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糖化血红蛋白检测方法研究进展
目前,糖化血红蛋白(HbA1c)可作为糖尿病筛选、诊断、长期血糖控制、疗效评估的有效监测指标[1],在临床中广泛应用.HbA1c对总死亡率的预测价值超过胆固醇浓度、体质量指数和血压,HbA1c下降1%导致微血管并发症危险性减少35%,严格控制血糖水平可使眼睛病变、神经病变、心血管病变和肾脏病变降低[2].1 糖化血红蛋白HbA1c的特性1962～1965年Rahbar在电泳溶血产物时发现一条异常快速泳带组分,后来证实此快速泳动的Hb实际上与HbA1c的结构相同,在糖尿病患者血清中浓度增加2～3倍[3].
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血红蛋白异常对高效液相色谱法检测糖化血红蛋白的影响
目的 探讨血红蛋白(Hb)异常对高效液相色法谱检测糖化血红蛋白(HbA1c)的影响.方法 使用国内常用的硼酸盐亲和层析高效液相色谱法(PDQ系统)及离子交换层析高效液相色谱法(D-10系统)进行含有不同(梯度)浓度HbF与正常人血液混合的标本的干扰实验及检测40例Hb异常的临床标本中的HbA1c.结果 在干扰实验中,D-10系统在HbF在浓度超过40%时,可能无法获得检测结果,当HbF浓度在10%～40%时,结果高于实际值,HbF在浓度低于10%时,结果与实际值相似;PDQ系统在HbF浓度超过40%时,结果可能略低于实际值,HbF浓度低于40%时,可以获得好的结果.在40例Hb异常的临床标本中,D-10系统检测结果明显高于PDQ系统,差异具有统计学意义(P<0.05),其中有5例Hb异常总量超过35%的标本在D-10系统中无法获得检测结果,而PDQ检测获得可接受的结果;Hb异常总量低于10%时,两种方法检测结果有较好的一致性(P＞0.05).结论 硼酸盐亲和层析抗Hb异常的干扰能力优于离子交换层析.
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不同分子质量段全蝎蛋白对转基因斑马鱼血管生成的影响
目的：研究不同分子质量段全蝎蛋白对转基因斑马鱼血管生成的影响。方法：建立转基因斑马鱼模型。先后以超滤法、离子交换层析法对全蝎蛋白进行分离，获得不同分子质量段的全蝎蛋白（3～10 ku、＞10～50 ku、＞50 ku）。以10、100、500μg/ml的上述全蝎蛋白培养转基因斑马鱼胚胎，荧光显微镜下对转基因斑马鱼节间血管进行计数，优选全蝎蛋白适分子质量段；以＞50 ku全蝎蛋白1、2成分再次进行上述培养与血管计数，优选适成分。结果：质量浓度为500μg/ml的＞50 ku全蝎蛋白1成分抑制斑马鱼血管生成活性强，抑制率为92.59％。结论：全蝎蛋白及其相关成分具有抑制血管生成的活性，可能为全蝎抗肿瘤的机制之一。
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离子交换层析法纯化原核表达的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白
目的 纯化原核表达的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白.方法 将pET28a-TRIAL转入BL21(DE3),先进行硫酸铵初级分离,然后利用CM Sepharose阳离子交换柱进行离子交换层析进行纯化.结果 在20℃条件下,使用0.5 mmol/LIPTG诱导8h,TRAIL蛋白表达量达到大；经硫酸铵初步分离和离子交换层析纯化后,从1L菌液纯化得到5.8mg纯净的TRAIL蛋白.结论 成功建立了一种原核表达TRIAL蛋白的大规模纯化方法.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 离子交换层析 纯化 -
重组人瘦素的分离纯化
目的:探索毕赤酵母表达的人瘦素的非亲和层析纯化方法.方法:采用强阴离子交换柱(Sepharose Qfastflow)和疏水层析柱(Phenyl Sepharose 6 fastflow)在pH 7.5的条件下进行纯化.结果:经Q柱一步纯化后,产物纯度由42.3%到达89.6%,随后通过疏水层析纯化后,产物纯度达到96.2%.经SDS-PAGE证实为单一蛋白条带.结论:通过上述手段已成功分离纯化得到纯度较高的由毕赤酵母表达的重组人瘦素.
