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HBV S基因反义锁核酸抑制病毒体外复制
目的 探讨乙型肝炎病毒S基因反义锁核酸(LNA)片段在HepG_22.2.15细胞内的抗病毒效果及有效LNA片段筛选.方法 设计合成互补于HBV S基因mRNA翻译起始区同一位点的4条不同序列长度LNA片段,以阳离子脂质体介导,作用于HepG_22.2.15细胞株,采用ELISA法和实时荧光定量聚合酶链技术(FQ-PCR)分别监测24、48和72 h细胞培养上清液中HBsAg和HBV DNA的含量;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法监测细胞代谢.结果 4条不同序列长度反义LNA均显著抑制HBsAg表达和HBV DNA复制,72 h后高抑制率分别达72.43%和34.73%.HBsAg分泌量和HBV DNA的拷贝数均明显低于对照组(P<0.01).LNA对细胞代谢无明显影响.结论 针对HBV S基因mRNA翻译起始区的反义LNA片段体外能显著抑制HBV表达,且抑制作用强序列长度在15～25个碱基之间.
关键词： 乙型肝炎病毒 锁核酸 HepG_22.2.15细胞 基因治疗 阳离子脂质体 -
反基因锁核酸体外阻断肝癌细胞系乙肝病毒S基因表达
目的 探讨针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区的锁核酸体外抑制细胞内病毒复制的效果.方法 针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体介导,体外转染HepG2.2.15细胞,采用荧光定量聚合酶链反应技术和时间分辨免疫荧光技术分别监测2、4、6、8和10 d细胞培养上清液中HBV DNA、HBsAg和HBeAg的含量;四甲基偶氮唑蓝法检测锁核酸对细胞代谢的影响.结果 加入锁核酸后,对细胞内HBV DNA复制、HBsAg与HBeAg表达均有较明显的时间和剂量依赖性抑制作用,6d后抑制率分别为52.14％、57.48％和29.63％.锁核酸对细胞代谢无明显影响.结论 针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区的锁核酸,体外能有效抑制乙肝病毒的复制,既为乙肝病毒治疗提供有效靶位,也为反基因治疗提供理论和实验依据.
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反基因锁核酸体外抑制乙肝病毒前S1基因表达
目的 探讨针对乙肝病毒前S1基因同聚嘌呤区的锁核酸体外抑制细胞内病毒复制的作用.方法 针对乙肝病毒前S1基因同聚嘌呤区,利用RNA structure软件分别设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体介导转染HepG2.2.15细胞,采用荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)、时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)和酶联免疫法(ELISA)分别监测1、3、5和7d细胞培养上清液中HBV DNA、HBsAg和前S1抗原的含量；四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测锁核酸对细胞代谢的影响.结果 加入锁核酸后,对HBV DNA复制、HBsAg和前S1抗原表达均显示有较强的抑制作用,且抑制率随时间呈增高趋势,7d后抑制率分别达65.99％、67.49％和63.88％.LNA对细胞代谢无明显影响.结论 针对乙肝病毒前S1基因同聚嘌呤区的反基因锁核酸,体外能有效抑制乙肝病毒的复制,既为乙肝病毒治疗提供有效靶位,也为反基因治疗提供理论和实验依据.
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锁核酸研究进展
锁核酸(locked nucleic acid, LNA)是一种新型的寡核酸衍生物,结构中β-D-呋喃核糖的2' -O,4' -C位通过缩水作用形成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,呋喃糖的结构锁定在C3' 内型的N构型,形成了刚性的缩合结构.LNA作为一种新的反义核酸,具有与DNA/RNA强大的杂交亲和力、反义活性、抗核酸酶能力、水溶性好及体内无毒性等优点.LNA在基因诊断和基因治疗上有很多优势,如:单链核酸的多态性基因分型、LNA寡聚体具有高效抑制端粒酶活性及LNA修饰的DNA核酶(LNAzymes)高效清除高级结构的RNA等,有良好的应用研究前景.
