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注射用糜蛋白酶的比活与纯度研究
目的 分别建立一种适用于注射用糜蛋白酶比活测定的方法以及RP-HPLC纯度测定方法.方法 采用凯氏定氮法测定注射用糜蛋白酶中的总蛋白质含量,再结合效价计算出比活.纯度采用Grace 214TP C4色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),以0.1％三氟乙酸水溶液和0.09％三氟乙酸乙腈为流动相进行梯度洗脱,流速1.0ml/min,检测波长214nm,柱温30℃.由凯氏定氮法得到的比活结果与采用RP-HPLC法测得的纯度结果呈显著正相关(r=0.940,P＜0.01,n=5).结果 两种方法重复性、精密度和加样回收率均良好,可用于注射用糜蛋白的质控.结论 对于多组分的生化药物,在主成分能与杂质分离的情况下,可采用纯度法来控制投料质量,而对于成分复杂者,则可考虑用比活代替纯度来进行质量控制.
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人凝血因子Ⅷ工艺过程效价检测与分析
目的 测定人凝血因子Ⅷ(human coagulation factor Ⅷ,FⅧ)生产过程中各关键质控点的FⅧ活性,计算各工序收率.方法 采用FⅧ效价测定法(一期法)测定原料血浆、冷沉淀溶解液、化学沉淀后溶液、S/D病毒灭活后溶液、层析纯化洗脱液、超滤后原液、冻干后样品及干热后样品中FⅧ的效价;Lowry法测定各样品的蛋白含量并计算比活;根据各步制品的效价和重量计算各工序FⅧ活性的收率.结果 10批血浆中FⅧ效价平均值为(0.62±0.17) IU/ml,比活平均值(0.011±0.003) IU/mg;FⅧ活性在各步工序中回收率为:离心冷沉淀工序73.78％,化学沉淀工序79.64％,S/D病毒灭活工序93.10％,离子交换层析工序64.96％,超滤工序94.20％,冻干工序90.33％,干热病毒灭活工序79.25％,整个工艺FⅧ的总活性回收率23.96％.按照血浆中FⅧ平均含量0.62 IU/ml计算,每升血浆可产出FⅧ149 IU.7批FⅧ的生产过程中,原液中FⅧ比活较冷沉淀平均提高了170倍.结论 获得了由原料血浆到FⅧ成品各关键工序的收率,为生产出高纯度、高质量的FⅧ提供了数据支持.
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蛋白质含量测定方法对乌司他丁比活的影响
目的 考察2种不同蛋白质含量测定方法对乌司他丁比活的影响.方法 分别采用凯氏定氮法和福林酚法对乌司他丁原料药中的蛋白质含量进行测定,再结合效价计算比活.结果 由凯氏定氮法得到的比活分别为4 035、3 933和4 010mg·mg-1;由《日本药局方》福林酚法得到的比活分别为3 472、3 360和3 423 mg·mg-1;由《中国药典》2010年版福林酚法得到的比活分别为3 621、3 503和3 570 mg·mg-1.结论 由《日本药局方》和《中国药典》福林酚法测得的蛋白质含量结果差异较小,但与凯氏定氮法测得的蛋白质含量差异较大.
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重组人白细胞介素-15包涵体离子交换柱复性与稀释复性的比较
目的比较重组人白细胞介素-15(rhIL-15)包涵体蛋白稀释复性法与离子交换柱复性法的效果.方法采用离子交换柱吸附变性包涵体蛋白,用含有复性剂的洗脱液洗脱复性,所得蛋白质比活和稀释复性法所得比活比较.结果两种方法所得目的蛋白质比活相近,但离子交换柱复性法目的蛋白质回收率高,试剂消耗少.结论对于rhIL-15包涵体,离子交换柱复性法用于生产,可大幅降低生产成本.
