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TaqMan-LNA探针多重实时荧光定量PCR检测炭疽芽胞杆菌的研究
目的 设计检测多个靶基因的炭疽多重荧光定量PCR反应系统,建立快速准确的基因诊断方法,解决蜡样芽胞菌群基因诊断交叉反应问题. 方法 选择炭疽杆菌PX01毒素质粒基因pagA,PX02毒素质粒基因capB,以及染色体上的前噬菌体λBa03基因PL3作为靶基因,利用在线荧光定量PCR引物设计软件设计、优化多重PCR引物以及相应的TaqMan探针序列,对探针进行LNA标记并优化荧光PCR反应体系,构建多重实时荧光定量PCR反应系统.以3对引物PCR扩增并克隆靶基因的质粒标准品,倍比稀释后进行敏感度试验,以炭疽、蜡样芽胞杆菌、苏云金杆菌、蕈状杆菌以及常见肠道致病菌进行特异度试验,利用炭疽弱毒株污染土壤及奶粉进行模拟检测. 结果 TaqMan-LNA多重实时荧光定量PCR可迅速检出3个炭疽杆菌靶基因,常用的探针法荧光定量PCR反应液均适用;pagA、CapB、PL3基因克隆标准品序列正确;该方法对pagA、CapB、PL3基因的检出限分别为63、398、114copies/μl,且仅检出炭疽杆菌基因,其余4种蜡样芽胞菌扩增均阴性.土壤及奶粉样品检测均阳性,其中pagA近检出限为6.6×104/ml,PL3基因检出限为6.6×105/ml. 结论 TaqMan-LNA多重实时荧光定量PCR方法具有适用性广,检测迅速,灵敏度及特异度高等特点,能够将炭疽杆菌与蜡样芽胞菌群中其他细菌相鉴别,可试用于炭疽杆菌的感染检测.
关键词： 炭疽 TaqMan-LNA探针 多重实时荧光定量PCR 锁核酸 前噬菌体 -
荧光定量PCR同步检测人类疱疹病毒6,7,8型方法的建立
目的:建立同步检测人类疱疹病毒6,7,8型(HHV-6,-7,-8)的多重荧光定量PCR方法.方法:分别针对HHV-6,-7,-8的U67、U36、ORF65基因设计3对引物和3种Taq Man-LNA探针,构建三重荧光定量PCR反应体系,用于同步扩增HHV-6,-7,-8.分别应用HHV-6,-7,-8质粒建立对应标准曲线,并对多重荧光定量PCR方法进行线性范围、灵敏度、特异性、重复性和扩增效率等方法学评价.以DNA测序法为参考方法,检测45例疑似HHV感染者外周血单个有核细胞(PBMC)中的HHV-6,-7,-8,对多重荧光定量PCR方法进行临床特异性和敏感性评估.结果:多重荧光定量PCR方法检测HHV-6,-7,-8的线性范围均在106-1011 Copies/L,相关系数均＞0.99,灵敏度为8×105 Copies/L,低检测限为5×105 Copies/L,无非特异性扩增,线性范围内HHV-6,-7,-8的批间、批内变异系数(CV)均＜5.5％；与单重荧光定量PCR相比,检测HHV-6,-7,-8质粒含量的相关性分别为0.980,0.987,0.965.以DNA测序方法为金标准,多重荧光定量PCR检测HHV-6,-7,-8的特异性均为100％,灵敏度分别是93.1％、80％、100％.结论:多重荧光定量PCR能够对HHV-6,-7,-8进行同步、快速和准确的定量检测,将在输血安全筛查方面有着广泛的应用前景.
关键词： 人类疱疹病毒 多重荧光定量PCR TaqMan-LNA探针 输血筛查