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锁核酸捕获TaqMan探针实时聚合酶链反应构建及检测乙型肝炎病毒DNA
建立和检测新型乙型肝炎病毒(HBV)DNA检测技术锁核酸(LNA)捕获TaqMan探针实时聚合酶链反应(PCR)。方法 2009年8月至2010年3月选取本院20例健康献血者和肝病专科住院的75例经COBAS Amplicor检测HBV DNA阳性慢性乙型肝炎(CHB)患者,分别采集血液样本进行LNA捕获TaqMan探针实时PCR特异性试验。同时对LNA-实时PCR方法的重复性、特异性和线性范围等进行分析。结果 其线性范围为10～2.3×109 IU/ml。将10 IU/ml作为检测下限,具有95％可信区间。线性回归分析显示其斜率接近1.0 (R2=0.999)。批内变异值为3.88％～4.36％,批间变异值为8.5％～11.7％。20例健康献血者的阴性对照血清HBV-DNA检测均为阴性,而75例经COBAS Amplicor检测HBV DNA阳性患者的血清样本除1例阴性外,其余都为阳性。结论 LNA捕获TaqMan探针实时PCR方法为HBV-DNA检测的一种快捷灵敏、准确度高的新方法,值得临床实验室推广应用。
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TaqMan-LNA探针多重实时荧光定量PCR检测炭疽芽胞杆菌的研究
目的 设计检测多个靶基因的炭疽多重荧光定量PCR反应系统,建立快速准确的基因诊断方法,解决蜡样芽胞菌群基因诊断交叉反应问题. 方法 选择炭疽杆菌PX01毒素质粒基因pagA,PX02毒素质粒基因capB,以及染色体上的前噬菌体λBa03基因PL3作为靶基因,利用在线荧光定量PCR引物设计软件设计、优化多重PCR引物以及相应的TaqMan探针序列,对探针进行LNA标记并优化荧光PCR反应体系,构建多重实时荧光定量PCR反应系统.以3对引物PCR扩增并克隆靶基因的质粒标准品,倍比稀释后进行敏感度试验,以炭疽、蜡样芽胞杆菌、苏云金杆菌、蕈状杆菌以及常见肠道致病菌进行特异度试验,利用炭疽弱毒株污染土壤及奶粉进行模拟检测. 结果 TaqMan-LNA多重实时荧光定量PCR可迅速检出3个炭疽杆菌靶基因,常用的探针法荧光定量PCR反应液均适用;pagA、CapB、PL3基因克隆标准品序列正确;该方法对pagA、CapB、PL3基因的检出限分别为63、398、114copies/μl,且仅检出炭疽杆菌基因,其余4种蜡样芽胞菌扩增均阴性.土壤及奶粉样品检测均阳性,其中pagA近检出限为6.6×104/ml,PL3基因检出限为6.6×105/ml. 结论 TaqMan-LNA多重实时荧光定量PCR方法具有适用性广,检测迅速,灵敏度及特异度高等特点,能够将炭疽杆菌与蜡样芽胞菌群中其他细菌相鉴别,可试用于炭疽杆菌的感染检测.
关键词： 炭疽 TaqMan-LNA探针 多重实时荧光定量PCR 锁核酸 前噬菌体 -
锁核酸捕获TaqMan探针实时PCR和PCR-RFLP检测乙型肝炎病毒基因变异的研究
目的 评价锁核酸捕获TaqMan探针实时聚合酶链反应(PCR)和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测乙型肝炎病毒(HBV)基因变异的特点.方法 分别用直接测序法、锁核酸(LNA)捕获TaqMan探针实时PCR和PCR-RFLP检测77例接受拉米夫定(LAM)治疗6个月以上的慢性乙型肝炎患者的血清样本.结果 锁核酸捕获TaqMan探针实时PCR和PCR-RFLP都能检测HBV野生型YMDD及其变异型YIDD和YVDD.此外,两种方法尚能鉴定HBV野生型和变异型混合种群.更为重要的是,在检测HBV野生型和变异型共生变异方面,锁核酸捕获TaqMan探针实时PCR比PCR-RFLP更敏感、更省时.结论 锁核酸捕获TaqMan探针实时PCR是一种检测HBV YMDD变异的灵敏度和特异性都高的快速法,在监测HBV患者LAM抗病毒治疗的疗效及发现新耐药病毒基因型等方面具有广泛的应用前景.
