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LNA PCR检测骨髓增殖性疾病JAK2基因V617F突变
目的:建立一种检测酪氨酸激酶2(JAK2)基因V617F突变的锁核酸PCR(LNA PCR)方法,并探讨其对骨髓增殖性疾病(MPD)的临床应用价值.方法:收集68例确诊为MPD患者外周血或骨髓标本,其中真性红细胞增多症(PV)37例、原发性血小板增多症(ET)22例、原发性骨髓纤维化(MF)9例.根据JAK2基因V617F突变位点设计引物和LNA,建立快速检测JAK2基因V617F突变的LNA PCR方法,同时以DNA直接测序法进行验证,并检测上述标本JAK2基因V617F突变率.结果:所建立的LNA PCR方法能有效检测JAK2基因V617F突变,其特异性和灵敏度明显高于DNA测序法(P＜0.05)；LNA PCR方法可以检测出1%的JAK2基因V617F突变型杂合子.68例MPD患者标本共检测出JAK2基因V617F突变55例,检出率80.88%.其中37例PV中JAK2基因V617F突变34例(91.89%),22例ET中JAK2基因V617F突变15例(68.18%),9例MF中JAK2基因V617F突变6例(66.67%).结论:LNA PCR方法检测灵敏度高,能有效提高JAK2基因V617F突变检出率.
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锁核酸扩增阻滞荧光聚合酶链反应技术检测结直肠癌患者血浆肿瘤K-ras基因突变
目的 建立锁核酸扩增阻滞突变体系荧光聚合酶链反应(LNA-ARMS-PCR)技术检测血浆K-ras突变方法,探讨该方法替代组织检测K-ras突变的可行性.方法 应用锁核酸标记技术建立LNA-ARMS-PCR检测K-ras突变技术,收集155例结直肠癌患者肿瘤组织及其对应血浆标本,同时检测其中的K-ras突变,分析其符合率.结果 建立的检测技术灵敏度高,质粒混合实验证实其灵敏度高达0.1％.肿瘤原发灶内的异质性分析结果显示本方法可以避免因肿瘤异质性导致的假阳性.血浆与肿瘤组织K-ras突变检测的阳性符合率为35.3％,阴性符合率均为100.0％;Ⅳ期患者血浆与组织突变阳性符合率高达83.3％ (15/18).血浆与组织突变检测符合率与TNM分期及循环游离DNA(cfDNA)水平密切相关.结论 LNA-ARMS-PCR方法检测血浆K-ras突变,可以取代肿瘤组织用于检测K-ras突变,但仅限于晚期转移性患者临床价值高.
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锁核酸结合分子信标技术检测乙型肝炎病毒DNA G1896A点突变研究
目的 研究和评估乙型肝炎病毒(HBV)DNA G1896A点突变的实时荧光PCR检测方法.方法 收集经测序验证HBV DNA G1896A未突变的野生型样本150例和已发生突变的突变型样本58例,在突变区域设计分子信标探针,点突变处进行锁核酸处理,利用荧光PCR方法检测HBV前C区G1896A点突变；再从临床标本中随机抽取18例、8例和19例荧光PCR结果分别显示为G1896A突变的标本、杂合的标本以及野生型的标本的PCR产物进行序列测定.结果 突变型质粒和野生型质粒的检测灵敏度均可以达到100 copies/ml；突变型探针检测高浓度的野生型质粒时无检测信号,野生型探针检测高浓度突变型质粒时无检测信号；突变型模板在总杂合模板中的比例达到5％时则都可以将突变型检测出来；序列测定的8例G1896A突变标本、6例杂合标本和19例野生型标本的PCR产物结果和荧光PCR检测结果完全吻合.结论 实时荧光PCR检测方法可以快速、简便、准确地检测HBV DNA G1896A点突变,是检测点突变的重要方法,具有重要的临床应用价值.
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microRNA的液体芯片检测方法
microRNA表达谱的检测需要精确、高通量和多重检测方法,液体芯片可通过编码微球结合探针的序列差异,来检测相应的microRNA序列.本文介绍了两代液体芯片背景的FlexmiR产品.其通过锁核酸,逐步降温和单链酶解来提升对microRNA检测的特异性,为临床科研microRNA的研究提供新的检测工具.
