首页 > 文献资料
-
应用siRNA干扰技术沉默铜绿假单胞菌外排泵基因mexB的蛋白表达
目的 观察siRNA干扰质粒转入铜绿假单胞菌后,MexB蛋白表达量的变化.方法 针对mexB基因设计合成特异性siRNA分子,与pGPU6/GFP/Neo载体连接,构建pGPU6/GFP/NeosiRNA重组质粒.构建重组表达质粒pET22b+/mexB,并转化大肠杆菌BL21( DE3) plysS,诱导表达MexB蛋白,蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体.siRNA质粒分别电转化铜绿假单胞菌野生株、临床耐药株及mexB基因高表达株,运用Western blot观察转化8、12、24h后MexB蛋白表达量的变化.结果 成功构建pGPU6/GFP/Neo-siRNA重组质粒.成功表达铜绿假单胞菌外排泵蛋白MexB,并制备多克隆兔抗.siRNA质粒对铜绿假单胞菌野生株、临床耐药株及mexB基因高表达株的mexB基因均具有良好的沉默效果,而且沉默效果存在时间差异性.结论 siRNA质粒转化3株铜绿假单胞菌后,在8h及12 h时均可观察到MexB蛋白表达量明显减少,而在24 h时MexB蛋白表达量无改变.
关键词： siRNA mexB基因 Western blot 铜绿假单胞菌 -
人疱疹病毒7型被膜蛋白pp85的原核表达及应用
目的构建人疱疹病毒7型(HHV7)被膜蛋白pp85编码基因(ORF U14)的原核表达载体,并进行原核表达.方法应用HHV7标准株Glasgow感染SupT1细胞,PCR技术扩增HHV7 ORFU14基因的主要抗原决定簇编码区(328～533 AA),目的基因与原核表达载体pThioHis A连接后,转化宿主菌E.coli BL21,IPTG诱导融合蛋白表达,经镍-螯合物琼脂糖树脂柱亲和层析纯化获得重组抗原.重组蛋白电泳后转至PVDF膜,与HHV7阳性血清进行免疫印迹反应.结果DNA序列分析表明,目的基因序列与HHV7标准毒株Glasgow相应序列完全一致,SDS-PAGE可观察到相对分子质量(Mr)为35.7×103融合蛋白的表达,免疫印迹反应显示重组抗原具有较高的特异性.结论 HHV7重组抗原具有较好的抗原性,进一步完善后可用于HHV7抗体的检测.
关键词： 人疱疹病毒7型 Western blot 被膜蛋白pp85 原核表达抖 -
早期B细胞因子3在肝癌中的表达及对HepG2细胞株作用的研究
目的 研究肝癌及远端非痛肝组织中早期B细胞因子3(EBF3)mRNA与蛋白质表达差异及临床意义,并研究EBF3-EGFP(增强型绿色荧光蛋白)融合蛋白表达对肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响.方法 采用荧光定量PCR技术检测20例配对肝癌及远端非癌肝组织EBF3 mRNA水平,Western blot检测5例配对标本EBF3蛋白表达.将EBF3与EGFP融合蛋白表达载体pEGFP/EBF3转染HepG2细胞株,倒置荧光显微镜观察EBF3-EGFP融合蛋白表达,流式细胞术测定转染后不同时间S期细胞分数(SPF)和增殖指数(PI).结果 20例肝癌和配对远端非癌肝组织中EBF3mRNA与β2M mRNA的埘数比值分别为0.55±0.12和0.22±0.23,差异有统计学意义(t=5.69,P<0.001);Western blot结果表明EBF3蛋白主要表达于细胞核中,5例肝癌组织核蛋白中EBF3条带平均灰度值为26.35±14.06,与远端非癌肝组织(7.86±8.47)相比差异有统计学意义(t=2.52,P=0.036);将pEGFP/EBF3导入HepG2细胞株24 h后,可观察到EBF3-EGFP融合蛋白主要表达于核内.转染pEGFP/EBF3后48 h和72 h,SPF和PI均显著高于pEGFP转染细胞组.结论 肝癌组织中EBF3 mRNA及其蛋白表达均上调,EBF3基因导入HepG2促进细胞株增殖,EBF3在肝癌中的作用有待进一步研究.
