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恙虫病东方体环介导恒温扩增可视化快检方法的建立
目的 建立快速检测恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)的环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以期用于基层医院及疫区恙虫病快速筛查. 方法 以恙虫病东方体56 ku外膜蛋白基因为检测靶序列,设计2组恒温扩增引物,筛选佳引物,优化反应条件,对多种培养物中的Ot标准株及地方株进行验证检测,以经典PCR检测为对照,评估LAMP检测方法的敏感性和特异性. 结果 建立的LAMP法可快速检测鸡胚培养物、动物脏器及病人血样中的Ot DNA,经63℃恒温扩增1h之后,即可肉眼或用浊度仪观察结果,其他5种立克次体DNA模板对照,均无特异性扩增.LAMP法测定Ot DNA的低限为5.3×101拷贝/反应,普通PCR法为5.3×104拷贝/反应,LAMP法比普通PCR提高约3个数量级. 结论 建立的LAMP法能快速检测多种样品中的Ot 56 ku基因,方法的灵敏度和特异性高,实现了检测的可视化,适用于基层医院及疫区恙虫病筛查.
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环介导恒温扩增技术快速检测鼠疫耶尔森菌
目的：建立简单、快速环介导恒温扩增技术（LAMP）检测鼠疫耶尔森菌的方法。方法基于鼠疫菌染色体上特异的核酸序列3a 设计引物；应用浊度仪和目视法对反应结果进行检测；通过对鼠疫菌和其他近源菌同时进行检测评价方法的特异性；通过对不同稀释浓度的鼠疫菌 DNA 模板进行 LAMP 和 PCR 检测以确定方法的灵敏度。结果用建立的 LAMP 法对与鼠疫菌近源30种其他菌株进行扩增，结果均为阴性，该方法具有很高的特异性。LAMP 法检测鼠疫菌 DNA 的灵敏度可达到20 pg，比常规 PCR 法高10倍。检测反应在25 min 以内完成。结论该方法具有快速、灵敏、特异、操作简单的特点，有望发展成为现场快速检测鼠疫菌的有效手段。
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基于Omp25基因和环介导等温扩增技术检测布鲁氏菌方法的建立
目的 建立灵敏、特异、快速的LAMP检测布鲁氏菌的方法.方法 基于布鲁氏菌保守的Omp25序列设计了4套引物,根据文献合成了基于此序列的3套引物,利用7套引物建立了检测方法;应用浊度法和电泳法对4种布鲁氏菌进行检测,确定佳引物;通过对4种布鲁氏菌和其它17种常见菌同时进行检测评价方法的特异性;通过对不同稀释浓度的4种布鲁氏菌的DNA进行LAMP检测以确定方法的灵敏度.结果 本研究新设计的一套引物被确定为佳引物;用建立的LAMP法对17种常见菌株进行扩增,结果均为阴性,本方法具有很高的特异性;LAMP法检测猪种S2、羊种M5、牛种104 M和布鲁氏菌犬种55226四种布鲁氏菌DNA的灵敏度分别为5×10-4、5x10-5、5×10-3ng/pL和5×10-4ng/μL;检测反应在30 min以内完成.结论 本方法具有快速、灵敏、特异的特点,有望成为快速检测布鲁氏菌的有效手段.
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阪崎肠杆菌环介导恒温扩增方法检测
探索快速简便易行的阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)检测方法,可以减少和控制由其引起的食品污染和中毒事件[1].环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是2000年由Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法,其利用4条特异性引物来识别靶基因的6个特定区域,具有很高的特异性和灵敏度,反应在恒温下进行,快速简便,省却了PCR所需的温度循环,并且扩增产物量大,肉眼、电泳、浊度仪均可进行检测[2].
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环介导恒温扩增检测小肠结肠炎耶尔森菌
目的 建立1种基于环介导恒温扩增(LAMP)的快速、敏感、特异检测小肠结肠炎耶尔森氏菌方法,为诊断该菌感染及食品中污染检测提供实验室诊断依据.方法 根据GenBank中foxA序列,设计多套引物,筛选佳引物、优化反应条件,建立小肠结肠炎耶尔森氏菌DNA的LAMP检测方法,加入荧光染料钙黄绿素以肉眼判断结果.结果 根据扩增曲线,从4组引物中筛选出优引物组进行LAMP检测,63℃恒温15 min开始出现扩增,低检测限为1.46×10-7g/L,高于普通PCR低检测限1个数量级;以金黄色葡萄球菌、沙门菌、假结核耶尔森氏菌等10株病原菌为模板进行LAMP检测,均未检出非特异性扩增反应.测序结果分析显示,LAMP扩增区不同菌株序列一致性约为95％,具有很好的保守性.结论 建立的方法能够满足基层实验室、应急检测等使用需求,有良好的应用价值,可在有条件的基层进行推广.
关键词： 小肠结肠炎耶尔森氏菌 环介导恒温扩增技术 快速检测 检出限 -
环介导恒温扩增技术研究进展
环介导恒温扩增技术(LAMP)是2000年由日本学者开发的一种新型核酸体外扩增技术.LAMP不仅广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原微生物检测,而且可以进行单核苷酸多态性分析.LAMP具有灵敏度高、特异性好、可定量分析、反应时间短、操作简单等优点,特别适合在基层实验室推广应用.随着LAMP技术的不断进展,其在标本前处理、引物设计、产物的特异性可视化检测方面也日臻完善.
