描技术,使标本上每一点的图像避免了相邻点的衍射光和散射光的干扰;结果用计算机处理;因而其图像高度清晰且数字化.激光共聚焦显微镜不仅可以观察活细胞、活组织的动态代谢过程,而且可以获得三维图像,与其他的生物学技术相配合,几乎可定性、定量定位地检测组织细胞内的任何一种生化成分.
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促甲状腺素及白细胞介素-6对大鼠甲状腺细胞钙离子的作用
本文利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)对促甲状腺素(TSH)及白细胞介素-6(IL-6)诱导的FRTL-5细胞内Ca2+变化进行了研究.方法:培养的FRTL-5细胞以Fluo-3染色,用LSCM在488nm扫描并加入不同浓度的TSH及IL-6检测细胞内Ca2+的变化.结果:TSH(1-5U/L)可使细胞内Ca2+的水平上升,且与TSH的浓度有一定关系.IL-6(1～100mg/L)对FRTL-5细胞内基础Ca2+浓度无直接作用.
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整合蛋白β1在人类卵母细胞和早期胚胎上分布的研究
目的研究人类卵母细胞体外成熟和体外受精前后,以及体外受精后胚胎早期发育的不同阶段,整合蛋白β1的分布规律. 方法利用激光共聚焦显微镜和荧光标记的整合蛋白β1抗体. 结果在成熟人类卵母细胞、体外受精的合子以及2细胞阶段胚胎中,整合蛋白β1的分布不同于在小鼠胚胎中的分布,不是分布在细胞质膜的表面,而是集中分布在细胞核的附近,细胞质膜的表面分布很少.在体外培养的4细胞和8细胞胚胎中,整合蛋白β1均匀分布在卵裂球中.发育至桑椹胚阶段,整合蛋白β1的分布开始出现极性,到囊胚阶段,整合蛋白β1的分布集中于滋养外胚层处. 结论整合蛋白分子被普遍认为是卵母细胞上的精子受体,但本研究提示,人类精子和卵母细胞的结合,整合蛋白β1的影响可能不大.而整合蛋白β1可能与雌雄原核融合、胚胎卵裂以及胚胎着床有关.
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心钠素对培养人心包间皮细胞内钙离子浓度的影响
目的探讨心纳素与人类心包间皮细胞之间的关系. 方法分离人心包间皮细胞进行体外培养,用Fluo-3作为钙的指示剂, 利用激光共聚焦显微镜测定10-9mol/L,10-10mol/L,10-11mol/L心钠素(ANP)分别用作用于人心包间皮细胞后细胞内Ca2+(Ca2+ )浓度变化. 结果人心包间皮细胞存在细胞内Ca2+浓度的改变,随着ANP浓度的增加,细胞内Ca2+浓度出现非常明显的变化(P<0.0001);细胞内Ca2+ 浓度随时间变化也出现明显的变化(P<0.0001);不同时间测定的钙离子浓度与ANP浓度之间存在着交互作用(P<0.0001). 结论人心包间皮细胞存在细胞内Ca2+的改变;不同浓度的ANP作用于间皮细胞后引起细胞内Ca2+浓度出现明显不同的改变.
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大鼠胃壁细胞GnRH受体的定位及GnRH类似物对壁细胞内钙的影响
目的观察促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)受体在培养的大鼠胃粘膜壁细胞中的定位,并探讨GnRH类似物阿拉瑞林(alarelin)对壁细胞内游离钙动员的机制.方法采用免疫组织化学和原位杂交技术;应用Ca2+指示剂Fluo-3-AM作为细胞内钙离子的荧光探针,对负载培养的胃壁细胞,应用激光共聚焦显微镜技术检测单个细胞内钙荧光强度的变化.结果大鼠胃壁细胞呈GnRH受体免疫反应阳性,阳性物质位于细胞质,细胞核为阴性;同样壁细胞内可检测到GnRH受体mRNA杂交信号,阳性物质位于细胞质,细胞核为阴性;胞内Ca2+浓度变化为:1.在Hank液中,GnRH类似物浓度为10-8、10-7、10-6 mol/L时,胃壁细胞内Ca2+浓度逐渐升高,其峰高(峰值减去静息值)分别为7.1±1.4、12.1±1.7、16.8±2.2.其达峰时间也逐渐增快,分别为34.2±6.4s、18.9±1.2s、10.4±2.3s.相邻两组间其峰高及达峰时间均存在显著性差异(P＜0.05),且呈明显剂量依赖性.2.在D-Hank液(去除外钙)中,阿拉瑞林可轻度短暂升高胞内Ca2+;用内罗啶孵育后再加入阿拉瑞林也可轻度短暂升高胞内Ca2+,二者无显著性差异.3.当用拉西地平孵育后再加入阿拉瑞林,可明显抑制胞内Ca2+的增加.4.当用PLC(磷酸脂二酶)抑制剂和PKC(蛋白激酶C)抑制剂孵育后,再加阿拉瑞林,其胞内Ca2+升高仍受到抑制,明显小于单独应用10-6 mol/L的阿拉瑞林组(P＜0.01).结论大鼠胃壁细胞能自身表达GnRH受体;GnRH类似物可明显升高胃壁细胞内Ca2+浓度,且胞内Ca2+的增加主要源于外钙的内流,部分源于内钙的释放.其中细胞外钙的内流主要是通过L-型钙通道实现的.
