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艾蒿花粉主要变应原的分离、纯化与鉴定
目的对我国蒿属花粉中常见、重要的变应原艾蒿花粉进行分离、鉴定与纯化.方法采用不同的提取液得到艾蒿花粉粗浸液,经饱和(NH4)2SO4分级沉淀后用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质组分,并用凝胶成像系统测定各组分的相对分子质量(Mr);采用Western blot鉴定其主要及次要变应原;通过DEAE-Cellulose DE-32离子交换层析(ion exchange chromatography,IEC)和Sephadex G-75凝胶层析(gel chromatography)对艾蒿花粉变应原进行纯化.结果分离后得到20多种蛋白质组分,其中Mr为58×103、38×103、25×103、20×103、16×103等5个条带蛋白含量丰富;分离到的蛋白质组分中有9种蛋白能与确诊的蒿属花粉过敏患者血清中蒿属花粉特异性IgE结合,其中Mr为62×103、43×103、38×103的蛋白条带的结合率高;经纯化后仅得到Mr为62×103的主要变应原.结论艾蒿花粉的主要变应原Mr分别为62×103、43×103和38×103,层析技术可以对Mr为62×103的主要变应原成分进行纯化.
关键词： 艾蒿花粉 SDS-PAGE Western blot 离子交换层析 凝胶层析 -
尿素氮对糖化血红蛋白检测的影响
目的 探讨血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)浓度在两类不同糖化血红蛋白(HbA1c)检测系统中对HbA1c检测结果的影响.方法 选择非糖尿病患者53例,其中包括非肾病BUN升高患者24例(1组)和肾病患者29例(2组),糖尿病肾病患者21例(3组).采用Primus Ultra2亲和层析HPLC系统和Bio-Rad Variant Ⅱ的HPLC离子交换系统检测受检者静脉血HbA1c,对两套系统的检测结果做对比分析.结果 2组和3组离子交换层析检测HbA1c结果较亲和层析检测结果偏高且差异具有统计学意义(P均＜0.05),1组中HbA1c检测结果前者低于后者差异无统计学意义(P＞0.05);各组两类检测系统检测结果均具有较好的相关性;1组中两类检测系统检测结果差值的95%CI为-0.286～0.043,且差异无统计学意义(P＞0.05),其他两组两类检测系统检测结果差值的95%CI下限分别为0.284、0.337,且差异均有统计学意义(P均＜0.01);3组中两类系统检测结果的差值与BUN浓度有较好的相关性(P＜0.05),其余两组两类系统检测结果的差值与BUN浓度无相关性(P均＞0.05).结论 对于BUN升高的肾病患者,使用亲和层析检测方法,更能准确有效反映HbA1c的真实结果.
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DNA聚合酶γ的提取、纯化和鉴定
目的:提取并纯化人宫颈癌细胞(HeLa)的线粒体DNA聚合酶γ(DNA polymeraseγ,Pol γ),鉴定其纯度和活性.方法:运用离子交换层析等方法提取纯化HeLa细胞的线粒体Pol γ,并用Bradford法检测蛋白浓度.经SDS-PAGE检测蛋白纯度和相对分子量,Western blotting验证蛋白.用α-32PdTTP掺入法,液体闪烁计数器进行放射性测量以确定Polγ的活性.结果:成功提取并纯化HeLa细胞的线粒体Polγ,经SDS-PAGE鉴定,有一个大约140 kDa的亚基单位,Western blotting证实为Pol γ.对其进行150倍纯化,收得率为6%,酶的总活力为4.81 U,比活力为36.17 U/mg.结论:HeLa细胞的线粒体Pol γ通过离子交换层析法提取和纯化后活性较高,可用于体外药物线粒体毒性的检测.
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三裂叶豚草花粉致敏蛋白组分的分离、纯化及鉴定
目的 分离、纯化及鉴定三裂叶豚草花粉致敏蛋白组分.方法 提取三裂叶豚草花粉粗提液,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离粗提液蛋白组分并测定其分子量.收集存在变态反应患者血清,通过免疫印迹法(Western-blotting)对花粉致敏蛋白组分进行鉴定,用离子交换层析初步纯化其致敏蛋白组分,并通过Western-blotting鉴定.结果 三裂叶豚草花粉有30余条蛋白条带,其中有14条主要条带,其特异性致敏蛋白组分的相对分子质量为63 000、56 000、40000和36 500,主要为63 000、40000和36 500.三裂叶豚草花粉通过离子交换层析纯化出相对分子质量分别为63000、40000和36 500的致敏蛋白组分主要集中在Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ峰.结论 初步分离、纯化及鉴定了三裂叶豚草花粉致敏蛋白组分.