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核苷酸衍生物相关技术在分子诊断中的应用与展望
近年来,一些人工合成的核苷酸衍生物,包括肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)、锁核酸(locked nucleic acid,LNA)、己糖醇核酸(hexitol nucleic acid,HNA)等开始在分子诊断领域中得以应用[1].与普通的核苷酸(DNA、RNA)一样,这些衍生物由A、T、C、G四种碱基组成,可通过碱基配对原则与互补的核酸序列结合.这些人工合成的核苷酸衍生物有诸多自身优势,如较高的热稳定性、酶抵抗性等.籍此,其可以明显改善普通分子生物学技术的性能特点,包括灵敏度、特异性、重复性等.譬如,利用3’端LNA修饰的引物可显著提高单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测的特异性,利用PNA夹止技术的抑制作用,可选择性扩增高野生背景中的少量突变[2,3].
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LNA 探针实时荧光定量 PCR 检测HBV DNA 的研究
目的建立一种LAN探针实时荧光定量PCR检测血清/血浆中乙型肝炎病毒（ HBV） DNA的方法。方法建立LAN探针实时荧光定量PCR准确定量检测HBV DNA的方法，以TaqMan探针法为对照，进行LNA针实时PCR的方法学评价。用LNA探针法和TaqMan探针法两种方法检测39例慢性乙型肝炎患者血清样品，对检测结果进行比较。结果相对于普通的TaqMan探针法，LAN探针实时荧光定量PCR检测HBV DNA具有更宽的检测范围、更高的灵敏度、稳定性、扩增效率和更低的探针浓度。在15例单纯HBsAg （＋）标本中，有4例TaqMan探针实时PCR检测为HBV DNA为阴性，LNA探针法检测为阳性（ P＜0.05）。应用LNA探针法和TaqMan探针法检测35份HBV DNA阳性血清样本，结果表明LNA探针法和TaqMan探针法具有很好的可比性（ r＝0.9636，P＜0.05）。结论 LNA探针实时PCR比TaqMan探针法有更高的灵敏度、稳定性、扩增效率和较低浓度的探针浓度，是一种更为可靠的检测HBV DNA的方法。
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HBV preS1反基因锁核酸的设计及体外对病毒复制的抑制
目的:探讨针对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV) preS1 dsDNA同聚嘌呤区设计反基因锁核酸分子,并观察其在HepG2 2.2.15细胞内抑制病毒复制的效果.方法:针对HBV preS1 dsDNA的2 941-2 962 nt、3 015-3 036 nt和3 089-3 110 nt三个同聚嘌呤区,利用RNA structure软件分别设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体介导转染HepG2 2.2.15细胞,采用荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)和时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)分别监测1、3、5和7d细胞培养上清液中HBV DNA和HBsAg的含量；四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测锁核酸对细胞代谢的影响.结果:反基因锁核酸对细胞内的HBV DNA复制与HBsAg表达有明显的抑制作用,且抑制率随时间呈增高趋势,7d后抑制率分别为64.32％和67.51％.各实验组与对照组比较差异均具有统计学意义(均P＜0.05),而封闭2 941-2 962 nt同聚嘌呤靶区的LNA抑制作用强,且适序列长度为20-30 bp.LNA对细胞代谢无明显影响.结论:针对preS1 dsDNA同聚嘌呤区的反基因锁核酸分子,体外能有效抑制HBV的复制,以封闭2 941-2 962 nt靶位效果强,且合适序列长度为20-30 bp.
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针对HBV S基因mRNA反义锁核酸设计及其在2.2.15细胞内的抗病毒作用
目的:探讨针对乙型肝炎病毒(HBV)S 基因翻译起始区反义锁核酸(LNA) 片段在HepG22.2.15 细胞内抗病毒效果及有效LNA 序列筛选. 方法:设计合成互补于HBV S 基因mRNA 翻译起始区同一位点的4条不同序列长度LNA 片段及无关对照序列,以阳离子脂质体介导,作用于HepG22.2.15 细胞,采用ELISA 法和FQPCR 法分别监测24 、48 和72 h 细胞培养上清液中HBsAg 和HBV DNA 的含量;MTT 法检测LNA 对细胞代谢的影响. 结果:4条不同序列长度(10 、15 、20 及25 个碱基)的反义LNA 对HBsAg 的表达和HBV DNA 的复制均有显著性抑制作用,72h 后的抑制率分别为46.58% 、54.38% 、72.43% 、69.92% 及27.09% 、28.77% 、34.71% 、32.68%,且抑制率随时间呈增高趋势. LNA 对细胞代谢无明显影响. 结论:针对HBV S 基因mRNA 翻译起始区的反义LNA 短序列体外能显著抑制HBV 基因的表达,且抑制作用强的序列长度应在15-25 个碱基之间.