关键词： 早期B细胞因子3 肝肿瘤 荧光定量PCR Western blot 增殖 -
艾蒿花粉主要变应原的分离、纯化与鉴定
目的对我国蒿属花粉中常见、重要的变应原艾蒿花粉进行分离、鉴定与纯化.方法采用不同的提取液得到艾蒿花粉粗浸液,经饱和(NH4)2SO4分级沉淀后用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质组分,并用凝胶成像系统测定各组分的相对分子质量(Mr);采用Western blot鉴定其主要及次要变应原;通过DEAE-Cellulose DE-32离子交换层析(ion exchange chromatography,IEC)和Sephadex G-75凝胶层析(gel chromatography)对艾蒿花粉变应原进行纯化.结果分离后得到20多种蛋白质组分,其中Mr为58×103、38×103、25×103、20×103、16×103等5个条带蛋白含量丰富;分离到的蛋白质组分中有9种蛋白能与确诊的蒿属花粉过敏患者血清中蒿属花粉特异性IgE结合,其中Mr为62×103、43×103、38×103的蛋白条带的结合率高;经纯化后仅得到Mr为62×103的主要变应原.结论艾蒿花粉的主要变应原Mr分别为62×103、43×103和38×103,层析技术可以对Mr为62×103的主要变应原成分进行纯化.
关键词： 艾蒿花粉 SDS-PAGE Western blot 离子交换层析 凝胶层析 -
TGF-βⅡ受体和磷酸化Smad2蛋白在食管癌中的表达及意义
目的 探讨转化生长因子β-Ⅱ型受体(TβRⅡ)和磷酸化Smad2(P-Smad2)蛋白在食管癌发生和发展中的作用.方法 应用Western blot技术对38例手术切除的食管癌标本和12例癌旁组织中的TβRⅡ、P-Smad2的表达进行检测.结果 食管癌中TβRⅡ、P-Smad2的表达明显低于癌旁组织,具有显著性差异(P＜0.05);但TβRⅡ、P-Smad2的表达在不同临床病理特征(年龄、性别构成比、组织分化程度、有无淋巴结转移)中差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 食管癌组织中存在TβRⅡ和Smad2 的蛋白表达异常,可能与食管癌的发病有关.
关键词： TβRⅡ P-Smad2 食管癌 Western blot -
α2肾上腺素受体在神经病理性疼痛大鼠脊髓背角中的表达
目的:研究α2肾上腺素受体(α2-AR)不同亚型在神经病理性疼痛大鼠中的表达变化规律及其在神经病理性疼痛形成中作用.方法:雄性6周龄SD大鼠分为对照组、假手术组和保留性脊神经损伤模型组(spared nerve injury,SNI组).采用蛋白质免疫印迹法(Western blot法)和RT-PCR法测定α2A-AR、α2B-AR和α2C-AR在腰膨大段脊髓背角中的表达.结果:(1)在蛋白水平三个亚型在正常大鼠均有表达,主要是以α2A-AR为主;(2)与正常组和假手术组比较,SNI神经病理性疼痛组α2A-AR的蛋白表达明显下调(P＜0.01,n=6),而α2B-AR和α2C-AR蛋白表达则没有明显的变化(P＞ 0.05,n=6).(3)在mRNA水平,三个亚型在三组表达没有明显的变化(P＞0.05,n=5).结论:在神经病理性疼痛条件下,脊髓背角α 2A-AR受体亚型明显下调,α2B-AR和α2C-AR没有明显变化,表明这种下调仅发生在翻译水平而非转录水平.α 2A-AR下调可能在外周神经损伤所引起的神经病理性疼痛中发挥作用.