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基于MicroRNAs的锁核酸抗肿瘤基因治疗新进展
肿瘤是一种涉及编码或非编码基因结构和表达异常引起的疾病. MicroRNAs( miRNAs)调节蛋白质编码基因和其他非编码转录的表达,被认为是细胞生理活动的主要调控物之一,过去十几年针对miR-NAs研究很多. 目前认为, miRNAs的异常调节,很大程度上影响基因的表达,并且与许多疾病相关,特别在肿瘤的发生、发展和转移中起着重要的作用.miRNAs在癌症生物学和肿瘤学中被广泛研究,给我们带来大量关于miRNA在肿瘤细胞的病理生理学、肿瘤与miRNA失衡的相关信息. 在肿瘤细胞内调控miRNA水平的治疗策略向临床前和临床期新治疗方法发展. 锁核酸(locked nucleic acid,LNA),本质是一种核苷酸衍生物,因其具有的亲和性、热稳定性、抗酶切性等优势,被广泛应用于各种疾病治疗中,特别是基于miRNAs在肿瘤治疗中已被大量研究并取得一定成果. 虽然现在针对miRNA治疗策略有一定的局限性和障碍,但越来越多的研究成果不断克服这些障碍,使这种治疗策略具有可行性.现就此综述如下.
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锁核酸在抗病毒基因诊断与治疗中的应用新进展
基因是现代研究的一个新领域和新热点,PCR技术因准确度和特异性高、灵敏度好等优点受到了医学工作者的青睐.PCR技术能在早期及时发现疾病,做到早预防和早治疗.而基因治疗中的反义寡核苷酸治疗和核酶是从分子水平对疾病进行干预和治疗,具有从源头治疗的优点.但天然的寡核苷酸稳定性差,容易被各种核酶迅速降解,给研究应用带了一大难题.因此需寻找一种物质对寡核苷酸进行修饰,增加其抗酶切能力和提高其稳定性.近年来,锁核酸因其具有稳定性好、分子杂交能力强、抗核酸酶降解能力高、脂溶性好和低细胞毒性等特点而被人们应用于基因诊断和基因治疗.笔者就锁核酸的理化性质、基因诊断与治疗中的应用新进展作一综述,以期为其在病毒诊断、治疗中的应用提供潜在的研究价值.
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利用野生抑制探针提升对BRAF V600E基因痕量突变检测的研究和临床应用
目的 BRAF V600E基因痕量突变的筛查可以避免肿瘤患者无效治疗的情况出现.方法 用内部竞争性扩增片段提高野生抑制型(WTB)探针对野生型BRAF V600E基因的抑制,提高发生痕量突变的BRAF V600E基因型的检出率.结果 当模板DNA浓度在50～200 ng/μL时,构建的痕量基因突变实时荧光定量检测方法能够完全屏蔽BRA F V600E野生型基因扩增.该检测方法的灵敏度可以达到0.1％,符合基因痕量突变检测技术灵敏度的要求.在50例疑似结直肠癌患者的结直肠镜活检组织中,构建的该方法检测到BRA F V600E基因痕量突变的标本为8例(16.0％),具备较高的检出率.结论 构建的基因痕量突变的检测方法能够对临床标本中BRA F V600E基因痕量突变做快速、简便、低成本的定量分析.
关键词： BRAFV600E基因 基因痕量突变 结直肠肿瘤 锁核酸 -
反义锁核酸体外抗乙肝病毒的实验研究
目的 探讨锁核苷酸(LNA)修饰的反义寡核苷酸抑制乙型肝炎病毒(HBV)表达的效果及其抗HBV作用的特点.方法 针对HBV S基因同一靶位分别合成三段不同化学修饰的反义寡核苷酸:锁核酸修饰、未修饰和全硫代修饰,并以无关序列为对照直接作用于HepG22.2.15细胞,ELISA法动态检测细胞上清液中HBsAg含量;实时荧光定量PCR法(FQ-PCR)检测细胞上清中HBV DNA含量;MTT法监测细胞活性.结果 针对HBV S基因的反义LNA能显著抑制HepG22.2.15细胞表达HBsAg(P＜0.05)且第3天出现抑制高峰,抑制作用随时间延长逐渐减弱.反义锁核酸组对HBsAg及细胞内、细胞外HBV DNA均有较强抑制作用,高抑制率分别为51.19%、56.73%、86.9%,与其他实验组相比差异有统计学意义(P＜0.05),与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);LNA在20 μmol/L浓度范围内对细胞代谢无影响.结论 针对S基因的反义LNA体外能发挥高效、特异、低毒的抗HBV作用,为乙型肝炎的基因治疗注入了新的思路.