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幼年与成年兔椎间盘髓核细胞的形态学差异及其意义
目的探讨幼年与成年兔髓核细胞的形态学差异.方法利用激光共聚焦显微镜和透射电镜,对幼年和成年兔的髓核组织进行组织细胞水平和超微结构的观察.结果幼年兔的髓核细胞呈圆形,簇状分布,其直径为(266±167)μm,细胞簇的密度为每个高倍(×40)视野(14.9±4.3)个,细胞内含有大量空泡状的包含体.成年兔的髓核细胞呈圆形或类圆形,细胞簇小或呈单个散在分布,细胞簇的直径为(94±42)μm,细胞簇密度为每个高倍(×40)视野(8.0±2.4)个细胞,其中包含体数目少且不含大的包含体.结论幼年与成年兔的髓核细胞具有明显的形态结构差异.椎间盘成年期发生的这种形态结构上的变化可能是随年龄增加而椎间盘生物学功能逐渐降低的原因之一.
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VR1受体在大鼠食管传入纤维的表达
目的研究辣椒素(capsaicin)受体VR1在大鼠食管传入神经纤维的表达,纤维的形态特征及分布.方法应用激光共聚焦显微镜结合免疫组织化学双标技术.结果VRl阳性(VR1-IR)纤维和终末主要分布于食管的黏膜层、黏膜下层、平滑肌以及血管周围,其形态多为一些含有小棘及串珠样结构的细纤维.有(92.3±3.7)%VR1-IR纤维与代表脊神经节源性传入纤维的神经肽CGRP共存.VR1在脊神经节和结状神经节中的表达类似,为中小型神经元.脊神经节中有(41.5±4.5)%VRl-IR神经元含有CGRP和(67.9±3.2)%CGRP-IR神经元表达VR1.CGRP-IR细胞在结状神经节较少,仅有(4.7±1.4)%VR1-IR神经元含有CGRP. 结论大鼠食管壁内的脊神经源性感觉纤维表达VR1受体.
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双氢青蒿素对阴道毛滴虫微丝作用的观察
目的探讨双氢青蒿素对阴道毛滴虫的杀伤效果及作用机制. 方法用含双氢青蒿素的肝浸汤培养基培养阴道毛滴虫,观察药物对滴虫的杀灭效果;用激光共聚焦显微镜观察双氢青蒿素作用前后滴虫微丝的变化. 结果随药物作用时间延长和药物浓度增加,阴道毛滴虫死亡率增高.同一时间随着药物浓度的增高,虫体死亡率升高(P< 0.01).作用6 h,双氢青蒿素0.6 mg/ml虫体死亡率是20%,而1.0 mg/ml时高达85%;同一药物浓度随着作用时间延长,滴虫死亡率也升高(P<0.05),药物0.8 mg/ml时,6 h、8 h、10 h、12 h和14 h死亡率分别是43%、68%、86%、97%和100%.药物作用后滴虫微丝排列疏松,有空隙生成.排列杂乱无序. 结论双氢青蒿素可作用于滴虫微丝结构,破坏微丝,具有较强的杀滴虫作用.
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铜绿假单胞菌生物膜形成过程观察
目的 观察铜绿假单胞菌实验室保存株与临床分离的菌株体外细菌生物膜的形成过程.方法 通过FITC标记的刀豆球蛋白(FITC-ConA)和碘化丙啶(PI),结合激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)摄取生物膜形成阶段不同层面的图片.结果 培养3 d后可观测到生物膜中的多糖开始形成,培养第7 d,多糖基质逐渐增多,细菌趋向化聚集,膜结构致密,其内部存在相互交通的间隙及孔道;CLSM结合FITC-ConA和PI标记,实现了对铜绿假单胞菌菌株生物膜动态形成过程的观察.结论 铜绿假单胞菌生物膜可在体外支持物上形成并成熟;临床新分离株较实验室保存株更易形成生物膜.
