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皮肤创伤愈合过程中TGF-β1mRNA表达与损伤时间关系的实验研究
目的研究TGF-β1mRNA在皮肤创伤愈合中的表达变化规律及其在损伤时间推断中的价值.方法用实时PCR技术检测不同造创时间(生前伤15 min～2周,死后伤1～6h)小鼠皮肤切创创缘组织TGF-β1mRNA含量,并同时检测GAPDH含量对结果进行均一化.结果TGF-β1mRNA于伤后24 h显著增高(和对照组比较P＜0.01),48 h和72 h时还保持在较高水平.死后伤1 h和3 h时,TGF-β1mRNA的表达有增高的趋势,6 h则降至对照水平.结论TGF-β1mRNA在小鼠皮肤创伤后有明显的规律性表达,能作为一种代表性细胞因子参与有一定存活时间(6 h以上)的生前伤损伤时间的推断.实时PCR技术能对mRNA的表达水平进行较为精确的检测,是目前损伤时间推断研究中用于细胞因子定性和定量研究的有效方法.
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慢性乙型肝炎患者CXC趋化因子Mig的表达
目的 探讨慢性乙型肝炎(乙肝)患者CXC趋化因子Mig的表达水平及其与HBV-DNA、丙氨酸转氨酶(ALT)的相关性.方法 以实时PCR法动态检测慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC)内Mig mRNA的表达水平,以趋化因 子与GAPDH比值为其终含量.以ELISA法定量检测患者外周血中Mig蛋白含量.结果 慢性乙肝患者PBMC内Mig mRNA表达水平为0.6883±0.0693,与正常对照组相比差异有显著性(P＜0.001).Mig血清浓度为(609.6±73.8)pg/ml,与正常对照组相比差异有显著性(P＜0.05).患者PBMC内Mig mRNA与其外周血中Mig含量显著相关(r=0.7157,P＜0.001),外周血中Mig含量与血清ALT水平显著相关(r=0.7220,P＜0.001),外周血中Mig含量与血清中HBV-DNA含量显著相关(r=0.7266,P＜0.001).结论 慢性乙肝患者Mig mRNA及血清Mig含量表达均增高,Mig介导了肝脏炎症细胞浸润,参与了乙肝慢性化病程.
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血清中HBV cccDNA定量检测方法的建立及临床应用
目的 建立一种以TaqMan为探针检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)的实时定量PCR检测方法.方法 根据rcDNA与cccDNA结构差异,在缺口两侧设计引物,应用TaqMan探针分析,对实时PCR产物进行克隆、测序以证实产物为目的 片段;同时对89例符合病毒性乙型肝炎诊断标准的血清样本进行HBV cccDNA和HBV DNA含量检测,3例未感染乙肝病毒的血清作为阴性对照.结果测序结果显示扩增产物为目的 片段,检出下限为500 copies/mL;89例样本检测HBV cccDNA的阳性率为55.0%,HBeAg阳性患者阳性率为67.8%,HBeAb阳性患者阳性率为30.0%,HBeAg阳性的样本的平均HBV cccDNA水平高于HBeAb阳性的样本(P<0.05),阴性对照组未检测出HBV cccDNA.应用ROC曲线图评价HBV cccDNA在抗病毒治疗中的价值,其价值为0.927.结论以TaqMan为探针检测血清HBV cccDNA的实时PCR检测方法,具有快速、敏感、特异性高等特点,应用该方法检测HBV cccDNA含量可作为判断临床抗病毒治疗效果的重要参考指标,指导临床用药.