关键词： α2肾上腺素受体 神经病理性疼痛 Western blot -
巴氯芬抑制CCI神经病理性疼痛模型大鼠DRG神经元上GABAA受体功能
目的:观察巴氯芬干预前后GABAA受体γ2亚基在坐骨神经压榨性损伤(Chronic ConstrictionInjury,CCI)模型大鼠背根神经节(Dorsal Root Ganglion,DRG)神经元上的功能和表达变化.方法:制备CCI模型,热板实验检测热刺激缩足反射潜伏期(Thermal Withdrawal Latency,TWL);以灌胃的方式给予CCI模型鼠巴氯芬干预14天,取大鼠L4～L6 DRG神经元进行膜片钳实验,观测巴氯芬干预前后CCI模型鼠DRG神经元GABA介导的内向电流变化;应用Western blot技术检测巴氯芬干预前后CCI模型鼠GABAA受体γ2亚基的表达变化.结果:(1) CCI模型大鼠的TWL比正常组明显缩短,巴氯芬干预组模型大鼠的TWL较CCI模型组明显延长(P＜0.05);(2)巴氯芬抑制CCI模型大鼠D RG神经元GABA介导的内向电流(P＜0.05); (3) CCI手术侧和手术对侧DRG神经元上GABAA受体γ2亚基的表达量下调(P＜0.05),但是磷酸化γ2亚基表达量上调(P＜0.05);巴氯芬干预后的GABAA受体γ2亚基表达量较CCI组下调,磷酸化的γ2亚基表达量较CCI组上调.结论:神经病理性痛状态下,GABAA受体γ2亚基发生磷酸化可能是GABA介导的突触前抑制作用减弱的原因之一,而巴氯芬可能通过磷酸化GABAA受体γ2亚基抑制GABAA受体功能.
-
落新妇甙对缺血再灌注损伤肝脏HO-1表达的影响
目的:通过观察落新妇甙对肝脏热缺血再灌注损伤中血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)表达的影响,探讨其缺血再灌注保护作用的分子机制.方法:C57BL/6小鼠随机分为4组(n=8):假手术组(Sham)、模型组(I/R)、落新妇甙小剂量(10 mg/kg)干预组和落新妇甙大剂量(40 mg/kg)干预组.缺血前24和lh干预组小鼠腹腔注射分别给予10或40 mg/kg的落新妇甙,建立肝左、中叶70％部分肝缺血再灌注模型,模型组和假手术组给予同样体积的生理盐水.小鼠肝脏左叶缺血90 min、再灌注6h后各实验组采集血液和肝脏组织样本.检测血清中丙氨酸转氨酶(alanine transaminase,ALT)活性,Western blot检测肝组织中核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)和HO-1蛋白含量,半定量RT-PCR检测上述分子mRNA表达情况.结果:落新妇甙小、大剂量干预后血清ALT含量较I/R对照组均明显下降(假手术组:142U/L±25 U/L;模型组:3521 U/L±270 U/L;落新妇甙小剂量干预组:1766 U/L±179 U/L;落新妇甙大剂量干预组:1067 U/L±101 U/L,P＜0.01);落新妇甙小、大剂量干预组肝组织中NF-κB蛋白表达与I/R模型对照组比较均渐次降低;落新妇甙小、大剂量干预组肝组织中HO-1蛋白表达与I/R模型对照组比较均渐次升高,亦与半定量RT-PCR结果相符(假手术组:0.53 U/L±0.07 U/L;模型组:1.00 U/L±0.11 U/L;落新妇甙小剂量干预组:1.17 U/L±0.16 U/L;落新妇甙大剂量干预组:1.57 U/L±0.07 U/L小剂量干预组P＜0.05;大剂量干预组P＜0.01).结论:落新妇甙干预能降低缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,IRI)引起的血清ALT水平升高;落新妇甙干预能降低IRI肝组织中NF-κB蛋白的高表达,促进IRI肝组织HO-1蛋白和mRNA的表达,显示其保护作用与促进HO-1的表达密切相关.
-
基于iTRAQ结合2D-LC-MS/MS筛选胃癌血清差异表达蛋白
目的:筛选胃癌血清差异表达蛋白,寻找胃癌血清标志物.方法:采集胃癌患者血清和正常对照人群血清各45例,所有血清样本去除高丰度血清蛋白质后,采用相对和绝对定量同位素标志(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术联合二维液相色谱-串联质谱(two-dimensional liquid chromatography/tandem mass spectrometry,2D-LC-MS/MS)分析和鉴定两组间的差异表达蛋白;采用生物信息学对差异蛋白进行分析;用Western blot对蛋白组中的代表性血清差异表达蛋白进行表达验证.结果:iTRAQ标记联合2D-LC-MS/MS分析一共鉴定出10540条独特肽段,对应199个非冗余蛋白,其中符合条件的差异蛋白17个,其中12个蛋白在胃癌患者中表达上调,5个蛋白在胃癌患者中表达下调.17种差异表达蛋白参与10种生物学过程、9种分子作用和2种细胞组分,涉及的5个生物代谢途径.Western blot结果显示,与正常对照人群相比,代表性差异表达蛋白ITIH4在胃癌患者血清中表达量上调,差异具有统计学意义(1.7517±0.247 vs 1±0,P＜0.05).结论:ITIH4可能是诊断胃癌新的潜在生物标志物.
