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非病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在小鼠32D细胞系中的表达
为了观察非病毒载体pRC/RSV介导的人凝血因子Ⅷ基因在小鼠32D细胞系中的表达,将B结构域缺失(△760aa-1639aa)的人FⅧcDNA(hFⅧBDcDNA)亚克隆至质粒载体pRC/RSV,构建重组质粒载体pRC/RSV-hFⅧBDcDNA.经SuperFeot Transfection Reagent转染小鼠32D细胞系,分别采用一期法、ELISA法和RT-PCR检测细胞培养上清液中人FⅧ的促凝活性(hFⅧ:C)和抗原含量(hFⅧ:Ag)以及细胞中hFⅧBDcDNA的转录.结果表明:小鼠32D细胞系培养上清液中的人FⅧ:Ag高达到了450.08毫微克/(106细胞·24小时),hFⅧ:C高达到了2.01单位/(106细胞·24小时),RT-PCR可检测到32D细胞中hFⅧBDcDNA转录的mRNA.结论:非病毒质粒载体pRC/RSV介导的人凝血因子Ⅷ基因能够在小鼠32D细胞系中表达人FⅧ蛋白,所表达的FⅧ与正常人血浆中的野生型FⅧ具有相似的凝血活性.
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人血浆凝血因子Ⅷ柱纯化前处理方法的比较
目的：对人血浆凝血因子Ⅷ（ coagulation factor Ⅷ，FⅧ）制备过程中4种柱纯化前处理方法进行比较并分析其优缺点，为血源FⅧ的纯化制备提供借鉴与参考。方法冷沉淀经Tris溶解后的上清，分别用甘氨酸沉淀法、PEG沉淀法、酸沉淀法和氢氧化铝凝胶吸附法处理；用活化部分凝血活酶（ APTT）法测定样品上清中FⅧ活性，计算总活性回收率和样品的比活性，用非还原性SDS－PAGE电泳比较去除杂蛋白的效果。结果4种处理方法中，甘氨酸沉淀法总活性回收率高[（94．00±7．60）％]，其次是酸性沉淀法[（89．47±2．60）％]、PEG沉淀法[（80．92±9．67）％]，氢氧化铝吸附法的总活性回收率低[（78．65±7．52）％]；甘氨酸沉淀法与PEG沉淀法去除杂蛋白的效果优于酸性沉淀法和氢氧化铝吸附法；经4种不同方法处理后，甘氨酸沉淀法所得样品中 FⅧ比活高[（0．6856±0．1258）IU／mg]，其次是PEG沉淀法[（0．5773±0．0787）IU／mg]、酸性沉淀法[（0．3885±0．0301）IU／mg]，氢氧化铝吸附法所得样品比活低[（0．2879±0．0472）IU／mg]。结论在上述方法中，甘氨酸沉淀法和PEG沉淀法的总体效果较佳，且因后者操作更加简便、快捷，在实际生产过程中采用PEG沉淀法较为合适。
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离子交换层析法制备高纯度人凝血因子Ⅷ的研究
目的:从血浆冷沉淀中采用离子交换层析法纯化人凝血因子Ⅷ.方法:冰冻血浆在2～8℃环境下融化,离心法收获冷沉淀.用注射用水溶解冷沉淀,探索了5种冷沉淀溶解液预纯化的方法.冷沉淀溶解液经S/D病毒灭活后采用离子交换层析纯化人凝血因子Ⅷ,经超滤、配制、除菌分装、冻干、干热病毒灭活,获得人凝血因子Ⅷ成品,分别检测流穿液、洗涤液和洗脱液中人凝血因子Ⅷ效价和蛋白含量.观察了冻干和不同干热条件前后凝血因子Ⅷ活性的变化.观察人凝血因子Ⅷ冻干品的外观和复溶时间.结果:冷沉淀中人凝血因子Ⅷ的回收率为40％ ～70％.5种冷沉淀溶解液预纯化方法中,用盐酸调节pH至6.6、6.3的方法人凝血因子Ⅷ回收率较高.离子交换层析流穿液中FⅧ损失率小于5％,而洗涤液中FⅧ损失率较高,高损失率超过20％.人凝血因子Ⅷ中蛋白质含量较低,均小于0.65 mg·mL-1,比活性为50～100IU·mL-1.吐温-80和TNBP的残留量均符合《中国药典》的要求.冻干过程中人凝血因子Ⅷ效价下降大约1％～5％.100℃,30 min干热处理对FⅧ效价的破坏小于80℃,72 h.人凝血因子Ⅷ冻干品外观和复溶时间均达到中国药典标准.结论:采用离子交换层析法从血浆冷沉淀中分离出高纯度人凝血因子Ⅷ,可以进行工艺放大研究.