关键词： 重组人白细胞介素-15 离子交换柱 复性 稀释 比活 -
洗脱条件及其因素对凝血酶原复合物有效成分的影响
目的 探讨洗脱条件及其因素对凝血酶原复合物(PCC)中凝血因子(F)Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ及蛋白(P)C、S、Z、抗凝血酶(AT)8种有效成分收率及比活的影响.方法 选择洗脱条件中柠檬酸钠、NaCl、pH 3种可变因素,每因素取3水平,根据正交表配制不同洗脱体系；采用DEAE-Sephadex A-50凝胶,相同平衡、洗涤条件及上述不同洗脱体系,批式吸附法制备PCC浓缩物；检测浓缩物中8种成分的活性或含量,获得各成分的收率及比活；正交试验分析不同洗脱条件及其因素对8种成分收率及比活的影响.结果 不同洗脱条件8种成分收率及比活有一定差异,2.4 mol/L NaCl条件比活总体较高.在所考察范围内,柠檬酸钠对FⅡ、FⅨ、FⅩ、PC、AT收率和PC、PS、AT比活有较大影响；NaCl对FⅦ、FⅩ、PS、PZ收率和FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ、PZ比活有较大影响.不同水平条件,柠檬酸钠及NaCl含量越高,4种凝血因子收率与比活越高,但对4种抗凝蛋白收率及比活影响无规律；pH6.6水平,4种凝血因子收率较高,pH6.9,其比活较高,pH对4种抗凝蛋白收率与比活的影响无规律.结论 洗脱条件中高浓度的NaCl可提高PCC的整体比活；低浓度的柠檬酸钠对PCC有效成分收率及比活也有较大影响；pH对PCC中凝血因子(FⅡ,Ⅶ,Ⅸ,Ⅹ)收率及比活的影响分别有共性,对抗凝蛋白(PC,PS,PZ,AT)的影响则无规律.
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不同吸附体系及因素水平对PCC中4类抗凝蛋白的影响研究
目的 探讨不同吸附体系及其柠檬酸钠、氯化钠、pH、电导4因素对凝血酶原复合物(PCC)中蛋白C、蛋白S、蛋白Z、抗凝血酶收率及比活的影响.方法 选择柠檬酸钠、氯化钠、pH3因素3水平设计正交试验,配制9种PCC平衡吸附体系；凝胶平衡后,吸附血浆,洗涤、洗脱,制备PCC浓缩物；测定浓缩物中蛋白C和S、抗凝血酶活性、蛋白Z含量、总体积及蛋白浓度,获得四类抗凝蛋白收率及比活,比较不同吸附体系收率、比活总趋势；利用正交试验直观分析法分析柠檬酸钠、氯化钠、pH对蛋白C、S和Z收率及比活的影响；测定吸附体系电导率,分析电导率与4类抗凝蛋白收率及比活的关系.结果 不同吸附体系4类抗凝蛋白收率及比活有较大差异,抗凝血酶二者均极低.柠檬酸钠对蛋白C收率及比活、蛋白S收率影响较大；pH对蛋白S比活、蛋白Z收率及比活影响极差分别为:0.120、6.847、0.716,高于其他因素；氯化钠对其影响均小.柠檬酸钠浓度越低,蛋白C收率及比活越高,蛋白S收率则越低,0.015 mol/L水平蛋白Z收率为49.11％,高于其他水平,而蛋白S和Z比活低；pH越低,蛋白Z收率则越高,pH7.0水平蛋白C和S收率及比活、蛋白Z比活高；氯化钠浓度0.075 mol/L水平,蛋白C收率及比活、蛋白S和Z比活分别为:29.37％、0.533 IU/mg、0.401 IU/mg、2.362 μg/mg,均高于其他水平,而蛋白S、Z收率低.不同电导率条件,蛋白C收率及蛋白Z比活变化较大,其中蛋白Z与S收率、蛋白Z与S比活、蛋白C收率与比活变化趋势基本一致；(10.00±0.20) ms/cm条件,蛋白C、S和Z比活较高.结论 不同吸附体系抗凝血酶收率及比活均极低,蛋白C、S和Z收率及比活间无规律性.氯化钠对蛋白C、S和Z收率及比活影响较小,柠檬酸钠、氯化钠、pH不同水平对蛋白C、S和Z收率影响效应无共性,0.01 mol/L柠檬酸钠,0.075 mol/L氯化钠、pH7.0水平蛋白C、S和Z比活佳.电导率与四类抗凝蛋白收率及比活间无线性关系.