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实时PCR检验在高危型人乳头瘤病毒中的诊断价值分析
目的：研究高危型人乳头瘤病毒采用实时PCR检验诊断的临床价值。方法临床纳入218例我院妇产科2013年6月至2014年6月期间收治的高危型人乳头瘤病毒患者，取样后分别给予实时PCR和第二代杂交式捕获法（HCⅡ)检验，同时结合患者的病理资料，对比分析两种检验方法的准确性和特异性。结果76例患者有不同程度的宫颈上皮内瘤病变（CIN)，73例患者有鳞状上皮病变和慢性宫颈炎。实时荧光PCR检验鳞状上皮病变和慢性宫颈炎的阳性检出率为58.9%，显著优于HCⅡ检验的35.6%，实时荧光PCR检验的HPV阳性检出率为71.6%，明显优于HCⅡ的阳性检出率62.4%（P<0.05)；而二者对CIN-HPV各期的阳性检出率比较无统计学差异， P>0.05。结论实时PCR检验高危型人乳头瘤病毒具有较好的特异性和灵敏性，临床诊断价值明显，值得应用和推广。
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广西河池地区不同类型乙型肝炎患者HBV基因分型研究
目的:了解河池地区乙型肝炎病毒基因型分布特征,探讨HBV各基因型与血清HBV DNA水平之间的关系.方法:采用实时PCR技术,对广西河池地区140份乙型肝炎患者血清中的HBV DNA进行基因分型和定量检测.结果:140例血清中,C型94例(67.2%),B型32例(22.9%),B、C混合型7例(5.1%),A型1例(1.0%) ,D型1例(1.0%).B型、C型与B、C混合型患者在HBV DNA水平上没有显著差异(P>0.05).C型在慢性乙型肝炎患者中的所占比例(72.3%)比在急性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者中所占的比例较高,但差异无统计学意义.结论:河池地区HBV基因型以C型为主、B次之,B、C混合型较少,A型、D型极少;各基因型患者在HBV DNA水平上没有显著差异.
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肝细胞与骨髓间质干细胞共移植提高移植效率
目的:探讨肝细胞与骨髓间质干细胞(MSC)共移植提高肝细胞移植效率的可行性.方法:分为共移植组、肝细胞移植组和移植对照组,分别将雄性小鼠肝细胞与雌性小鼠MSC(1∶1)、雄性小鼠肝细胞与雌性小鼠肝细胞(1∶1)、雄性小鼠肝细胞与雌性裸鼠肝细胞(1∶1)植入雌性裸鼠脾脏,14 d后,应用实时荧光定量PCR技术检测受体肝脏中Y染色体性别决定区(sex-determining region Y,Sry)基因；并由标准曲线计算出移植细胞在受体肝脏中的比例.结果:共移植组Sry的含量明显比其他两组为高[(32.04±0.36)vs(36.97±0.66),P=0.030；(32.04±0.36) vs(35.50±0.62),P=0.045],肝细胞移植组与移植对照组无明显差异[(36.97±0.66)vs(35.50±0.62),P=0.837]；共移植组整合的移植肝细胞仅占受体肝脏的(1.09±0.01)％.结论:肝细胞与骨髓间质干细胞共移植较单一移植可以提高肝细胞的移植效率.
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改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O157:H7
目的建立改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O157:H7的快速方法. 方法根据GenBank公布O157:H7的rfbE保守序列,设计一对引物和改良分子信标探针,用FAM荧光剂标记探针的5'端,建立改良分子信标实时PCR检测O157:H7的反应体系,应用于食物中毒快速诊断和食品微生物检测. 结果共检测11种细菌,只有大肠杆菌O157:H7有荧光信号,其余10种全无荧光信号,且与其他细菌无交叉反应,DNA灵敏度为64fg,菌液灵敏度为59cfu/ml或2cfu/PCR反应体系.应用改良分子信标实时PCR反应体系检测10株O157:H7均出现特异的荧光信号,无干扰.对89份食品样品进行检测,5份O157:H7实时PCR阳性,其余样品为阴性,检测仅需2h.5份阳性样本,经传统方法培养,有3份检出大肠杆菌O157:H7. 结论改良分子信标实时PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于大肠杆菌O157:H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段.
关键词： 大肠杆菌O157:H7 改良分子信标 实时PCR -
改良分子信标-实时PCR快速检测霍乱弧菌
目的建立改良分子信标-实时PCR检测霍乱弧菌的快速方法,应用于霍乱监测.方法根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)的保守序列,设计一对引物和改良分子信标探针,并进行特异性和灵敏度分析;同时以11种细菌作对照,建立改良分子信标检测霍乱孤菌的实时PCR反应体系,应用于霍乱监测.结果霍乱弧菌改良分子信标检测体系检测12种细菌,只有霍乱弧菌有荧光信号,与其他细菌无交叉反应,DNA灵敏度为102.4fg/ul,菌液灵敏度为32cfu/ml或3 cfu/PCR反应体系.对100份海产品和30份腹泻病人大便标本进行检测,结果都为阴性.检测时间仅需2h.结论改良分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于霍乱的快速诊断,为霍乱的分子流行病学调查提供新的检测手段.