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原料血浆冷沉淀提取工艺过程质量控制
目的:对原料血浆冷沉淀提取工艺过程进行质量控制,保证血浆安全和冷沉淀质量合格.方法:采用双缩脲法检测血浆和冷沉淀蛋白含量.用DR45密度计检测冷沉淀提取前后血浆密度.采用薄膜过滤法检查冷沉淀提取前后血浆微生物限度.采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和电泳扫描法,分析血浆中白蛋白和IgG百分含量.采用ACL7000全自动凝血分析仪检测凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ和Ⅷ效价.检测分析冷沉淀的质量.结果:冷沉淀提取前后血浆蛋白、密度、微生物限度、凝血因子Ⅷ效价明显下降,但血浆中白蛋白、IgG以及凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ效价无明显变化.5批冷沉淀中FⅧ的收获率均值为61.8％,其质量符合制备人凝血因子Ⅷ的标准.结论:通过对冷沉淀提取工艺过程的质量控制,有效保证了血浆和冷沉淀的质量.
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低剂量重组人凝血因子Ⅷ预防治疗儿童血友病A的效果评价
血友病A（HA）是一种常见的X染色体隐性遗传性疾病[1]，是由于凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因突变导致人体内凝血因子Ⅷ水平缺乏或降低的一种终身出血障碍性疾病，可引起关节和（或）肌肉异常出血的反复发生[2]。为了达到预防和治疗的目的主要是依靠反复输注FⅧ制剂来进行替代治疗。但这样会导致体内产生FⅧ抑制物，伴有FⅧ抑制物的患者其致残率及死亡率极高[3]，更容易发生出血。我国血友病患病率为2.73/10万人口[4]。
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逆转录病毒载体介导人凝血因子Ⅷ在哺乳细胞中的高效表达
目的建立逆转录病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ(FⅧ)体外高效表达体系.方法将一B区缺失(760aa～1639aa)的人FⅧ cDNA(FⅧcDNA BD)克隆至逆转录病毒载体pLNCX,构建了重组表达载体LNC-ⅧBD.经PA317细胞包装后,感染多种靶细胞.分别采用一期法、ELISA法和RT-PCR检测细胞培养上清中人FⅧ的凝血活性(FⅧ∶C)和抗原含量(FⅧ∶Ag)以及细胞中FⅧcDNA BD的转录.结果重组逆转录病毒载体LNC-ⅧBD在四种靶细胞中有不同程度的表达.其中以NIH3T3细胞的表达高,FⅧ∶C为1.6?U/106细胞*24?hrs-1,FⅧ∶Ag为500?ng/106细胞*24?hrs-1.CHO细胞表达的FⅧ∶C活性为0.12?U/106细胞*24?hrs-1,FⅧ∶Ag为62.4?ng/106细胞*24?hrs-1.FⅧ在Cos-7和一正常成人肝细胞系L-02中表达较低.RT-PCR可检测到靶细胞中人FⅧcDNA BD的转录的mRNA.结论逆转录病毒载体能够介导人FⅧ的体外高效表达,为血友病A的基因治疗奠定了基础.