关键词： 胃癌 iTRAQ Western blot 标志物 ITIH4 -
持续释放人血管抑素的基因修饰化工程细胞hE/293细胞株的建立
目的:在人胚肾HEK293细胞中转染真核表达载体pSNA2/hEndostatin(hEndostatin,人血管抑素),建立能稳定分泌hES的基因工程细胞株.方法:将含有IL-2分泌肽的人endostatin(ES)全长cDNA插入真核表达载体pSNA2,产生重组质粒pSNA2/hEndostatin;利用阳离子脂质体介导将其转染入HEK293细胞中;用G418筛选出阳性克隆细胞,将其命名为hE/293细胞.用Western blot法检测hE/293细胞培养上清中分泌的hES蛋白.血管内皮细胞(ECV304)增殖抑制试验及鸡胚尿囊膜试验观察其分泌的hES蛋白的抗增殖活性.结果:经过双酶切和DNA测序证实构建出了含hES基因的真核表达载体.通过G418抗性筛选筛选出稳定表达hES的细胞株3株,将其命名为hE/293细胞;Western blot检测该细胞株培养上清中存在分子量为20 kDa的ES蛋白;ECV304增殖抑制试验显示,与HEK293细胞组相比,hE/293细胞组分泌的ES蛋白对bFGF刺激的血管内皮细胞增殖有明显的抑制作用(48 h:0.125±0.007 vs 0.159±0.020,P＜0.01;72 h:0.088±0.016 vs 0.249±0.070,P＜0.01);鸡胚尿囊膜试验证实hE/293细胞分泌的ES蛋白可以抑制鸡胚尿囊膜血管生长.结论:所构建的hE/293细胞株可以稳定的分泌hES蛋白,并能抑制ECV304细胞生长及鸡胚尿囊膜血管生长.
关键词： 人内皮抑素 真核表达载体 人胚胎肾细胞 hES细胞株 Western blot -
HSP70-肿瘤肽复合物的纯化及其对肝癌细胞株HepG-2增殖的作用
目的:应用快速蛋白液相色谱(FPLC)系统从肝癌组织中分离和纯化HSP70-肽复合物,并研究其对肝癌细胞系HepG-2增殖的影响.方法:将组织进行匀浆、高速离心提取总蛋白后依次进行ConA-Sepharose亲和层析和DEAE-Sephacel离子交换层析分离纯化,所得蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot进行蛋白分子质量及性质鉴定,Bradford法测定蛋白浓度;利用MTT方法检测HSP70-肽复合物对HepG-2细胞增长的情况.结果:分离、纯化得到的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯量蓝鉴定为单一带,分子质量为70 kDa;Western blot结果证实为HSP70,每10 g组织终获得1.5 mg的HSP70;HSP70刺激组12,48,72 h与对照组的A值之间有显著差异(0.1 mg/L:t=-0.2500,P=0.00;t=-0.1777,P=0.001;t=-0.3094,P=0.001;0.5 mg/L:t=-0.2878,P=0.00;t=-0.2044,P=0.00;t=-0.3285,P=0.00;1 mg/L:t=-0.3118,P=0.00;t=-0.2592,P=0.00;t=-0.1994,P=0.025;5 mg/L:t=-0.4007,P=0.00;t=-0.1302,P=0.016;t=-0.2537,P=0.005),细胞存活率明显高于对照组(P＜0.01).结论:使用本分离纯化方法可获得高纯度HSP70肽复合物;HSP70肽复合物可以促进HepG-2细胞的生长.