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实时定量HSVPCR实验中一种内参的建立
目的 建立一个内参用于单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)HSVl、HSV2的PCR诊断实验.方法 用HSV的质粒嵌合引物两步PCR扩增质粒DNA和HSV的引物获得HSVPCR诊断实验的内参.结果 内参混合到含8份HSVI和9份HSV2(总共17份)的阳性组织培养中,发现内参对靶序列没有抑制或很少抑制.对272份临床标本加入内参或没有内参扩增的结果有非常好的一致性.结论 该内参可以用于常规PCR检测HSV,对于发现实验过程是否存在抑制物具有指示意义.
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实时荧光PCR和普通PCR方法检测病原微生物的灵敏度比较
目的 通过比较两种PCR检测的灵敏度,选择不同条件下经济准确的方法检测病原微生物.方法 制备标准样品用以两种PCR扩增条件的确定,通过目的基因片段设计引物,扩增菌体裂解液上清.PCR产物分别通过扩增曲线和琼脂糖电泳检测目的条带的存在,以低检测的条带浓度作为两种不同PCR检测的高灵敏度,通过比较,选择在不同的限制条件下较为方便经济的方法检测病原微生物.结果 实时PCR中裂解菌液上清经过10-8倍稀释后仍能观测到扩增曲线的存在.而普通PCR产物经过琼脂糖电泳染色后观测只能观测到10-5浓度的条带,灵敏度远不及RT-PCR.结论 荧光PCR检测灵敏度较高,普通PCR琼脂糖电泳方法只能达到RT-PCR检测灵敏度的一半但比较经济.
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实时PCR检测卵巢癌石蜡块组织中Her-2/neu的新方法
目的探索检测卵巢癌石蜡块组织中Her-2/neu状态的新方法.方法选取69例卵巢癌组织蜡块,用实时PCR检验卵巢癌组织中的Her-2/neu基因的扩增情况,用免疫组化检测其蛋白表达情况,将两者结果进行比较,并用FISH试验来验证其结果.结果肿瘤组织中Her-2/neu的扩增如果以相对基因拷贝数(肿瘤细胞内基因拷贝数与正常二倍体卵巢组织细胞基因拷贝数的比率)≥1.5或≥2为截取值,本组卵巢癌组织中Her-2/neu的扩增率分别为26.1%(18/69)、15.9%(11/69);本组卵巢癌组织中Her-2/neu免疫组化为+ +～+ + +者为28.99%(20/69);两种检测方法的结果具有很高的一致性.结论实时PCR简便、客观、高效,可望成为卵巢癌石蜡组织中除免疫组化外检测Her-2/neu变化的一种备选方法.
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microRN A-141在结肠癌中的表达分析研究
目的：分析microRNA141（miR‐141）在结肠癌组织中的表达及意义。方法采用荧光定量 PCR（SYBR Green）法检测48例结肠癌组织和对应癌旁正常组织中miR‐141的表达。结果 miR‐141在结肠癌组织中的相对表达量为5．19±0．52，与对应癌旁正常组织1．01±0．13比较差异有统计学意义（P＜0．05）；随着结肠癌分化程度的降低结肠癌组织中miR‐141的表达增高；miR‐141在淋巴结转移组的相对表达量为6．05±0．14，在淋巴结无转移组中为4．30±0．23，差异有统计学意义（ P＜0．05）。结论 miR‐141高表达可能与结肠癌的分化程度和淋巴结有无转移有关。miR‐141的出现为结肠癌的研究提供了新的切入点。
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新型细菌耐药基因NDM-1实时PCR检测方法的建立
目的 建立灵敏、特异、快速的TaqMan荧光定量PCR方法用于快速检测新型细菌耐药基因NDM-1.方法 根据NCBI数据库中β-内酰胺酶类相关耐药基因的序列,详细进行比对,选择特异性高的片段设计引物和TaqMan探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光PCR方法.对所建立的实时荧光PCR检测方法进行灵敏度和特异度评价.结果 本方法对各种细菌病原体的新型细菌耐药基因NDM-1的检测具有高度特异性和灵敏度.优化后的引物浓度为200 nmol/L,探针浓度为100 nmol/L,灵敏度和特异度均为100％.该方法的检测下限能达到1.0×102拷贝/μl,远远高于普通PCR1.0×105拷贝/μl的检测下限.结论 所建立的方法能够特异和敏感地检测携带NDM-1基因的超级细菌,能够作为携带有该基因细菌的灵敏快速的检测方法.