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白细胞介素6诱导人凝血因子Ⅷ基因的体外表达
血友病A是一种单基因遗传病,基因治疗有可能根治本病,因此,近二十年来国内外在血友病A基因治疗的研究方面做了大量工作,取得了一定进展,但总的效果并不理想,焦点是凝血因子Ⅷ(FⅧ)的表达量低,表达持续时间短[1].
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柱前衍生法测定人凝血因子Ⅷ中甘氨酸含量
目的 建立人凝血因子Ⅷ中甘氨酸含量测定的一种新方法.方法 采用反相高效液相色谱法,在色谱柱内层析,以紫外检测器在254nm波长处检测,用内标法计算含量.结果 在本实验条件下,甘氨酸与内标物质峰的分离度符合要求；甘氨酸在0.1352-0.8112mg/ml范围内线性关系良好；精密度实验中甘氨酸RSD值为0.23％；平均回收率99.73％,RSD值为1.03％；溶液稳定性检测中,供试品溶液放置0,2,4,8h后分别进样,RSD值为1.2％.结论 此方法检测结果准确,可用于人凝血因子Ⅷ甘氨酸含量的测定.
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原子吸收分光光度法测定人凝血因子Ⅷ中铝残留量
目的 建立人凝血因子Ⅷ中铝残留量测定的一种新方法. 方法 采用原子吸收分光光度法,在309.3 nm波长处检测人凝血因子Ⅷ铝含量. 结果 在本实验条件下,铝残留量在2.0-30.0 μg/L范围内与吸光度呈良好的线性关系(A=0.010 2C +0.015 3,R2=0.997 3);精密度实验中连续进样10次吸光度RSD为1.84％;重复性实验中铝残留量RSD为7.48％;平均回收率97.4％,RSD为2.11％. 结论 此方法检测结果准确,可用于人凝血因子Ⅷ铝残留的测定.
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Lowry法测定人凝血因子Ⅷ蛋白含量
目的：对Lowry法应用于人凝血因子Ⅷ蛋白含量测定中的可行性进行研究。方法：考察S公司人凝血因子Ⅷ原液及成品，比较凯氏定氮法与Lowry法对蛋白测定结果产生的差异，及不同浓度保护剂对Lowry法的影响。结果：甘露醇对蛋白含量测定有明显正干扰，甘氨酸有负干扰；对样品进行预稀释，辅料在低浓度范围内，当甘露醇浓度为0.1%和甘氨酸浓度为0.3%时，可减少辅料的干扰作用。结论：适当稀释样品可减少保护剂的干扰，用Lowry法测定人凝血因子Ⅷ蛋白含量，简单快速准确可行。
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巧妙配制人凝血因子Ⅷ
甲型血友病关节炎患者手术后需要输入大量的人凝血因子Ⅷ,以预防伤口出血.人凝血因子Ⅷ为血液制品,性状为白色粉末,需用生理盐水将其溶解后经静脉输入.人凝血因子Ⅷ价格十分昂贵,在配制时要格外小心,避免浪费.临床常用注射器抽吸方法配制,容易造成药液滴洒及产生泡沫,导致药液的浪费及药效的降低.因此,我科护理人员探索了一种新型的配制方法,于2010年10月至2011年4月,我们将此配制方法应用于临床中,取得了良好效果,现报道如下.