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HBV S编码链的反基因锁核酸对转基因小鼠体内病毒复制与表达的影响
目的探讨针对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)S编码链的反基因锁核酸(anti-gene-locked nucleic acid,Anti-G-LNA)在转基因小鼠体内的抗病毒效果.方法将30只HBV转基因小鼠随机分为5组(n=6),分别为空白对照组(Control)(5％GLU+脂质体)、无关序列对照组(USQ)、拉米夫定对照组(LAM)、反义锁核酸对照组(Anti-S-LNA)、反基因锁核酸组(Anti-G-LNA).拉米夫定组用灌胃法;锁核酸经尾静脉注入小鼠体内.采用实时荧光定量PCR检测血清乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA);酶联免疫法检测血清乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg);逆转录PCR检测肝脏乙型肝炎病毒S基因mRNA(HBV S mRNA)水平;免疫组织化学检测肝细胞HBsAg水平.结果治疗后的第3、5、7天,反基因锁核酸对HBV DNA抑制率分别为37.18％、50.27％、61.46％,HBsAg抑制率分别为30.17％、44.00％、57.76％,与给药前比较有统计学意义(P＜0.05),与各对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).HBV S基因mRNA的相对表达量为0.33、肝细胞HBsAg阳性细胞率为31％,与对照组相比有统计学意义(P＜0.05);肝肾功能检查和组织HE染色未发现异常改变.结论针对HBV S编码链设计的反基因锁核酸在转基因小鼠体内具有较好的抗病毒效果,为HBV基因治疗提供理论依据和实验基础.
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HBV preS2反义锁核酸在HepG22.2.15细胞内的抗病毒效果
目的:探讨针对HBV preS2基因mRNA翻译起始区的反义锁核酸(LNA)片段在2.2.15细胞内抗HBV复制和表达的作用.方法:分别合成三段互补于HBV preS2基因mRNA翻译起始区同一靶位的反义锁核酸、全硫代反义寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体作为载药体系,作用于HepG22.2.15细胞,采用时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)和荧光定量聚合酶链技术(FQ-PCR)动态检测细胞上清液中HBsAg和HBV DNA的含量,并比较其抑制HBV DNA复制与表达的作用;以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测LNA对细胞的毒性.结果:加入LNA后第1天,即出现对HBsAg表达和HBV DNA复制的抑制作用,第7天,未修饰反义寡核苷酸组、全硫代修饰反义寡核苷酸组、反义锁核酸组对HBsAg表达的抑制率分别达45.79%、52.92%和67.21%;对HBVDNA复制的抑制率分别达35.15%、40.69%和52.16%.其中LNA抑制病毒活性强且对细胞代谢无影响.各组与对照组比较均有显著性差异(均P<0.01),且反义LNA组与其他ASODN组比较也有显著性差异(均P<0.05).结论:针对preS2基因的反义锁核酸体外能有效抑制HBV的复制与表达,故preS2基因可作为乙型肝炎基因治疗的有效靶位.
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治疗用单链寡核苷酸药物的非临床研究评价概述
单链寡核苷酸(single-stranded oligonucleotide,SSO)是一种人工合成寡核苷酸,可按碱基互补配对原则主要通过与靶RNA杂交,诱导断裂、调节剪切、抑制翻译等作用抑制靶RNA功能.未经修饰的SSO易被核酸酶降解,经化学修饰的SSO(如经锁核酸修饰后的SSO)其稳定性、杂交亲和力及酶切效率大大提高,成药性显著增强.目前,已有4个治疗用SSO药物在美国或欧洲上市,更多的候选药物处于研发阶段.本文从监管、非临床特点、非临床安全性试验一般原则等方面阐述治疗用SSO药物的非临床研究评价要点.