关键词： HSP70-肿瘤肽复合物 纯化 肝癌 HepG-2细胞系 Western blot MTT -
RNAi沉默Sp3基因对肝癌HepG2细胞增殖的影响
目的:采用基因沉默和慢病毒转染技术,沉默人肝癌细胞HepG2中特异蛋白3(specificity protein 3,Sp3)的表达,观察沉默Sp3基因后的肝细胞的增殖能力变化.方法:采用Sp3-siRNA慢病毒转染人肝癌细胞HepG2,通过免疫印迹法和PCR技术检测Sp3的表达以验证转染效果,通过MTT检测细胞生长曲线和流式细胞技术测定细胞周期.结果:Western blot实验表明,实验组的Sp3表达量明显少于空白组和阴性对照组(0.37±0.08vs0.83±0.17,0.66±0.13,F=8.442,均P＜0.05).RT-PCR也得到相同的结果(0.47±0.05vs0.74±0.08,0.70±0.16,F=7.322,均P＜0.05).MTT实验结果显示,与空白对照和阴性对照组相比,实验组细胞在48、72和96 h时的增殖明显受到抑制(0.28±0.18vs0.34±0.19,0.35±0.07,F=3.888;0.57±0.11vs0.84±0.05,0.74±0.08,F=12.721;0.72±18.1vs0.98±0.05,0.93±0.9,F=6.342,均P＜0.05).流式细胞术结果显示实验组细胞主要分布在G1期.结论:RNAi沉默Sp3基因导致人肝癌HepG2细胞体外增殖能力下降.
-
人BRAF野生型及V600E突变型真核表达载体的构建及表达
目的:构建BRAF野生型和V600E突变型真核表达载体;转染并筛选稳定表达BRAF的胰腺癌细胞株,为探讨BRAF V600E突变在胰腺癌发生发展中的作用提供合适的细胞模型.方法:将BRAF野生型及V600E突变型cDNA克隆于真核表达载体pCMV-Myc中,构建pCMV-Myc-BRAFW)及pCMV-Myc-BRAFV600E重组质粒,酶切鉴定、测序证实序列正确后,利用脂质体将重组质粒转染胰腺癌细胞Panc-1,经G418培养筛选获得抗性细胞克隆,用RT-PCR和Western blot鉴定野生型和V600E突变型BRAF基因在Panc-1细胞中的表达.结果.酶切鉴定和序列分析证实,重组克隆pCMV-Myc—和pCMV-Myc—BRAFV600E序列正确,RT-PCR和Western blot结果显示G418筛选获得的转基因Panc-1细胞稳定表达BRAF和BRAF V600E.结论:成功构建了pCMV-Myc-BRAFW和pCMV-Myc-BRAFV600E真核表达载体,建立了稳定表达BRAF和BRAF V600E的胰腺癌细胞株.稳定表达BRAF和BRAF V600E的胰腺癌细胞株.稳定表达BRAF和BRAF V600E的胰腺癌细胞株.
关键词： BRAF 胰腺癌 逆转录聚合酶链式反应 Western blot 克隆 真核表达 -
抗幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的单克隆抗体的制备和鉴定
目的:从抗幽门螺杆菌(H pylori)全菌蛋白的单克隆抗体(mAb)中,应用重组中性粒细胞激活蛋白(NAP),筛选出抗NAP单抗并进行鉴定.方法:临床分离H pylori DY01,DY04株.免疫BALB/c小鼠后,应用杂交瘤技术制备mAb.再用ELISA方法以重组表达的NAP蛋白筛选相应的单抗,对NAP单抗进行亚类鉴定和效价检测,并用Western blot和免疫组化方法鉴定其特异性.结果:获得3株针对H pylori-NAP蛋白的特异性mAb,抗体亚类为IgG1,轻链为κ型.单抗细胞培养液的抗体效价为1/16-1/32,腹水的抗体效价是1/32000-1/64000.Western blot鉴定表明,抗NAPmAb针对NAP蛋白产生特异性条带,具有高度的特异性;免疫组化分析显示:3株NAP mAb能与H pylori临床菌株发生特异性结合反应,菌体染成深棕色.结论:获得抗H pylori-NAP蛋白的特异性mAb,为幽门螺杆菌感染的诊断、预后判断及表位疫苗的研究提供基础.