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烧伤后血清中造血刺激活性组分分析
目的检测烧伤血清中是否有异常的造血刺激活性组分出现,并对其性质作初步鉴定.方法采用离子交换层析分离正常及烧伤血清,用CFU-E、CFU-GM集落培养法检测各分离组分在烧伤前后造血刺激活性的变化,并对其进行热、酸、碱和酶处理后进一步检测造血活性.结果小鼠烧伤血清经离子交换层折后得到A、B、C、D 4个组分,其中A、B组分红系造血刺激活性增高;C组分对红系和粒系造血刺激活性增高;且活性强.D组分不具有造血刺激活性.A、B、C 3组分经酸处理和胰酶消化后活性消失,A、B组分经碱处理和热处理后活性消失,而C组分加热70 ℃以及经碱处理后仍保持部分活性.结论①烧伤后血清经离子交换色谱分离得到的A、B、C、D 4组分中,A、B组分具有红系刺激活性,C组分活性强,对红系和粒系均有刺激.②A、B、C 3个活性组分均为蛋白质,C组分对酸不稳定,对热和碱具有一定的稳定性,而A、B两组分既不耐热,对酸碱均不稳定.
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离子交换层析微柱法及亲和电泳法与液相色谱分析法对糖化血红蛋白含量测定的比较
目的探讨微柱法对HbA1C定量检测的意义.方法采用微柱法、电泳法与HPLC法分别对同一标本进行HbA1C含量测定,比较3种方法对HbA1C含量检测结果.结果微柱法精确度和重复性好(批内变异系数CV<1.5%,批间CV<5%),与参比方法HPLC经相关处理,其相关系数r=0.945,两法具有高度的相关性(P<0.001).结论采用微柱法对HbA1C定量测定,无须贵重仪器设备,是一种简便快速的测定方法,能在大多数临床实验室广泛推广.
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斑节对虾过敏原的分离、鉴定与纯化
目的 对斑节对虾的主要过敏原进行分析、鉴定与纯化.方法 通过SDS-PAGE电泳分离斑节对虾的蛋白质组份,采用免疫印迹(Western-blotting)方法鉴定过敏原,通过离子交换层析对斑节对虾主要过敏原进行初步纯化.结果 斑节对虾粗提液SDS-PAGE显示其主要蛋白条带主要有7条,Western-blotting显示对斑节对虾过敏患者的阳性混合血清能与7个蛋白条带起反应,相对分子质量分别为71 000、43 000、34 000、23 000、21 000、20 000和19 000,离子交换层析可初步纯化出相对分子质量为34000和21 000的过敏原蛋白.结论本实验对斑节对虾过敏原进行了分离和鉴定,并初步纯化出斑节对虾的主要过敏原.
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方斑东风螺过敏原的分离、鉴定与纯化
目的 对方斑东风螺的主要过敏原进行分析、鉴定与纯化.方法 通过SDS-PAGE电泳分离方斑东风螺的蛋白质组份,采用免疫印迹(Western-blotting)方法 鉴定过敏原,通过离子交换层析对方斑东风螺主要过敏原进行初步纯化.结果 方斑东风螺粗提液SDS-PAGE显示其主要蛋白条带主要有7条,Western-blotting显示过敏患者的阳性混合血清能与其中3个蛋白条带起反应,相对分子质量分别是56 000、28 000和22 000.离子交换层析可初步纯化出28 000和22 000的过敏原蛋白.结论 本实验对方斑东风螺过敏原进行了分离和鉴定,并初步纯化出方斑东风螺的主要过敏原.
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椰子花粉过敏原的分离、鉴定与纯化
目的 对椰子花粉的变应原组分进行初步的分离、鉴定及纯化.方法 提取椰子花粉粗提液,用十二烷基硫酸钠.聚丙烯酰胺凝胶电泳(sDS-PAGE)分离椰子花粉的蛋白质组分并测定其相对分子质量,采用免疫印迹法鉴定其变应原成分,并通过离子交换层析对椰子花粉变应原进行初步分离纯化,免疫印迹进行检测.结果 SDS-PAGE显示椰子花粉粗提液有10条蛋白带,其中相对分子质量(肘,)为60 000、50 000、35 000、28 000、19 000、16 000和14 000的蛋白可与椰子花粉过敏性病人血清IgE结合,且M,50 000、16 000和14 000为主要变应原;离子交换层析结果显示主要过敏原成分主要分布在V峰中.结论 对椰子花粉变应原进行了初步的分离、鉴定和纯化,为临床椰子花粉变态反应疾病的诊断和治疗奠定了基础.
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人凝血因子Ⅷ原液生产工艺放大可行性研究
目的 对比3批小试(50 g冷沉淀)、3批小规模放大(400 g冷沉淀)和3批中试级(5～ 10 kg冷沉淀)试验结果探讨人凝血因子Ⅷ原液生产工艺放大的可行性.方法 Tris溶液复溶冷沉淀,经聚乙二醇沉淀后,0.3％磷酸三丁酯和1％Tween 80处理6h以灭活脂包膜病毒,然后经DEAE650M层析纯化.绝大部分杂蛋白和磷酸三丁酯及Tween80随流穿液直接流穿,洗脱峰样品即为人凝血因子Ⅷ原液.结果 3批小试人凝血因子Ⅷ活性回收率分别为30.50％、24.40％和25.60％,平均值26.83％,回收率变异系数8.52％;3批小规模放大回收率分别为19.40％、21.70％和22.00％,平均值21.04％,回收率变异系数5.54％;3批中试级回收率分别为14.50％、16.50％、17.80％,平均值16.27％,回收率变异系数8.34％.结论 对比级放大试验各级回收率及变异系数发现,工艺重复性好,放大可行.
