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多重实时荧光定量PCR对9种常见呼吸道病原体检测
目的 探讨多重实时荧光定量PCR(MRT-PCR)检测9种常见呼吸道病原体的临床应用价值.方法 采用Primer Express3.0 (ABI)和Primer3 Input 4.0设计引物和探针建立MRT-PCR法,通过构建质粒标准品分析该方法的低检出限和特异性.并对204例临床标本中副流感病毒1、2、3型、肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒进行回顾性检测.结果 MRT-PCR法检测病原体的低检出限达103 copies/mL,特异性达100％,无交叉反应.204例咽拭子标本中,MRT-PCR检出呼吸道合胞病毒23例,副流感病毒1、2、3型13例,腺病毒15例,肺炎支原体15例,肺炎衣原体3例,甲型流感病毒13例与乙型流感病毒6例.该结果与其他试剂报告结果完全一致.结论 多重实时荧光定量PCR具有快速、准确、特异性强等特点,在呼吸道病原体检测方面有重要价值.
关键词： 多重实时荧光定量PCR 间接免疫荧光法 呼吸道病原体 -
高致病性猪链球菌2型多重实时荧光定量PCR检测方法的建立
目的 建立对高致病性猪链球菌2型毒力基因SalK、virB4-89K、cps2J同步检测的多重实时荧光定量PCR检测方法.方法 根据SalK、virB4-89K、cps2J基因保守区域设计并合成3对引物及其探针；通过反应体系和扩增条件优化,建立快速鉴定高致病性猪链球菌2型的方法,并对方法的特异性、敏感性、重复性指标进行评估.结果 反应体系具有良好的扩增效率,全部扩增检测可在60 min内完成.SalK、virB4-89K、cps2J基因检测灵敏度分别为19 cfu/ml、27 cfu/ml和32 cfu/ml.重复性试验中变异系数均小于3％.用该方法考核33株猪链球菌,包括1/2型、1型、3型至33型,以及9株常见对照菌株,仅猪链球菌1/2型检测到cps2J基因荧光信号增强.对疫情现场获得的SS2感染者血液进行检测,3个基因均阳性.结论 建立的多重实时荧光定量PCR方法可快速检测高致病性猪链球菌2型,并能鉴定是否含有89K毒力岛基因SalK、virB4-89K,具有敏感、特异、重复性好的特点.
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TaqMan-LNA探针多重实时荧光定量PCR检测炭疽芽胞杆菌的研究
目的 设计检测多个靶基因的炭疽多重荧光定量PCR反应系统,建立快速准确的基因诊断方法,解决蜡样芽胞菌群基因诊断交叉反应问题. 方法 选择炭疽杆菌PX01毒素质粒基因pagA,PX02毒素质粒基因capB,以及染色体上的前噬菌体λBa03基因PL3作为靶基因,利用在线荧光定量PCR引物设计软件设计、优化多重PCR引物以及相应的TaqMan探针序列,对探针进行LNA标记并优化荧光PCR反应体系,构建多重实时荧光定量PCR反应系统.以3对引物PCR扩增并克隆靶基因的质粒标准品,倍比稀释后进行敏感度试验,以炭疽、蜡样芽胞杆菌、苏云金杆菌、蕈状杆菌以及常见肠道致病菌进行特异度试验,利用炭疽弱毒株污染土壤及奶粉进行模拟检测. 结果 TaqMan-LNA多重实时荧光定量PCR可迅速检出3个炭疽杆菌靶基因,常用的探针法荧光定量PCR反应液均适用;pagA、CapB、PL3基因克隆标准品序列正确;该方法对pagA、CapB、PL3基因的检出限分别为63、398、114copies/μl,且仅检出炭疽杆菌基因,其余4种蜡样芽胞菌扩增均阴性.土壤及奶粉样品检测均阳性,其中pagA近检出限为6.6×104/ml,PL3基因检出限为6.6×105/ml. 结论 TaqMan-LNA多重实时荧光定量PCR方法具有适用性广,检测迅速,灵敏度及特异度高等特点,能够将炭疽杆菌与蜡样芽胞菌群中其他细菌相鉴别,可试用于炭疽杆菌的感染检测.