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离子交换层析法制备高纯度人凝血因子Ⅷ的研究
目的:从血浆冷沉淀中采用离子交换层析法纯化人凝血因子Ⅷ.方法:冰冻血浆在2～8℃环境下融化,离心法收获冷沉淀.用注射用水溶解冷沉淀,探索了5种冷沉淀溶解液预纯化的方法.冷沉淀溶解液经S/D病毒灭活后采用离子交换层析纯化人凝血因子Ⅷ,经超滤、配制、除菌分装、冻干、干热病毒灭活,获得人凝血因子Ⅷ成品,分别检测流穿液、洗涤液和洗脱液中人凝血因子Ⅷ效价和蛋白含量.观察了冻干和不同干热条件前后凝血因子Ⅷ活性的变化.观察人凝血因子Ⅷ冻干品的外观和复溶时间.结果:冷沉淀中人凝血因子Ⅷ的回收率为40％ ～70％.5种冷沉淀溶解液预纯化方法中,用盐酸调节pH至6.6、6.3的方法人凝血因子Ⅷ回收率较高.离子交换层析流穿液中FⅧ损失率小于5％,而洗涤液中FⅧ损失率较高,高损失率超过20％.人凝血因子Ⅷ中蛋白质含量较低,均小于0.65 mg·mL-1,比活性为50～100IU·mL-1.吐温-80和TNBP的残留量均符合《中国药典》的要求.冻干过程中人凝血因子Ⅷ效价下降大约1％～5％.100℃,30 min干热处理对FⅧ效价的破坏小于80℃,72 h.人凝血因子Ⅷ冻干品外观和复溶时间均达到中国药典标准.结论:采用离子交换层析法从血浆冷沉淀中分离出高纯度人凝血因子Ⅷ,可以进行工艺放大研究.
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从两株微小亚历山大藻中分离纯化膝沟藻毒素
目的从两株微小亚历山大藻(Alexandrium minutum Halim)中分离纯化膝沟藻毒素(Gonyautoxins).方法用胶滤层析、离子交换层析等方法从人工培养的两株微小亚历山大藻酸酒精萃取物中分离纯化膝沟藻毒素,再用HPLC法对毒素进行定性定量测定.结果从两株藻株培养液中均分离得到膝沟藻毒素GTX-4,GTX-1,GTX-3,GTX-2,其中Amtk4藻株的毒素含量为Amtk2的近10倍.结论微小亚历山大藻Amtk4藻株适于制备膝沟藻毒素.
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L-多巴药物的制备及生化工艺
根据生物制药原理,用黄曲霉菌种通过微生物发酵作用大量产生黄曲霉,再度利用黄曲霉中的β-酪氨酸酶的作用把L-酪氨酸转化成L-多巴;利用生化工艺方法,通过系列的实验达到提纯目的药物.
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中药望江南子抗真菌蛋白成分研究
以往中药研究较少涉及蛋白质成分的作用.前人曾报道望江南(Cassia occidentalis L.)种子和其它同属药用植物种子的水浸剂有抑制多种人体真菌活性,并确定决明(C.obtusifolia L)和小决明(C.tora L.)的种子中小分子化合物为活性成分.本实验以绿色木霉(Trichoderma viride Persoon ex Friex Accc30048)和红色酵母为指示菌,发现中药望江南子和决明子的水溶性成分均有抗真菌活性,但经蛋白变性处理或热处理后,望江南子的抗真菌活性丧失.经含DDT和PVPP的缓冲液低温抽提、一20℃丙酮沉淀及在FPLC上进行Superdex 75(16/88)凝胶过滤、Mono S(5/5)离子交换层析和RESOUCE PHE(1ml)疏水层析,从望江南种子中纯化到一种相对分子量28 000的单链抗真菌蛋白(Co-AFP).本工作首次从决明属植物望江南的种子中发现了抗真菌蛋白,为药用植物活性蛋白的进一步研究创造了条件.
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植物降糖多肽的提取及其降糖作用的实验研究
苦瓜是葫芦科苦瓜属植物苦瓜的果实,具有消暑涤热、明目解毒的作用.1981年,印度学者Khanna采用有机酸、醇提取,薄层层析方法从苦瓜果实中分离出一种多肽,并证实该多肽有降低血糖的作用.自此,国内外学者即开始了这方面的大量研究.目前,业已证明苦瓜降糖多肽具有166个氨基酸残基,相对分子量约为11,000.同时,学者们也基本建立了有机酸、醇,薄层层析,凝胶过滤,高效液相色谱技术,这一程序化的实验室分离方法 [1].然而,这种分离方法在很大程度上不能够满足大量制备降糖多肽而使其得到广泛应用的需要.经过多年的研究与改进,我们建立了有机酸、醇提取,盐析,离子交换层析的纯化苦瓜降糖多肽的方法,并对其降糖作用加以分析.