关键词： 治疗用单链寡核苷酸药物 锁核酸 非临床研究评价 -
评价AS-LNA-qPCR法检测JAK2 V617F突变率的临床应用价值
目的 建立一种定量检测外周血细胞酪氨酸激酶2(JAK2)基因V617F突变率的等位基因特异性实时荧光定量PCR(AS-qPCR)方法.方法 在AS-qPCR基础上,引入1条锁核酸(LNA)修饰的寡核苷酸探针,用以选择性抑制AS-qPCR中突变引物对野生等位基因的非特异性扩增,定量检测JAK2 V617F突变率,称之为AS-LNA-qPCR法.通过AS-LNA-qPCR法测定样本的循环阈值(Ct值),根据AS-LNA-qPCR法检测不同JAK2 V617F突变率标准品的Ct值,绘制标准曲线,根据标准曲线直接获得检测样本中JAK2 V617F突变率.我们对该方法标准品的批内、批间检测结果进行了评价,并对623名表观健康人外周血细胞基因组DNA中JAK2V617F突变进行检测,以探讨其临床应用价值.结果 AS-LNA-qPCR法定量检测JAK2 V617F突变率的下限可达到0.01％,批内、批间平均变异率分别是6.3％和8.6％.对623名表观健康人外周血细胞基因组DNA中JAK2 V617F突变检测显示,其中19名(3％)表现健康人JAK2 V617F突变阳性,突变率变化范围为0.01％ ～5.49％.结论 AS-LNA-qPCR方法直接定量检测外周血细胞JAK2 V617F突变率,具有检测灵敏度高和重复性好的特性,适合临床上用于对骨髓增殖性疾病诊断、疾病进程评估和疗效的监测.
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反基因锁核酸体外阻断乙肝病毒前S2基因表达
目的:探讨针对乙肝病毒前S2基因同聚嘌呤区的锁核酸体外抑制细胞内病毒复制的作用.方法:针对乙肝病毒前S2基因同聚嘌呤区,分别设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以半乳糖配体介导转染HepG2.2.15细胞,采用荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)、时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)和酶联免疫法(ELISA)分别监测1、3、5和7d细胞培养上清液中HBV DNA、HBsAg和前S2抗原的含量；四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测锁核酸对细胞代谢的影响.结果:加入锁核酸后,对HBV DNA复制、HBsAg和前S2抗原表达均显示有较强的抑制作用,且抑制率随时间呈增高趋势,7d后抑制率分别达61.56％、68.18％和72.82％.各实验组与对照组比较差异均具有统计学意义(均P＜0.05).LNA对细胞代谢无明显影响.结论:针对乙肝病毒前S2基因同聚嘌呤区的反基因锁核酸,体外能有效抑制乙肝病毒的复制,既为乙肝病毒治疗提供有效靶位,也为反基因治疗提供理论和实验依据.
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慢病毒介导的下丘脑中过表达miR-505小鼠模型的构建
目的:本文用慢病毒定点注射的方法构建了在下丘脑中过表达miR-505的小鼠模型,并利用荧光原位杂交方法在冰冻切片组织上快速检测miRNAs,以确认慢病毒载体介导的miR-505在丘脑中的表达能力.方法:实验小鼠在脑立体定位仪下定位到下丘脑位置,采用原位注射的方式进行慢病毒注射,注射后采用实时荧光定量RCR和应用了LNA探针和TSA系统的FISH(fluorescence in situ hybridization)技术,完成在慢病毒介导的miR-505过表达老鼠下丘脑区域细胞中的miR-505检测和示踪.结果:miR-505慢病毒注射未成年小鼠下丘脑区5、10、20和40天后,均可检测到miR-505在下丘脑区域的表达,且实验结果表明在慢病毒介导的过表达小鼠下丘脑注射部位,miR-505表达量有明显的提高.结论:利用慢病毒注射未成年小鼠下丘脑脑区的方法,成功的建立了下丘脑中过表达miR-505的小鼠模型,使用LNA标记探针的FISH方法探索miRNA表达规律较稳定,且重复率高.