关键词： 炭疽 TaqMan-LNA探针 多重实时荧光定量PCR 锁核酸 前噬菌体 -
多重实时荧光定量PCR检测肠出血性大肠杆菌O157:H7
目的 利用多重荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的定量方法.方法 选取肠出血性大肠杆菌O157:H7编码脂多糖基因(rfbE)和编码鞭毛抗原基因(fliC)作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan-MGB探针,探针的5'端分别用FAM和HEX进行荧光标记,3'端标记MGB.优化PCR扩增体系,对多重实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性评价,同时进行一定数量临床样本鉴定,与常规方法进行比较.结果 本研究所建立的多重实时荧光定量PCR方法可准确、特异地检测和鉴定肠出血性大肠杆菌O157:H7,能够有效甄别肠出血性大肠杆菌O157:H7与非H7菌株,其他菌株均无阳性结果;该方法的灵敏度可达到10 CFU/ml;定量检测的批间和批内变异系数均小于5%;对66例临床样本进行评价,结果显示15例肠出血性大肠杆菌O157:H7阳性,2例为肠出血性大肠杆菌O157:非H7阳性,其中16例与常规培养法结果符合,符合率达到98.49%.结论 本研究建立的检测肠出血性大肠杆菌O157:H7多重实时荧光定量PCR方法快速,结果准确、可靠,操作简便,为肠出血性大肠杆菌O157:H7的临床诊断、现场流行病学调查和食品安全监测提供了新的鉴定方法.
关键词： 多重实时荧光定量PCR 肠出血性大肠杆菌O157:H7 检测 -
呼吸道病原体多重实时荧光定量PCR的检测
目的 建立多重实时荧光定量PCR检测方法,为实现对呼吸道病原体的快速、灵敏特异性检测.方法 采用经报道的引物和探针对合胞病毒、腺病毒等8种呼吸道病原体进行多重实时荧光定量PCR检测.结果 多重荧光定量PCR阳性检测率高达57.8%,无假阳性及假阴性,特异性强.结论 多重实时荧光定量PCR具有经济、快速、特异性强等优点,在呼吸道病原体检测方面有巨大应用价值.
关键词： 呼吸道 病原体 多重实时荧光定量PCR -
多重实时荧光定量PCR法筛查成人Ph样急性淋巴细胞白血病
目的 探讨多重实时荧光定量PCR法早期、快速筛查Ph样急性淋巴细胞白血病(ALL)的可行性,了解Ph样ALL的临床特征及预后.方法 2010年10月至2016年3月收治的118例初诊成人B-ALL患者纳入研究,利用多重实时荧光定量PCR法检测其中58例BCR-ABL融合基因和MLL重排均阴性患者Ph样相关融合基因及细胞因子受体样因子2(CRLF2)表达情况.比较分析Ph样融合基因阳性和(或)CRLF2高表达患者的临床特征、疗效和预后.结果 检出Ph样融合基因阳性患者9例(9/58,15.5％),CRLF2高表达患者10例(10/58,17.2％). Ph样融合基因阳性和(或)CRLF2高表达组、Ph阳性组、MLL重排阳性组以及其他患者组在年龄、WBC、免疫分型、细胞遗传学、危险度分组方面差异有统计学意义(P值均＜ 0.01).四组患者的2年总生存率分别为65％、47％、64％、74％(P=0.043),2年无复发生存率分别为51％、39％、62％、70％(P=0.010).结论 采用多重实时荧光定量PCR法筛查Ph样ALL患者可行,Ph样ALL患者预后较差.
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改良多重实时荧光定量PCR检测流感A型和B型病毒
目的：建立改良多重实时荧光定量PCR体系快速检测流感A型和B型病毒。方法根据生物信息学分析结果选定流感A型和B型病毒的靶序列，建立MRT－PCR检测体系。构建质粒标准品，评估所建立体系的灵敏度、特异性和重复性。结果成功建立了基于同源加尾系统和Taqman－分子灯标探针的改良多重实时荧光定量PCR检测体系；该方法低检测限为102 copies／μl，特异性良好，重复性良好，变异系数（CV）为0．99％～2．50％。结论建立了快速、敏感、特异、稳定地改良多重实时荧光定量PCR（ MRT－PCR）检测体系，具有良好的临床应用前景。
关键词： 多重实时荧光定量PCR 同源加尾系统 Taqman-分子灯标 流感病毒 -
多重荧光定量PCR甄别3种霍乱弧菌相关毒素基因
目的 为了判定霍乱弧菌是否携带相关毒力因子,研发一种快速、准确、特异检测霍乱弧菌3种毒素基因的多重荧光定量PCR方法.方法 针对霍乱弧菌ctxA、ace、zot基因设计引物和探针,建立PCR体系,对70株霍乱弧菌分离株进行鉴定,采用直接测序方法对鉴定结果进行验证.结果 建立的多重实时荧光定量PCR方法可同时准确、特异地鉴定霍乱弧菌菌体携带的3种毒素基因,不携带毒素基因的菌株均未出现阳性检测结果.菌体检测的低检出限度ctxA基因:102 CFU/mL,ace基因和zot基因:10 CFU/mL.构建了3种毒素相关基因阳性质粒,ace基因和zot基因的低检出限度为10 copies/μL,ctxA基因的低检出限度为102 copies/μL,定量检测批间和批内的变异系数均小于5％；对70株霍乱弧菌分离株进行评价,结果显示其中40株(57.2％)携带ctxA毒素基因、31株(44.3％)携带ace毒素基因、46株(65.7％)携带zot毒素基因,通过测序方法验证,符合率达到100％.结论 本文建立的多重实时荧光定量PCR方法操作简便、特异性好、灵敏度高,为霍乱弧菌的现场流行病学调查和疫情监测提供了快速、可靠的鉴定工具.