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中华芦荟中性糖的分离与鉴定研究
目的为更深入地研究中华芦荟活性成分的组成及化学结构.方法采用DEAE-Sephadex A-25作为填料,通过离子交换柱层析分离.结果从中华芦荟原始多糖中分离并提纯得到一种中性糖,经过IR、HPLC、TGA、13CNMR、碱性水解及元素分析测定,证明这是一种纯度较高的、部分乙酰化的β-1,4-D-聚吡喃甘露糖,其中糖链中甘露糖与乙酰基的物质的量之比为1.64:1.结论该多糖为首次分得.
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外用人纤维蛋白原的分离纯化［1］
目的：建立一种外用人纤维蛋白原的制备工艺。方法：以血浆冷沉淀为原料，利用铝胶吸附、酸沉淀、离子交换层析、低温乙醇沉淀等方法提取人纤维蛋白原。参考中国药典方法检测外用人纤维蛋白原的复溶时间、凝固活力、纯度、人凝血因子 XⅢ效价等主要指标。结果：本研究制备的产品具有复溶时间短、凝固活力强、纯度高等优点，产品质量明显高于国家标准，优于市场上同类产品。结论：本研究建立的外用人纤维蛋白原的制备工艺，能有效提高血浆的综合利用率，具有极高的经济价值和社会价值。
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刀额新对虾变应原的分离、鉴定与纯化
目的 通过对我国常见的刀额新对虾变应原蛋白进行分离、鉴定与纯化,以提供虾特异性变应原用于食物变态反应疾病的诊断和治疗.方法 通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离刀额新对虾的蛋白质组分并测定其分子量,收集过敏病人血清,采用免疫印迹(Western-blotting)法鉴定其变应原成分,通过离子交换层析对刀额新对虾变应原进行初步纯化,通过疏水层析和凝胶过滤层析进一步对变应原纯化.结果 刀额新对虾有17条蛋白带,其中主要条带有10条,68和36 kD为可与虾过敏性病人血清IgE结合的特异性变应原;通过各种层析方法纯化出刀额新对虾68kD变应原,纯度为96%.结论 对刀额新对虾变应原进行分离、鉴定和纯化,得到高纯度的68 kD刀额新对虾变应原,为临床虾变态反应疾病的诊断和治疗奠定基础.
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点带石斑鱼过敏原分离、鉴定与纯化
目的 对点带石斑鱼的主要过敏原进行分离、鉴定与纯化.方法 通过十二烷基硫酸钠-聚丙炳酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离点带石斑鱼的蛋白质组份,采用免疫印迹(western-blotting)方法鉴定过敏原,通过离子交换层析对主要过敏原进行初步纯化.结果 SDS-PAGE结果显示,点带石斑鱼粗提液含有13条蛋白带,含量高的有8条,分子量分别为43,34,28,25,22,17,15,9 kD;westem-blotting显示,对点带石斑鱼过敏患者的阳性混合血清能与其中4个蛋白条带起反应,分子量分别为34,28,24,22 kD.离子交换层析可初步纯化出22 kD的过敏原蛋白.结论初步分离得到分子量为22 kD的点带石斑鱼主要过敏原,为临床诊断和治疗鱼类过敏性疾病提供理论依据.
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鸡蛋过敏原分离、鉴定与纯化
目的 对鸡蛋中主要过敏原进行分离、鉴定与纯化.方法 分别提取鸡蛋的蛋清与蛋黄的蛋白,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离鸡蛋的蛋白质组份,采用免疫印迹(Western-blotting,wB)方法鉴定过敏原,通过离子交换层析对鸡蛋主要过敏原进行初步纯化.结果 WB检测显示,蛋黄与鸡蛋过敏患者的阳性混合血清没有反应;蛋清中有4条蛋白带起反应,分子量分别为83,71,38,13 kD,尤以13 kD的蛋白质为明显,离子交换层析可初步纯化出13 kD的过敏原蛋白.结论 鸡蛋的主要过敏原为13 kD的蛋白质,为临床诊断和治疗鸡蛋过敏性疾病提供标准化的过敏原提供了基础依据.