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免疫荧光和激光共聚焦显微镜对人横纹肌肉瘤细胞系的观察
细胞质内骨架包括微丝、微管及中间丝.现今可采用多种技术如各种电镜技术、免疫荧光技术、流式细胞术来研究细胞骨架在细胞生命活动中的作用.近年来发展起来的激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)可以显示细胞骨架的结构及分布,并能进行定量分析.我们采用直接与间接免疫荧光法,运用LSCM观察细胞骨架,比较人体的横纹肌肉瘤细胞系与培养的正常人横纹肌母细胞的差别.
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双歧杆菌的全肽聚糖对小鼠腹腔巨噬细胞游离Ca2+离子水平的影响
双歧杆菌是人体肠道内主要的生理性有益菌,其细胞壁中的全肽聚糖(Whole peptidoglycan, WPG)保持了全菌的一些重要的生理功能,如抗感染和延缓衰老等.此外WPG亦能激活巨噬细胞.本文以Fluo-3/AM为荧光染料,用激光共聚焦显微镜动态观察了分叉双歧杆菌的WPG刺激小鼠腹腔巨噬细胞后游离Ca2+离子的浓度变化.
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人γδT细胞TCR分子与结核杆菌多肽抗原特异性结合的证据
目的探讨γδT细胞对结核杆菌抗原(Mtb-Ag)识别的分子机制. 方法采集人外周血(PB),分别经抗TCRγδ-PE和FITC标记的Mtb-Ag及其纯化的不同组分,结核杆菌高分子量蛋白组分(Mtb-HW-Ag)、低分子量多肽组分(Mtb-LW-Ag)或Mtb-Ag峰3单一主肽抗原(Mtb-Ag-Pk3)进行双标记染色,或使用过量Mtb-Ag先与细胞预处理,然后再做上述染色,用流式细胞仪检测γδT细胞上结合的抗TCRγδ-PE荧光强度变化.将人外周血PBMC经Mtb-Ag刺激24 h后,使用抗TCRγδ-PE和Mtb-Ag-FITC染色,用激光共聚焦显微镜观察γδT细胞表面TCRγδ分子的聚集. 结果经流式细胞仪分析,Mtb-Ag及其纯化的Mtb-LW-Ag、Mtb-Ag-Pk3均可与γδT细胞发生特异性直接结合,而且Mtb-Ag可有效阻断抗TCRγδ单抗与γδT细胞的结合.而Mtb-HW-Ag与γδT细胞并无特异性结合效应.经激光共聚焦显微镜观察,Mtb-Ag可显著激活γδT细胞而诱导TCRγδ分子发生功能性聚集化. 结论γδT细胞通过其表面的TCRγδ分子可直接结合Mtb-Ag,而Mtb-Ag-Pk3多肽可能是Mtb-Ag发挥其结合效应的有效成分.Mtb-Ag可激活γδT细胞并诱导TCRγδ分子聚集,而可能参与功能性脂筏(raft)的形成.
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低强度超声促进分子细胞内转运的物理学及生物学机制初探
目的 探讨低强度超声促进分子细胞内转运的物理学及生物学机制.方法 1 MHz连续发射超声作用于单层贴壁人前列腺癌DU145细胞,采用细胞膜非通透性绿色荧光分子-钙黄绿素(Calcein)和细胞核荧光染料碘化丙啶(propidium iodide,PI)通过荧光显微镜观察发生分子细胞内转运的细胞和死亡细胞的分布特征;另外细胞采用Calein和DiI(细胞膜红色荧光探针)以及PI和DiO(细胞膜绿色荧光探针)双染,激光共聚焦显微镜观察细胞膜的形态结构变化;扫描电镜观察细胞的表面形态变化.结果 荧光显微镜显示,低强度超声照射后,部分单层贴壁人前列腺癌DU145细胞出现1个或多个不规则脱落区域,发生分子细胞内转运的细胞以及死亡细胞仅分布在脱落区域的边缘,而未见于周围无细胞脱落区域;激光共聚焦显微镜显示死亡细胞形态不规则,细胞膜局部出现气球样胞膜空泡(balloon like blebs),而发生分子细胞内转运的细胞形态正常,细胞膜与周围正常细胞无明显差别,表面未见明显胞膜空泡发生;扫描电镜显示部分细胞的细胞膜绒毛稀少、表面变平或撕裂外翻等改变.结论 综合低强度超声作用后摄取荧光分子的细胞分布特征和细胞膜结构及形态学改变,提示声空化过程中机械作用力引起的细胞膜瞬时可逆性通透性增加可能是低强度超声促进分子细胞内转运的主要物理学机制和生物学机制.