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产单核李斯特菌的改良分子信标荧光PCR-磁捕获快速检测体系的建立
[目的]建立改良分子信标荧光PCR-磁捕获快速检测产单核李斯特菌(LMO)的体系,应用于食品中LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断. [方法]根据GenBank公布的LMO hlyA基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标荧光PCR检测体系.运用磁捕获材料对PCR检测阳性的增菌液进一步处理后划平皿做分离培养. [结果]改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为110 fg,菌液灵敏度为99 cfu/ml或4 cfu/PCR反应体系,无交叉反应.以此反应体系检测28株LMO,均出现特异的荧光信号.对228份食品进行LMO检测,8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性.用磁捕获材料处理此8份增菌液,全部细菌培养阳性,高于国标法的6份阳性.[结论]改良分子信标一实时PCR反应体系快速、灵敏度高,特异性强,运用磁捕获试剂能有效提高培养阳性率.应用该检测系统能提高LMO的检出率和准确性.该系统可应用于LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断.
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利用正交设计优化脑膜炎奈瑟氏菌Taqman-MGB探针检测反应体系
[目的]建立Taqman-MGB探针检测脑膜炎奈瑟氏菌的佳反应体系,探讨影响Taqman-MGB探针检测的多个因素.[方法]利用正交设计,从Buffer、 Taq DNA聚合酶、引物、Mg2+、探针、dNTP 6种因素对实时荧光PCR体系进行优化,在此基础上,进一步细调,寻求实时荧光PCR反应的佳反应体系.[结果]正交试验结果表明,佳反应体系为(50μl): Mg2+ 7.0mmol/L,引物0.6μmol/L, dNTP 300μmol/L, Taq DNA聚合酶2.0U,探针0.1μmol/L, Buffer 1.5×.[结论]Md2+是影响实时荧光PCR的重要因素;所得体系反应稳定,正交法实验设计高效、快捷,科学性强,值得推广.
关键词： 脑膜炎奈瑟氏菌 TaqMan-MGB探针 正交设计 实时PCR 条件优化 -
双重实时荧光PCR快速检测O157大肠杆菌的初步研究
[目的]建立双重实时PCR体系,实现对O157大肠杆菌rfbE和stx2基因的同步检测.[方法]根据GenBank公布的O157大肠杆菌rfbE和stx2基因序列,应用分子生物学软件设计两对引物和TaqMan探针,并对荧光定量PCR反应条件进行优化,建立实时荧光定量PCR检测O157大肠杆菌的反应体系,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行了评价.[结果]所有O157大肠杆菌菌株的检测结果均为阳性,而所有其他菌株检测结果均为阴性;该方法对O157大肠杆菌纯培养的检测范围为100～106 cfu/μl,重复性检测的变异系数均小于5%.对模拟污染牛奶样本的检测范围为102～106 cfu/μl.从细菌核酸提取至完成检测约需3 h.[结论]基于Taqman探针技术的实时PCR检测体系可同步检测O157大肠杆菌rfbE和stx2基因,具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,可用于O157大肠杆菌食物中毒的快速诊断和食品微生物检测.