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不同修饰的反义寡核苷酸体外抗乙型肝炎病毒效果的比较
为研究应用锁核酸(locked nucleic acid,LNA)抗HBV的作用,我们设计针对HBV S基因的反义寡核苷酸,分别经过LNA、硫代反义寡核苷酸(phosphorothioate antisenseoligodeoxy nucleotide,PS-ODN)修饰,以阳离子脂质体为载体介导转染HepG2.2.15细胞,比较它们对细胞表达HBsAg、HBeAg和复制HBV DNA的影响.
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针对乙型肝炎病毒S编码链的反基因锁核酸在转基因小鼠体内的抗病毒效果
目的 探讨针对乙型肝炎病毒(HBV)S编码链的反基因锁核酸在转基因小鼠体内的抗病毒效果. 方法 将30只HBV转基因小鼠随机分为5组(n=6),分别为空白(5％葡萄糖+脂质体)对照组、无关序列对照组、拉米夫定对照组、反义锁核酸对照组、反基因锁核酸组.拉米夫定组用灌胃法,锁核酸经尾静脉注入小鼠体内.采用实时荧光定量PCR检测血清HBV DNA;酶联免疫法检测血清HBV表面抗原(HBsAg);逆转录PCR检测肝脏HBV S mRNA水平;免疫组织化学方法检测肝细胞HBsAg水平.组间比较用单因素方差分析.结果 治疗后的3、5、7d,反基因锁核酸对HBV DNA抑制率分别为37.18％、50.27％、61.46％,HBsAg抑制率分别为30.17％、44.00％、57.76％,与给药前比较差异有统计学意义(P＜0.01).HBV S基因mRNA的相对表达量为0.33、肝细胞HBsAg阳性细胞率为31％,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);肝肾生物化学指标检查和组织HE染色未发现异常改变. 结论 针对HBV S编码链设计的反基因锁核酸在转基因小鼠体内具有较好的抗病毒效果,为HBV的基因治疗提供理论依据和实验基础.
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针对乙肝病毒前C/C双靶区反义锁核酸在转基因鼠体内抗病毒效果
为探讨针对前C/C双靶区反义锁核酸(LNA)对转基因小鼠体内乙肝病毒复制的影响,本文采用完全随机设计分组,经尾静脉给药,实验组注射脂质体包裹的反义LNA片段,对照组分别注射5％葡萄糖液和空脂质体,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术、时间分辨免疫荧光技术、自动生化分析仪等分别检测血清乙肝病毒核酸、乙肝病毒表面抗原、清蛋白、谷丙转氨酶、尿素氮和肌酐等指标浓度;采用免疫组化法检测肝细胞内乙肝病毒核心抗原分布.结果表明,针对前C/C双靶区的反义LNA对乙肝病毒核酸复制、乙肝病毒表面抗原及核心抗原合成均有较强的抑制作用,且抑制效果明显高于单靶区.
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MicroRNA-122作用于HBx影响乙肝病毒复制
为了寻找与HBV感染相关的microRNA并初步探讨其作用机制,首先,我们前期研究发现在转染HBV表达质粒的HepG2细胞内,miR-122上调表达,推测miR-122与HBV的感染有关；在此基础上,本研究进一步将miR-122和表达HBV的质粒pCH9-HBV1.1共转染HepG2细胞,Southern blot检测发现miR-122可抑制HBV的复制.利用计算机软件miRanda预测表明,HBx可能是miR-122的作用靶序列；进一步利用荧光素酶报告基因系统和Western blot检测靶基因HBx蛋白表达改变,验证miR-122对HBx表达的调节作用.终推测miR-122可能通过调节HBx的表达而影响HBV的复制.
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寡核苷酸链在肿瘤反基因疗法中的运用新进展
反基因疗法是通过寡核苷酸链在dsDNA与蛋白质的结合部位形成三链结构来抑制基因的转录,达到治疗肿瘤的效果.由于天然寡核苷酸链存在易被核酸酶消化、半衰期短、稳定性差、不易透过细胞膜、以及安全性等问题,制约了反基因技术的发展.近年来研制出的硫代寡核苷酸链、肽核酸、锁核酸等修饰物使寡核苷酸链的性能得到了很大提高,为反基因疗法的临床广泛应用提供了理论和实践依据.本文就寡核苷酸链在肿瘤及基因疗法中的运用新近展作一综述.