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NO信号通过I-kappaB磷酸化激活人肝细胞内源凝血因子Ⅷ重表达的调控作用
目的：建立一氧化氮（NO）前体化合物 L-精氨酸激活人肝细胞 L02内源凝血因子Ⅷ（FⅧ）重表达的分子细胞生物学模型，探讨 NO信号激活 L02中内源 FⅧ重表达的调控通路及分子基础。方法：取对数生长期 L02细胞随机分为对照组、加药组（L-精氨酸）、抑制剂组（L-NAME和 L-精氨酸）和抑制剂对照组（L-NAME），分别培养12、24、36、48和60 h，采用流式细胞术检测作用48 h后 L02中人 FⅧ蛋白的表达，Griess法检测不同时间点 L02细胞内 NO水平，RT-PCR法检测 L02中人 FⅧ基因、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因、核转录因子（NF-κB1）基因和核因子κB（免疫球蛋白κ轻链基因增强子）抑制蛋白α亚基（I-κB alpha）基因的转录水平， Western blotting法检测 L02中人磷酸化 I-kappaB（磷酸化 I-κB）表达水平。结果：流式细胞术检测，加 L-精氨酸培养48 h后L02中出现人FⅧ蛋白的表达。Griess法检测，加药组L02在3、6和12 h内NO表达水平显著增加（P＜0.05），随后又基本恢复到正常水平，正常组、抑制剂组和抑制剂对照组 L02细胞内 NO 水平无变化；RT-PCR检测，加药组 L02中人 FⅧ mRNA转录；对照组、抑制剂组和抑制剂对照组均无人 FⅧ mRNA的转录，加药组 iNOS、NF-κB1和 I-κB alpha转录水平均上升（P＜0.05），对照组、抑制剂组和抑制剂对照组上述基因转录水平均无明显变化。Western blotting 法检测，加入 L-精氨酸后，磷酸化 I-κB表达水平明显增加（P＜0.05），其他组则无此变化。结论：L-精氨酸通过 NO信号通路进而激活 I-κB磷酸化，导致人 FⅧ基因启动子上游调控相关的转录因子 NF-κB1进入胞核从而激活人离体肝细胞 L02中内源人 FⅧ的表达。
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不同配方的冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ制品干热法灭活猪细小病毒效果的影响
目的 研究不同配方的冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ制品干热法灭活非脂包膜指示病毒猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)效果的影响.方法 取人凝血因子Ⅷ原液,分别加入A、B、C3种配方(氯化钠浓度为C＜A＜B)缓冲液,经超滤透析制备人凝血因子Ⅷ半成品后,加入＞6 LgTCID50/ml的指示病毒PPV,进行冻干、干热法灭活(100℃30 min),检测残余PPV滴度;用筛选出的佳配方制备3批人凝血因子Ⅷ半成品,进行冻干和干热法灭活,检测残余PPV滴度,验证PPV灭活效果;按照《中国药典》三部(2010版)人凝血因子Ⅷ的成品检测要求对人凝血因子Ⅷ效价、外观、水分、复溶时间和复溶后外观进行检测.结果 在100℃30 min条件下,可有效灭活配方A制备的人凝血因子Ⅷ半成品中的指示病毒PPV,确定配方A为佳冻干保护剂配方;3批凝血因子Ⅷ经干热灭活后,可使残余PPV滴度下降(4.08±0.02) LgTCID50/0.1 ml,且灭活过程对人凝血因子Ⅷ的生物学活性无明显影响,步骤活性回收率为(91.1±2)％.结论 已成功研制出1种冻干保护剂配方,应用干热灭活法对人凝血因子Ⅷ制品中非脂包膜病毒PPV具有较好的灭活效果,该方法与有机溶剂/表面活性剂(solvent/detergent,S/D)法联合去除/灭活病毒,可有效提高人凝血因子Ⅷ产品的安全性.