关键词： 多重实时荧光定量PCR 霍乱弧菌 毒素 -
多重实时荧光定量PCR检测急性肝炎患者HBV和HCV方法的建立与意义分析
目的 建立一种新的可以快速筛查急性肝炎患者HBV和HCV感染的多重实时荧光定量PCR方法.方法 收集596例急性肝炎患者血清或血浆样本,应用自主构建的多重实时荧光定量PCR方法同时检测HBV和HCV,同时应用HBV和HCV单管检测试剂进行检测分析.结果 新建立的多重实时荧光定量PCR体系,可以有效地检测HBV和HCV的阳性质控品及阳性样本.多重实时荧光定量PCR体系特异性较好,检测HBV和HCV时,两者之间无交叉反应,且以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性;多重实时荧光定量PCR体系检测HBV、HCV的灵敏度分别为20 IU/ml、50 IU/ml;多重实时荧光定量PCR体系精密度好,检测HBV、HCV的CV值分别为0.11％、0.096％.在检测临床样本时,多重复合体系检测血清或血浆中HBV和HCV的检出率与单独检测HBV和HCV具有很好的一致性,且HBV和HCV的一致率分别达到97.7％(k--0.952)、98.8％(k=0.976);同时有6例样本出现HBV和HCV共感染.结论 新型多重实时荧光定量PCR方法对快速检测及筛查HBV和HCV较快捷,而且特异性好、灵敏度高、精密度好.因此多重实时荧光定量PCR方法对2种肝炎病毒的检测具有重要意义.
关键词： 多重实时荧光定量PCR 急性肝炎B/C病毒 快速检测 -
辣椒中常见产毒性真菌的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR检测方法
目的：将多重实时荧光定量PCR技术与裸磁珠富集技术联用，建立辣椒样品中常见3类（曲霉属、青霉属、镰刀菌属）产毒性真菌的快速定量检测方法。方法根据真菌核糖体RNA（rDNA）基因序列选择真菌广谱引物及属特异性探针，联用裸磁珠富集技术，建立多重实时荧光定量PCR体系，并评价所建方法的灵敏度、特异性、重复性和一致性。结果裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法灵敏度高，与本研究优化后的普通实时荧光定量PCR相比提高了10倍，是原报道的100倍，直接检测辣椒样品中3类产毒性真菌的检出限均可达103 CFU/ml，即104 CFU/g，且特异性良好（与非目标菌无交叉反应）、重复性良好（CV<1.5%），该方法模拟检测辣椒样品中3类产毒性真菌的计数结果与标准培养法的计数结果相比均无统计学差异（P>0.05），实验过程仅需7 h（标准培养鉴定法耗时7~14 d）。结论构建的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法能大大缩短产毒性真菌的检测时间，并成功应用于模拟辣椒样品中常见3类产毒性真菌的定量检测，值得进一步研究和推广。
关键词： 产毒性真菌 裸磁珠富集 多重实时荧光定量PCR 辣椒模型 -
成都市售辣椒粉霉菌污染调查及实时荧光定量PCR法在其中的应用
目的 了解成都地区市售辣椒粉受霉菌污染的状况,探讨裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法快速定量检测霉菌数量的实用性.方法 于成都市区随机选取农贸市场,采集辣椒样品40份,按照国标GB4789.15-2010对样品进行霉菌计数,纯化后以镜下特征及菌落特征进行菌种鉴定及分类计数,同时采用裸磁珠-实时荧光PCR方法检测霉菌数量,通过与传统方法比较,探讨裸磁珠-实时荧光PCR方法的实用性.结果 所采集样品的霉菌污染均数达到了5.1×103 CFU/g;对曲霉属、青霉属及镰刀菌属分类计数,裸磁珠-多重实时荧光定量PCR的检测法计数结果几何均数分别为6.1×108、4.0×101及2.9×106 CFU/g,此结果与传统培养计数法2.0×103、1.1×102及2.1×101 CFU/g相比有显著增加,两者结果具有统计学差异.结论 成都市售辣椒粉受霉菌污染严重,对消费者健康构成较大威胁.相比传统培养法,裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法节约时间、灵敏度高且受稀释等操作的影响较小、受样本成分及样本中其他霉菌干扰较小,具有很高的应用价值.
关键词： 快速检测 多重实时荧光定量PCR 辣椒样品 霉菌污染 市场调查