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杂色曲霉菌变应原分离、鉴定及纯化
目的 对杂色曲霉菌变应原蛋白进行分离、鉴定与纯化.方法 提取杂色曲霉菌蛋白质,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,用免疫印迹(western-blot)鉴定变应原成分,用western-blot法鉴定出了6种变应原,通过离子交换和凝胶过滤层析纯化变应原.结果 碳酸氢盐-盐水提取液(Coca's液)共提取出23条蛋白质条带,分子量为17、20和62 kD的蛋白质为杂色曲霉菌主要变应原,而分子量为22、35和76kD的蛋白质为次要变应原;通过各种层析纯化变应原,得到含有分子量为20kD主要变应原和35kD的次要变应原的组分.结论 鉴定了杂色曲霉菌的主要和次要变应原并部分纯化出其变应原组分,为变态反应疾病的诊断和治疗提供依据.
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P物质和P物质受体
P物质(Substance P,SP)是1931年von Euler和Gaddum在马脑和肠的提取物中偶然发现的一种物质,1953年Pernow应用氧化铝柱吸附技术获得了第一代纯化的制剂,1971年Chang等将牛下丘脑提取物经凝胶过滤、离子交换层析及高压纸上电泳后确定了 SP的分子序列,闸明了其化学结构为十一肽,H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-GlnPhe Phe-Gly-Leu-Met NH2,分子量为1348,属于速激肽(TK)族. 1979年Vijayan首次报道了 SP与生殖功能有关[1,2].本文主要介绍SP与生殖的关系、P物质的作用机理.
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长白山乌苏里蝮蛇降纤酶层析分离和特性研究
采用简洁、高效、高产、高速及制药企业容易实施的分步洗脱制备降纤酶工艺，生产的降纤酶符合部颁标准，并适合制药企业连续大规模生产。
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大籽蒿花粉过敏原的分离、鉴定与纯化
目的：对我国蒿属花粉中常见的大籽蒿花粉进行分离、鉴定与纯化。方法：提取大籽蒿花粉粗浸液，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质组分，并用凝胶成像系统测定各组分的相对分子质量（Mr）；免疫印迹（Western blot）鉴定花粉主要过敏原；通过DEAE-Cellulose DE-52离子交换层析（ Ion exchange chromatography ，IEC）对大籽蒿花粉过敏原进行纯化和免疫印迹鉴定。结果：分离后得到20多种蛋白组分，其中分子量（ Mr）为62、57、38、29、25、14 kD 6个条带蛋白含量丰富，其中Mr为62 kD和16 kD的蛋白条带与确诊的蒿属花粉过敏患者血清特异性IgE结合率高（均＞50％），为其主要过敏原，离子交换层析纯化后可得到Mr为62、16 kD的过敏原。结论：大籽蒿花粉的主要过敏原为Mr 62 kD和16 kD的蛋白组分，离子交换层析技术可以对Mr为62 kD、16 kD的主要过敏原成分进行纯化。
关键词： 大籽蒿花粉 过敏原 SDS-PAGE Western blot 离子交换层析 -
超滤技术去除重组MUC1-MBP融合蛋白中内毒素的效果评价
目的：评价超滤技术去除纯化后重组 MUC1-MBP融合蛋白（MUC1-MBP）溶液中内毒素的效果，阐明超滤技术对去除内毒素的作用。方法：选取表达 MUC1-MBP大肠杆菌基因工程菌，分别通过 CM Sepharose FF离子交换层析（CM）（CM 组）、CM 联合 Phenyl Sepharose 6 FF 疏水层析（C6）（CM＋C6组）、CM 加超滤（CM＋超滤组）以及CM联合C6加超滤（CM＋C6组＋超滤）进行纯化，并去除内毒素；采用 SDS-PAGE 分析蛋白纯度；鲎试剂显色基质法检测内毒素表达水平。结果：SDS-PAGE分析，在预期相对分子质量62000处呈现单一条带， Quantity One分析纯度＞96％；CM组与CM＋C6组内毒素表达水平均较高，但2组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与 CM 组比较， CM＋超滤组内毒素表达水平明显降低（P＜0.01）；与 CM＋C6组比较， CM＋C6超滤组内毒素表达水平明显降低（P＜0.01）；CM＋超滤组与CM＋C6＋超滤组内毒素表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：CM或 CM联合 C6均不能有效去除内毒素，其中 C6对去除内毒素几乎无作用；CM加超滤可有效去除内毒素，超滤技术在去除内毒素中发挥重要作用。
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低分子肝素分离方法的临床研究
低分子肝素制剂的临床应用越来越广泛.该制剂要求低分子肝素的分子量分布符合欧洲药典的要求,因而要求低分子肝素的原料分子量分布在药典规定的范围内,且质量稳定性高.在此基础上,我们通过离子交换层析技术,成功得到了符合欧洲药典要求的产品.