关键词： 幽门螺杆菌 中性粒细胞激活蛋白 单克隆抗体 Western blot 免疫组化 -
农村居民家庭幽门螺杆菌感染的血清流行病学调查
目的:了解幽门螺杆菌(H pylori)感染在农村居民的感染率和探索H pylori感染的传播途径.方法:2004-09对河北省遵化市某村71户家庭263人进行横断面研究,采用面对面问卷调查形式由专人填写调查表,采集静脉血液标本5 mL用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测HpUIgG抗体.用免疫印迹方法(Western blot)检测血清中的H pylori抗体.结果:该地区居民的H pylori感染率属于中等水平,男女感染率没有差别.当地居民H pylori感染的危险因素有未成年时住房拥挤、条件差、养猪、现在家庭中几代共同进餐及醋和水果进食过少等.263位受检者中,H pylori总血清感染率为57.41%,抗体平均水平为0.911±0.810 μg/L;其中男性感染率为60.50%,抗体平均水平为0.948±0.843 μg/L;女性感染率为54.86%,抗体平均水平为0.880±0.784 μg/L.Hpylori感染有家庭聚集性.父母双方或者一方Hpylori感染阳性的其子女H pylori感染率(60%,51.35%)明显高于父母H pylori感染均阴性者(11.11%,P＜0.05).以家庭为单位进行的血清Western blot分析发现各种血缘关系家庭成员,其血清抗体平均相似度较之家庭间成员的平均相似度并没有差别(F=1.22,P＞0.05),两两比较结果亦无差别.结论:该地区居民的H pylori感染率属于中等水平,男女感染率没有差别.H pylori感染存在家庭聚集性.
-
Hedgehog信号蛋白在胰腺癌中的表达及临床意义
目的 研究Hedgehog相关信号蛋白Ihh、Ptc和Smo在胰腺癌中的表达情况及其临床意义.方法 采用免疫组织化学方法 检测54例原发性胰腺癌及5例正常胰腺石蜡标本中Hedgehog信号蛋白(Ihh、Ptc、Smo)的表达情况,并统计分析其阳性率与临床病理特征的相关性;采用Westernblot比较21例新鲜胰腺癌及癌旁胰腺组织标本Hedgehog信号蛋白表达量的差异.结果 54例胰腺癌标本中,Ihh、Ptc及Smo阳性率分别为70.4%、64.8%和88.9%,5例正常胰腺组织中均无阳性表达;Ptc阳性率与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移情况及肿瘤TNM分期显著相关,Smo表达率则与肿瘤分化程度显著相关(P<0.05);21例新鲜胰腺癌标本中Ihh、Ptc、Smo平均表达量均显著高于癌旁胰腺组织(P<0.05).结论 胰腺癌组织中Hedgehog信号蛋白表达量显著增加;Hedgehog信号蛋白与胰腺癌临床病理特征相关.
关键词： 胰腺肿瘤 Hedgehog 免疫组化 Western blot -
去肝脏胆碱能神经与大鼠肝细胞胰岛素信号转导关系的研究
目的通过研究去肝脏胆碱能神经(IHCD)大鼠肝细胞胰岛素信号转导过程中信号蛋白表达的改变,探讨IHCD对胰岛素信号转导的影响机制.方法选用健康Wistar大鼠30只, 随机分为手术组、术后给药组和假手术组,每组10只.手术组建立IHCD大鼠模型,术后给药组每日每只动物予罗格列酮0.08 mg灌胃一次,假手术对照.4周后处死实验大鼠,留取肝组织标本,用Western blot及免疫组织化学方法观察手术组大鼠胰岛素受体(IR)、胰岛素受体底物-1(IRS-1)、葡萄糖载体蛋白2(Glut2)等胰岛素信号蛋白及效应蛋白表达的改变,以及药物处理对这些蛋白表达的影响.结果 Western blot显示手术组大鼠肝组织内IR、IRS-1、Glut2蛋白表达较假手术组明显降低(P<0.05);术后给药组使用罗格列酮4周后,IR、IRS-1、Glut2蛋白表达较手术组有不同程度的升高(P>0.05),免疫组化的检查结果基本与之一致.结论 IHCD导致胰岛素信号转导通路中IR、IRS-1、Glut2等蛋白的表达降低,从而影响葡萄糖代谢过程,罗格列酮可增加它们的表达,肝脏胆碱能神经的完整性对调节和维持葡萄糖代谢的平衡具有一定的作用.