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细菌外排泵抑制剂对光动力疗法抑制牙菌斑生物膜内主要致龋菌作用的影响
目的 探讨细菌外排泵抑制剂(microbial efflux pump Inhibitor,EPI)——维拉帕米对以血卟啉单甲醚(hematoporphyrin monomethylether,HMME)为光敏剂的光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)抵抗牙菌斑生物膜内主要致龋菌作用的影响.方法 以变形链球菌、血链球菌、嗜酸性乳杆菌和粘性放线菌为实验菌株,建立牙菌斑生物膜模型.以维拉帕米作为细菌外排泵抑制剂,根据在PDT过程中加入维拉帕米和光敏剂的先后顺序,实验分为5组:A组:同时加入光敏剂和维拉帕米PDT处理组,B组:先加入维拉帕米后加入光敏剂PDT处理组,C组:先加入光敏剂后加入维拉帕米PDT处理组,D组:单纯PDT处理组,E组:生理盐水处理组.激光照射后平板菌落计数观察PDT作用后牙菌斑内致龋菌的活力.结果 与生理盐水处理组相比,单纯PDT处理组牙菌斑内致龋菌存活的数量(CFU/mL)明显减少(P＜0.05),其抑菌率高达95.26％,与单纯PDT处理组相比,加入维拉帕米的PDT处理组内牙菌斑内致龋菌存活数量有上升趋势.其中先加入维拉帕米后加入光敏剂PDT处理组牙菌斑内致龋菌存活数量显著性上升(P＜0.05),抑菌率仅为80.92％.结论 HMME-PDT可以通过有效抑制致龋菌的生长而起到防龋的作用.细菌外排泵抑制剂对HMME-PDT抑制牙菌斑生物膜内主要致龋菌有抑制作用.
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膀胱灌注5-氨基酮戊酸诱导内生PpⅨ荧光的组织分布
目的通过膀胱灌注5-氨基酮戊酸(5-ALA)探讨其所诱导产生内源性PpⅨ在膀胱组织中分布及不同病变表达上的差异.方法 20例无痛性肉眼血尿患者行荧光膀胱镜检查.以50 ml 5-ALA缓冲液膀胱灌注,2～3 h后置入荧光膀胱镜,用光动力学诊断系统进行荧光膀胱镜检,采用407 nm激发光照射膀胱壁,对产生荧光的红色区域及非荧光的蓝色区域分别进行标记活检,取活检组织做快速冰冻切片,每块组织均做2份,1份用HE染色进行组织病理学检查,另1份用甘油封闭后在激光共聚焦显微镜下荧光成像,分析各标本荧光分布并定量检测不同组织PpⅨ荧光含量.结果共取活检组织32处,病理检查结果,膀胱移行细胞癌共18处、良性病变12处、正常膀胱上皮2处.激光共聚焦显微镜下所见,5-ALA诱导PpⅨ荧光主要分布在组织表层,深部组织PpⅨ荧光很弱.荧光量化分析显示,表层组织荧光强度高出深部组织5～10倍,对比各样本表层组织荧光,其强度与肿瘤分级相关(G3> G1-2),而肿瘤组织平均荧光强度明显高于良性病变的平均荧光强度.结论 (1)由于PpⅨ荧光主要分布在组织表层,荧光膀胱镜检只能发现表层的病变,因此对于位于正常膀胱黏膜下的病变进行荧光诊断可能无价值,在荧光膀胱镜指示下行经尿道切除术(TUR)时,对于切除深度无指导意义.(2)5-ALA诱导荧光膀胱镜检对膀胱癌诊断特异性尚不高,但量化荧光强度可区分良、恶性病变,从而提高荧光膀胱镜检对肿瘤诊断的特异性.(3)PpⅨ可作为肿瘤标志物来判断肿瘤生物学行为.(4)激光共聚焦显微镜及其图像分析系统对于膀胱肿瘤光动力学诊断(PDD)临床应用价值的分析是一个很有用的工具.