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恙虫东方体环介导恒温扩增技术检测方法的建立
目的 利用环介导恒温扩增技术(LAMP)建立一种简便、快速、有效的恙虫东方体检测方法.方法 利用LAMP DESIGNER软件设计恙虫东方体TSA56基因通用检测引物,建立恙虫东方体LAMP检测方法.并与Real-time PCR和普通PCR方法进行检测特异性和灵敏度的比较.同时,对16例临床确诊的恙虫东方体感染病例以及20例健康人样本进行检出率的比较.结果 本研究设计的恙虫东方体检测引物与其他病原体无交叉反应,所建立的恙虫东方体LAMP方法的检测灵敏度与Real-time PCR一致,为1.0× 102 copies/μl,是普通PCR方法灵敏度(1.0×103 copies/μl)的10倍.16例临床确诊恙虫东方体感染病例血液样本或焦痂样本的检测,LAMP方法阳性检出数与Real-time PCR一致(16/16),检出率为100％,高于普通PCR方法(62.5％,10/16).三种方法检测健康人样本均为阴性.结论 本研究成功建立了一种简便、特异、灵敏的恙虫东方体LAMP检测方法,为临床恙虫东方体的诊断提供了新方法.
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LAMP方法检测霍乱弧菌的研究
目的 建立一种快速检测霍乱弧菌的方法 .方法 利用霍乱弧菌的hlyA基因设计特异性引物,建立LAMP检测方法 .以及优化反应体系,并进行LAMP的特异性和灵敏度实验,同时与普通PCR和荧光定量PCR进行比较.结果 成功建立霍乱弧菌的LAMP检测方法 .得到优的反应体系,在特异性实验中,霍乱孤菌均呈阳性,而副溶血弧菌、溶藻弧菌、小弧菌、1梅氏孤菌等均为阴性;在灵敏度实验中,霍乱孤菌的低检测限为6.2pg/tube,是普通PCR的1 000倍.比荧光定量PCR低一个数量级.结论LAMP方法 具有很高的特异性和灵敏度,可用于霍乱孤菌的检测.
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不同方法检测子宫内膜炎患者解脲支原体和生殖支原体感染的实验研究
目的 探究环介导恒温扩增技术(LAMP)、实时恒温扩增RNA技术(SAT)和连接酶链反应法(LCR)对子宫内膜炎患者解脲支原体(UU)和生殖支原体(MG)检出率的差异.方法 收集2015年12月至2017年4月就诊于深圳市宝安区福永人民医院的子宫内膜炎患者186例,分别采用三种方法对患者宫颈分泌物进行检测,对测量结果进行特异性和敏感度比较.结果 SAT检测UU的敏感度为91.5％,与LAMP、LCR检测方法(88.4％和83.1％)比较,差异均有统计学意义(P<0.05);SAT与LAMP对MG的敏感度分别为86.8％和86.0％,差异无统计学意义(P>0.05),但是均明显高于LCR的79.2％,差异均有统计学意义(P<0.05);SAT方法诊断UU合并MG的敏感度高,为83.3％,与LCR方法的75.5％比较差异有统计学意义(P<0.05),SAT和LAMP检测的特异度分别为96.8％、96.6％,差异无统计学意义(P>0.05).结论 相对于LAMP和LCR,SAT对子宫内膜炎患者UU和MG的检测具有较好的敏感性,该方法的独特优势值得在女性专科和大型综合医院实验室推荐使用.
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环介导恒温扩增技术在下呼吸道病原菌检测的应用
目的 对比环介导恒温扩增技术(LAMP)和痰培养检测下呼吸道感染病原菌的结果差异,探讨LAMP在临床快速检测病原菌的重要性.方法 收集该院呼吸内科2015年12月至2017年5月下呼吸道病原菌感染患者痰液样本663例,采用L A M P和痰培养检测,对比2种检测的阳性率及病原菌种结果.结果 663例患者痰培养检测阳性90例,阳性率为13.6％,LAMP检测阳性277例,阳性率为41.8％,2种检测阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05),检出的菌株中革兰阴性杆菌为主要致病菌.结论 LAM P可快速地检出患者肺深部痰液的呼吸道致病菌,且检出率、敏感度和特异度远高于痰培养,已广泛应用于临床诊断.
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转Bt基因作物恒温扩增快速检测技术
[目的]建立一种快速检测转Bt基因作物的方法.[方法]利用Bt的Crylab/ac基因序列设计特异性引物,建立LAMP检测方法以及优化反应体系,并进行LAMP的特异性和灵敏度试验.[结果]成功建立转Bt基因作物的LAMP检测方法,得到优的反应体系.在特异性试验中,转Bt基因作物基因组DNA均呈阳性,而非转基因作物、转Bar基因作物、转CPTI基因作物、转EPSPS基因作物等均为阴性;在灵敏度试验中,转Bt基因作物的低检测限为10个拷贝.[结论]LAMP方法具有很高的特异性和灵敏度,可用于转Bt基因作物的现场快速检测.