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卵黄IT抗毒素亲和层析纯化大肠杆菌不耐热肠毒素
大肠杆菌不耐热毒素(Escherichia coli heat-labileenteratoxintoxin,LT)是产毒性大肠杆菌(ETEC)感染人畜引起急性腹泻的主要毒素之一,关于它的提纯方法有不少报[1-3],一般采用沉淀、超滤、浓缩、凝胶层析,离子交换层析及超速离心等多种技术联合使用.
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胶乳凝集法测定糖化血红蛋白(HbAlc)的探讨
糖化血红蛋白的测定经过了一个漫长的过程,方法也比较多,有微柱法离子交换层析、亲和层析等.这些过程不仅费时、费力,且结果的准确度和精密度也不理想,也无法自动化.近年来采用胶乳凝集法测定糖化血红蛋白,不仅可以自动化,而且准确度、精密度都较好,现将我们对比法的观察结果报告如下:
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猪血小板衍化生长因子的提取和纯化
目的建立一种简单、经济的血小板衍化生长因子(PDGF)的纯化方法. 方法血小板衍化生长因子(PDGF)具有耐酸性(pH 2.5),耐热(100℃)以及耐受2% SDS的特性. 采用酸醇提取、热处理、离子交换层析、分子筛等蛋白分离和纯化技术从猪血小板中提取和纯化PDGF. 结果猪血小板衍化生长因子(pPDGF)纯化倍数达7582倍, 活性回收率为3%. 结论本方法简单、经济,纯化的猪血小板衍化生长因子(pPDGF)具有明显的生物学活性.
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辛酸沉淀结合阴离子交换层析纯化马IgG的研究
目的 以辛酸沉淀结合离子交换层析纯化破伤风抗毒素马免疫血浆,获得高质量的马IgG,为抗毒素F(ab’)2的制备奠定基础.方法 通过对辛酸沉淀马血浆过程中的pH、辛酸浓度以及血浆稀释倍数的实验设计(DoE),研究不同条件对IgG纯度、效价、比活性、浊度以及过滤速度的影响,确定各工艺参数的可操作区间,并结合Capto DEAE阴离子交换层析以流穿模式进一步纯化IgG.结果 马血浆经一步辛酸沉淀获得的IgG纯度(SDS-PAGE)大于92％、分子排阻色谱(SEC)纯度大于95％,比活性较血浆提高2.14±0.29倍;辛酸沉淀后的IgG样品经阴离子交换层析,可有效去除聚合体以及小分子杂质,将纯度提高至95％ (SDS-PAGE)和98％ (SEC).结论 马血浆经辛酸沉淀和阴离子交换层析可获得高纯度、高比活的IgG.
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层析法从血浆分离静注人免疫球蛋白及其初步检定
目的：实验尝试采用多步柱层析的工艺取代乙醇低温沉淀的方法，能高效的从血浆中获得IVIG产品。方法：通过亲和层析、离子交换一套工艺纯化出IVIG产品，进而按照枟中华人民共和国药典枠对静注人免疫球蛋白（pH4）及其关键指标进行了检测。在此基础上还采用免疫浊度法等方法，对其纯度和非目的蛋白构成与国际产品进行比较。结果：工艺获得IVIG产品的关键性指标检测均达到枟中华人民共和国药典枠的要求，其质量不低于现有国际同类产品。结论：本工艺能以较高回收率获得高质量的IVIG产品。
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检测糖化血红蛋白两种不同方法的比较
糖化血红蛋白(HbA1c)为已连接有己糖的HbA1,其可作为糖尿病(DM)长期控制的良好指标,尤其对1型DM和GDM的治疗有监控作用.糖化血红蛋白的测定方法主要有色谱法、电泳法、免疫法和化学法.色谱法主要有离子交换层析、HPLC法和亲和法.免疫法主要包括免疫比浊法、放射免疫法(RIA)、酶免疫法(EIA)、胶乳免疫凝集法(LIAA)等[1].本文对竞争性透射免疫比浊法和HPLC法分别测定糖尿病者HbA1c的结果进行比较,以探讨竞争性透射免疫比浊法检测HbA1c其结果的准确性与可靠性.