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改良分子信标—实时PCR快速检测副溶血弧菌
目的:建立改良分子信标-实时PCR检测副溶血弧菌的快速方法,应用于副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验.方法:根据GenBank公布副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因(TDH)的保守序列,设计一对引物和改良分子信标探针,用FAM荧光剂标记探针的5′,并进行特异性和灵敏度分析;同时以11种细菌作对照,建立改良分子信标检测副溶血弧菌的实时PCR反应体系,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和食品微生物检测.结果:检测1 2种细菌,只有副溶血弧菌有荧光信号,与其他细菌无交叉反应,DNA灵敏度为1 66.6 fg/μl,菌液灵敏度为69 cfu/ml或6 cfu/PCCR反应体系.改良分子信标-实时PCR反应体系检测40株副溶血弧菌均出现特异的荧光信号,无干扰.对3起细菌性食物中毒共48份样品和100份海产品进行检测,9份副溶血弧菌实时PCR阳性,其中7份副溶血弧菌细菌培养阳性,其余样品都为阴性.检测时间仅需2 h.结论:改良分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于副溶血弧菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段.
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槲芪散及其君药槲寄生提取物对人肝癌细胞生长和端粒酶活性的影响
目的:研究槲芪散及其君药槲寄生对人肝癌细胞生长和端粒酶活性的影响.方法: 用不同浓度的槲芪散及其君药槲寄生提取物作用于人肝癌细胞(SMMC-7721)后,用四甲基偶氮唑比色法(MTT)检测SMMC-7721细胞增殖.用实时荧光定量PCR法检测SMMC-7721的端粒酶活性.结果: (1)MTT结果显示槲芪散、槲寄生多糖和总碱能抑制SMMC-7721细胞,随药物作用时间的延长作用增强.(2)槲芪散、槲寄生多糖和槲寄生总碱能明显降低SMMC-7721端粒酶的活性.结论: 槲芪散及槲寄生多糖和总碱均能抑制SMMC-7721增殖,降低SMMC-7721端粒酶的活性.
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熔解曲线分析法用于RHD1227G＞A基因分型的实验研究
目的 建立用于RHD 1227G＞A基因分型的熔解曲线分析法.方法 设计合成RHD 1227G＞A等位基因特异性引物和公共引物,并在2条等位基因特异性引物5'端加上不同长度的GC序列.在实时PCR反应后,进行熔解曲线分析,依据PCR产物熔解温度的差异,对RHD 1227G＞A基因分型.将建立的熔解曲线分析法与常规的PCR-SSP法比较.对于2种方法检测结果不符的标本,进行RHD基因第9外显子测序,确定该标本为RHD 1227G＞A基因型.结果 应用熔解曲线分析法对84例标本进行基因分型,其中RHD 1227A+/G-32例,1227A-/G+ 22例,1227A+/G+6例,1227A-/G-24例.发现2例标本熔解曲线法检测的基因型为1227A+/G-,而PCR-SSP法检测结果为1227A +/G+.经基因测序证实这2例标本结果是1227A+/G-.结论 用于RHD 1227G＞A基因分型的熔解曲线法具有操作简单、快速、准确等优点,优于常规的PCR-SSP法.
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TaqMan-MGB探针实时PCR用于Duffy血型基因分型的研究
目的 应用TaqMan-MGB探针实时PCR技术,建立1个Duffy血型基因分型的新方法,了解大连地区汉族人群Duffy血型等位基因频率分布特征.方法 设计并合成TaqMan-MGB探针实时PCR的引物和探针,应用Taq-Man-MGB探针实时PCR对120例健康献血者的Duffy血型进行基因分型,对其重复性和低检出限进行评价.并将该法和传统的等位基因特异性引物PCR (PCR-ASP)方法进行比较.结果 TaqMan-MGB探针实时PCR方法和PCR-ASP法对Duffy血型的基因分型结果是完全一致的.TaqMan-MGB探针实时PCR再次分型结果和初次基因分型的结果是完全一致的.TaqMan-MGB探针实时PCR的低检测限是100 pg.大连汉族人群Duffy血型FY*A基因频率为93.3％,FY*B的基因频率为6.7％,其基因分布特点和国内其他地区汉族人群相似,无显著性差异(P＞0.05),但与浙江畲族相比,有显著性差异(P＜0.05).Fya和Fyb抗原不配合几率为0.1167.结论 应用TaqMan-MGB探针实时PCR技术建立的Duffy血型基因分型方法具有快速、简单、准确、灵敏、重复性好、通量高等特点,优于传统的PCR-ASP法.