关键词： 荧光原位杂交 MicroRNA原位杂交 锁核酸 酪胺信号放大系统 -
比较三种不同方式修饰的反义核苷酸对miR-125b的抑制作用
目的 探讨目前常见的甲基化、锁核酸和肽核酸三种方式修饰的反义寡聚核苷酸对miR-125b的抑制作用,寻求一种高效的、特异性的miRNA表达沉默方式.方法 分别合成甲基化、锁核酸和肽核酸三种方式修饰的反义寡聚核苷酸转染U87细胞,流式细胞仪分析转染效率,MTT评价细胞毒性,实时荧光定量PCR分析miR-125b表达水平.结果 48 h甲基化、锁核酸、肽核酸修饰的反义寡聚核苷酸使用Fugene HD转染效率无明显差异.无转染试剂共培养甲基化、锁核酸和肽核酸修饰的反义寡聚核苷酸,肽核酸修饰的转染效率均显著高于甲基化、锁核酸修饰的反义寡聚核苷酸.使用Fugene HD转染的甲基化、锁核酸和肽核酸修饰的反义寡聚核苷酸三者之间无明显毒性差异.锁核酸和肽核酸修饰的反义寡聚核苷酸对miR-125b的抑制作用显著高于甲基化；肽核酸修饰的反义寡聚核苷酸抑制能力及持续性显著高于甲基化和锁核酸修饰.结论 肽核酸修饰的反义寡聚核苷酸在抑制miRNA表达能力上具有显著的高效性、安全性和持续性.
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反基因锁核酸体内抑制HBV S基因的表达
目的 目前针对乙型肝炎的治疗仍缺乏有效治疗手段,探讨反基因锁核酸在转基因小鼠体内抑制HBV S基因的表达和抗病毒效果. 方法 采用随机数字表法将HBV转基因小鼠分为5组,每组6只,分别为空白组、无关序列组、拉米夫定组、反义锁核酸组、反基因锁核酸组.空白组、无关序列组、反义锁核酸组、反基因锁核酸组于第1、3、5d经尾静脉分别注射5%GLU-脂质体、5%GLU-脂质体-无关序列、5%GLU-脂质体-反义锁核酸、5%GLU-脂质体-反基因锁核酸各500 μL.拉米夫定组以2 mg/kg剂量每天灌胃2次,连续7 d.采用RT-PCR检测血清HBV DNA;酶联免疫法检测血清HBsAg;逆转录PCR检测肝HBV S mRNA水平;免疫组化检测肝细胞HBsAg水平;血清肝肾功能检查和组织细胞HE染色监测反基因锁核酸的毒副作用. 结果 给药后第3、5、7天,反基因锁核酸组对HBV DNA复制的的平均抑制率分别为37.18%、50.27%和61.46%,第7天的抑制作用较空白组、无关序列组、拉米夫定组、反义锁核酸组明显增强,差异有统计学意义(P<0.05).给药后第3、5、7天,反基因锁核酸对HBsAg表达的平均抑制率分别为30.17%、44.00%和57.76%,第7天的抑制作用较空白组、无关序列组、拉米夫定组、反义锁核酸组明显增强,差异有统计学意义(P<0.05).与空白组、无关序列组、拉米夫定组和反义锁核酸组比较,反基因锁核酸更能抑制HBV S基因mRNA的表达(P<0.05).空白组、无关序列组、拉米夫定组、反义锁核酸组、反基因锁核酸组阳性细胞率分别为93%、92%、78%、47%和31%,反基因锁核酸组肝组织切片中HBV HBsAg阳性细胞率明显小于拉米夫定组及反义锁核酸组(P<0.05).各组肝细胞切片中,肝组织结构和肝细胞形态正常,肾细胞切片中,各组肾小球结构完整,未见肾小球肥大,肾小球基膜和系膜基质未见明显病理改变和炎细胞浸润. 结论 反基因锁核酸在转基因小鼠体内能有效抑制HBV S基因表达,具有明显的抗病毒效果,为乙肝病毒的基因治疗提供理论依据和实验基础.
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针对HBV S基因的反义锁核酸抗乙肝病毒表达的初探
目的探讨针对HBV S基因翻译起始区的反义锁核酸(LNA)片断体外抗乙型肝炎病毒表达的作用.方法合成三段均互补于HBV S区同一位点的反义核酸片断:锁核酸、反义寡核苷酸、全硫代反义寡核苷酸及无关对照序列,作用于HepG22.2.15细胞,采用ELISA法动态检测细胞上清中HBsAg含量的变化并比较其抗HBV抗原表达作用,以四甲基偶氮唑兰(MTT)法检测LNA对细胞的毒性.结果三段反义寡核苷酸均能抑制HBsAg的表达,作用7d后抑制率分别为52%、42%、45%,其中LNA抗病毒活性强且对细胞代谢无影响,无关序列无明显抑制作用.结论针对HBV S区的锁核酸体外能有效抑制乙型肝炎病毒的表达,为乙肝的分子治疗开辟了新的前景.