关键词： 胰岛素信号转导 IHCD Western blot 罗格列酮 -
雌激素对子宫内膜癌孕激素受体亚型调控的研究
目的研究不同剂量雌激素(雌二醇,E2)对子宫内膜癌细胞系中孕激素受体亚型在蛋白水平的调控,探讨雌激素、孕激素受体亚型与子宫内膜癌的关系.方法体外培养子宫内膜癌细胞系HEC-IB,分别用含5 nm、10 nm、20nm雌二醇的培养液分别作用于细胞24、48、72 h,以不含雌二醇的培养液培养细胞为自身对照.通过Western blot方法观察不同剂量雌激素对孕激素受体亚型A、B的蛋白水平调控的动态变化,并以乳腺癌细胞系MCF-7为对照.结果①HEC-IB细胞分别经5nm、10 nm、20nm的E2作用24、48、72 h后,与未加药的细胞相比,不同浓度、时间下E2对hPRB调控作用均不明显;而对hPRA的作用在E2 5 nm时下调,且随时间延长,下调作用越加明显;在10nm的第24、48h下降,其后渐上升,而在E2 20nm作用72 h时基本恢复加药前的水平.②MCF-7细胞分别经E2 5 nm、10 nm、20nm作用24、48、72 h后,与未加药的细胞相比较,各种浓度及时间下,E2对hPRA、B有上调作用的趋势;其中10 nm的E2上调作用较为明显,各种浓度的E2在第48h的上调作用更为显著.结论E2对hPR亚型的调控具有细胞特异性、时间及剂量的依赖性.HEC-IB细胞中,各种浓度、时间下E2对hPRB调控作用均不明显;而对hPRA的调控作用具有下调的趋势.
关键词： 孕激素受体亚型 子宫内膜癌 调控 Western blot -
子宫内膜癌细胞中孕激素受体的多因素调节
目的通过体外实验研究雌激素、孕激素、胰岛素/胰岛素样生长因子Ⅰ(Insulin-like growth factor Ⅰ,IGF-Ⅰ)对内膜癌细胞中孕激素受体(Progesterone receptor,PR )亚型表达的调节,探讨内膜癌细胞中PR亚型表达的意义.方法体外培养高分化子宫内膜癌细胞Ishikawa,按实验目的分别加入雌激素、孕激素、雌激素孕激素联合、胰岛素及IGF-Ⅰ刺激24 h、48 h后,采用Western blot 方法测定各个条件下内膜癌细胞中两种孕激素受体亚型的表达.结果内膜癌细胞Ishikawa在自然状态下,PR-A和PR-B均阳性表达;细胞经血清限制后,总PR及两种亚型都明显下调.雌激素可以上调细胞中PR-A和PR-B表达水平,但在高血清时明显.孕激素单独或雌、孕激素联合应用在48 h时都可以降低Ishikawa细胞中PR表达.胰岛素/ IGF-Ⅰ在24 h时可以上调PR-B水平,48 h时此上调作用消失.结论①雌激素对PR的上调作用与血清浓度有关,血清中可能含有雌激素作用所需要的某些因子;②孕激素对内膜癌细胞Ishikawa中PR有下调作用;③胰岛素/IGF-Ⅰ可以上调内膜癌细胞中PR表达,主要是PR-B表达,但此作用持续时间短.
关键词： 子宫内膜癌 孕激素受体 Western blot 调节 -
VEGF-C短发夹RNA抑制乳腺癌细胞增殖及侵袭能力的实验研究
目的 探讨应用靶向VEGF-C的短发夹RNA(shRNA)质粒载体在体外抑制乳腺癌细胞株MCF-7生物学活性的影响.方法 制备携带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的VEGF-C-shRNA质粒载体,脂质体转染方法转入乳腺癌细胞株MCF-7,通过倒置荧光显微镜及流式细胞术检测细胞的转染效率,RT-PCR及Western blot检测转染细胞内VEGFC mRNA及蛋白的表达变化,MTT法检测细胞增殖抑制率,重组基底膜侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果 高效转染入VEGF-C-shRNA的MCF-7细胞VEGF-C mRNA及蛋白表达水平显著下降;VEGF-C ShRNA对MCF-7细胞具有明显的增殖抑制作用,其抑增殖效应呈时间依赖性;VEGF-C-shRNA可抑制乳腺癌细胞MCF-7体外侵袭重组基底膜的能力,与阴性shRNA转染组、空载体组及空白组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);结论 VEGF-C在乳腺癌增殖、侵袭转移中发挥重要作用,通过RNA干扰技术实现VEGF-C沉默在乳腺癌的基因治疗中具有可行性.