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检测人凝血因子Ⅷ蛋白质含量的BCA法的优化及验证
目的 优化检测人凝血因子Ⅷ(FⅧ)蛋白质含量的BCA法,并进行验证.方法 对BCA法检测人FⅧ的蛋白质含量进行优化:模拟试管法进行化学反应,微量板法进行读数和计算;对优化后的BCA法的耐用性、标准曲线的线性和范围、准确性、重复性、中间精密性进行验证,并与传统的钨酸沉淀法、免疫散射比浊法和优化的凯氏定氮法的检测结果进行比较.结果 BCA法检测人血白蛋白(human serum albumin,HSA)蛋白质含量的可信区间为100～800 μg/ml.甘氨酸和赖氨酸的浓度小于125 mmol/L时,对BCA法检测结果无干扰;以HSA作为标准品绘制的标准曲线的可信区间为62.5 ～1 000 μg/ml,人FⅧ工艺样品在以HAS和BSA作为标准品绘制的两种标准曲线下的检测值差异无统计学意义(P＞0.05);BCA法的准确性、重复性、中间精密性均符合验证要求;BCA法检测结果与优化后的凯氏定氮法相关性良好.结论 优化了检测人FⅧ蛋白质含量的BCA方法,该法用于人FⅧ生产工艺中间品的质量控制是可行的.
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S/D法及干热法对人凝血因子Ⅷ制品中猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒灭活效果的验证
目的 验证S/D法及干热法对人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品中猪伪狂犬病病毒(pesdorabies virus,PRV)和猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)的灭活效果.方法 以PRV和PPV为指示病毒,模拟FⅧ生产工艺中的S/D及干热病毒灭活工艺,采用96孔板微量细胞病变法检测3批FⅧ半成品的残留病毒滴度.结果 批号为201203002、2012-04003、201204004 3批FⅧ半成品经(25±1)℃S/D灭活处理15 min后,PRV滴度分别下降≥6.5、≥6.8、≥6.8 lgTCID50/0.1 ml;经(100±2)℃干热灭活30 min后,PPV滴度分别下降4.00、3.92、3.94 lgTCID50/0.1ml.结论 S/D法及干热法分别对FⅧ制品中PRV和PPV具有良好的灭活效果,本实验为凝血因子类制品的病毒灭活验证工艺的研究奠定了基础.
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重组人凝血因子Ⅷ产品中CHO细胞DNA残留量的检测
目的 建立特异的重组人凝血因子Ⅷ产品中CHO细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证及初步应用.方法 采用磁珠分离法提取样品中残留的CHO细胞DNA,再利用Taqman探针法对样品和标准DNA进行Q-PCR检测,根据标准曲线进行DNA残留量分析.对建立的方法进行专属性、准确性、重复性及中间精密度验证,并对重组人凝血因子Ⅷ原液的CHO细胞DNA残留量进行检测.结果 该方法DNA浓度在0.003 ～ 300 pg/μL范围内,线性关系良好,R2为0.999,灵敏度可达0.003 pg/μL;对大肠埃希菌DNA无特异性扩增曲线,专属性良好;检测高、中、低浓度DNA加标量样品的回收率分别为82.68％、71.75％和72.67％,准确性良好;重复性检测的RSD为7.02％,中间精密度检测的RSD为9.31％,重复性及精密度良好.用该方法检测的3批重组人凝血因子Ⅷ原液的DNA残留量均远低于100 pg/剂量.结论 成功建立了特异的CHO细胞DNA残留量的检测方法,该方法专属性好,准确性及精密度高,可作为CHO宿主细胞DNA残留量的常规检测方法.
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一种离子交换层析制备人凝血因子Ⅷ方法的建立及保护剂配方的筛选
目的 建立一种离子交换层析结合病毒灭活方式获得人凝血因子Ⅷ(FⅧ)的方法,并筛选其保护剂配方.方法 采用聚乙二醇沉淀法及离子交换层析法对血浆来源的冷沉淀进行纯化,经S/D和80℃72 h干热两步病毒灭活法进行病毒灭活,验证灭活效果,并筛选佳保护剂配方.结果 聚乙二醇沉淀后的FⅧ纯度较新鲜血浆提高了约110倍,离子交换层析纯化后FⅧ纯度提高30倍以上;S/D和80℃72 h干热法的灭活效果良好.佳保护剂配方为0.01 mol/L枸橼酸钠、0.001 mol/L氯化钙、8 mg/ml白蛋白和40 mg/ml盐酸精氨酸.结论 该方法可制备纯度较高、稳定性和安全性较好的FⅧ制品,确定的保护剂配方对干热灭活的耐受性良好.
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人凝血因子Ⅷ活性生物检定统计法(显色法)的建立
目的 依据《欧洲药典》8.0版规定的生物统计检定法原理,建立检测人凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性的显色法.方法 采用斜率比模型中随机区组设计显色法实验,进行数据统计分析及结果计算.以FⅧ国际标准品及FⅧ原液、成品为测试样品,确定其线性范围,并验证其重复性、中间精密度、专属性;用《中国药典》三部(2010版)规定的一期法和建立的方法进行比较.结果 当FⅧ效价在0～ 17.85 IU/L范围内时,标准品和样品的线性相关系数(r)均大于0.99;重复性相对标准偏差(RSD)为2.1％;2位实验人员测定结果经t检验,差异无统计学意义(P＞0.05);该方法置信限范围为80％～120％.两种方法检测结果差异无统计学意义(P＞0.05).结论 该方法操作简便、快速,测定结果稳定、准确,检测水平符合《欧洲药典》要求,可用于FⅧ活性检测.
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两种不同工艺制备的人凝血因子Ⅷ的比较
目的 比较甘氨酸/NaC1沉淀工艺(盐析工艺)和层析工艺制备的人凝血因子Ⅷ(FⅧ).方法 对盐析工艺和层析工艺制备的工艺过程样品和成品,采用双缩脲法检测蛋白含量,ACL7000血凝仪检测FⅧ凝固活性,并计算比活性,按《中国药典》三部(2010版)要求进行Tween-80残留量、TNBP残留量、外观、可见异物、水分、热原和异常毒性检测.结果 层析工艺中以新鲜冰冻血浆为原料制备冷沉淀能较好地保证FⅧ的收率;聚乙二醇沉淀步骤能降低操作体积;层析处理能有效去除杂蛋白,使FⅧ比活至少提高25倍;S/D和80 ℃ 72 h病毒灭活处理对FⅧ质量无明显影响.两种工艺制备成品的外观、可见异物、异常毒性和热原检查均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定,但层析工艺中FⅧ比活明显高于盐析工艺,并且对TNBP和Tween-80的去除效果更显著.结论 层析工艺制备的FⅧ比活、Tween-80和TNBP残留量等关键性指标均优于甘氨酸/NaCl沉淀工艺,该工艺更适于FⅧ的规模化生产.
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人凝血因子Ⅷ工艺过程效价检测与分析
目的 测定人凝血因子Ⅷ(human coagulation factor Ⅷ,FⅧ)生产过程中各关键质控点的FⅧ活性,计算各工序收率.方法 采用FⅧ效价测定法(一期法)测定原料血浆、冷沉淀溶解液、化学沉淀后溶液、S/D病毒灭活后溶液、层析纯化洗脱液、超滤后原液、冻干后样品及干热后样品中FⅧ的效价;Lowry法测定各样品的蛋白含量并计算比活;根据各步制品的效价和重量计算各工序FⅧ活性的收率.结果 10批血浆中FⅧ效价平均值为(0.62±0.17) IU/ml,比活平均值(0.011±0.003) IU/mg;FⅧ活性在各步工序中回收率为:离心冷沉淀工序73.78％,化学沉淀工序79.64％,S/D病毒灭活工序93.10％,离子交换层析工序64.96％,超滤工序94.20％,冻干工序90.33％,干热病毒灭活工序79.25％,整个工艺FⅧ的总活性回收率23.96％.按照血浆中FⅧ平均含量0.62 IU/ml计算,每升血浆可产出FⅧ149 IU.7批FⅧ的生产过程中,原液中FⅧ比活较冷沉淀平均提高了170倍.结论 获得了由原料血浆到FⅧ成品各关键工序的收率,为生产出高纯度、高质量的FⅧ提供了数据支持.
