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人白细胞介素-24基因的克隆、表达和纯化
目的对人白细胞介素-24(hIL-24)进行克隆、表达和纯化.方法分离人外周血单个核细胞,Con A刺激培养,提取细胞总RNA,应用RT-PCR技术从外周血单个核细胞中扩增hIL-24成熟肽编码区,定向克隆至融合表达载体pGEX-4T-1,重组载体pGEX-4T-1/hIL-24经DNA测序鉴定后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,阴离子交换层析纯化融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果所得hIL-24基因经序列分析,与GenBank公布一致.所构建融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24测序正确,转化BL21(DE3)后,37℃诱导表达相对分子质量约为44 000的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的30.63%.经纯化后,纯度达85%以上.Western blot检测能与兔抗人IL-24的多克隆抗血清发生结合反应.结论已成功构建了hIL-24的融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24,并在大肠杆菌中高效表达,纯化后获得了高纯度的融合蛋白,为hIL-24的功能及活性研究奠定基础.
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两种层析方法纯化轮状病毒效果的比较
目的 比较两种不同的凝胶层析纯化方法对人轮状病毒(Rotavirus,RV)的纯化效果及其对病毒抗原性和免疫原性的影响.方法 病毒收获液经超滤浓缩后,分别采用Q Sepharose Fast Flow(QFF)离子交换层析和Sepharose 4 Fast Flow (4FF)凝胶过滤层析纯化,采用A群轮状病毒诊断试剂盒(胶体金)检测纯化病毒的抗原性;电镜观察病毒的形态;荧光灶法测定病毒纯化前后的感染性滴度;双抗体夹心ELISA法测定抗原含量;Lowry法测定纯化前后样品的蛋白含量;SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化的病毒蛋白;纯化病毒经灭活后,PAGE分析病毒的核酸带型,免疫小鼠,检测纯化病毒的免疫原性.结果 QFF洗脱峰1和4FF洗脱峰1为RV抗原阳性,电镜观察可见完整的、大小约70 nm的RV颗粒;经QFF和4FF层析纯化后,病毒的感染性滴度分别为7.10和4.50 lgCCID50/ml,终抗原同收率分别为65.3％和11.8％,病毒液总蛋白去除率分别为99.68％和99.52％;SDS-PAGE分析显示,经QFF和4FF纯化的样品未见明显杂蛋白条带,且特异性良好;纯化病毒灭活后,病毒基因组带型未发生改变,且保持了良好的抗原性和免疫原性.结论 两种凝胶层析方法均能纯化人轮状病毒,综合比较,QFF离子交换层析纯化效果优于4FF凝胶过滤层析.
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一种离子交换层析制备人凝血因子Ⅷ方法的建立及保护剂配方的筛选
目的 建立一种离子交换层析结合病毒灭活方式获得人凝血因子Ⅷ(FⅧ)的方法,并筛选其保护剂配方.方法 采用聚乙二醇沉淀法及离子交换层析法对血浆来源的冷沉淀进行纯化,经S/D和80℃72 h干热两步病毒灭活法进行病毒灭活,验证灭活效果,并筛选佳保护剂配方.结果 聚乙二醇沉淀后的FⅧ纯度较新鲜血浆提高了约110倍,离子交换层析纯化后FⅧ纯度提高30倍以上;S/D和80℃72 h干热法的灭活效果良好.佳保护剂配方为0.01 mol/L枸橼酸钠、0.001 mol/L氯化钙、8 mg/ml白蛋白和40 mg/ml盐酸精氨酸.结论 该方法可制备纯度较高、稳定性和安全性较好的FⅧ制品,确定的保护剂配方对干热灭活的耐受性良好.
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低浓度单克隆抗体的分离纯化
目的从杂交瘤细胞的培养上清中纯化低浓度单克隆抗体.方法采用离子交换层析与凝胶过滤相结合进行分离纯化.结果纯化的IgG抗体纯度＞90%,总回收率为34%.结论除了杂蛋白的等电点与目的蛋白相近的情况外,这种方法可应用于低浓度蛋白的分离纯化.
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抗真菌蛋白质的分离纯化
目的试图从霉菌培养液中分离纯化抗真菌活性蛋白质.方法用离子交换层析法分离,用反向高效液相色谱法进一步纯化,经N-三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶电泳分析确定其相对分子质量.结果从黑曲霉菌培养上清液中分离出一种具有抗真菌活性的蛋白质(AFP).纯化后得到高活性的精制AFP.相对分子质量约为9 000,经MTT法检测5种真菌具有明显抗真菌活性.结论本研究为抗菌药物及防腐剂的开发提供了依据.
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木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化及性质研究
目的建立简单有效的木瓜凝乳蛋白酶分离纯化方法,并研究其酶学性质.方法采用离子交换层析直接将木瓜凝乳蛋白酶分离纯化,通过温度、葡萄糖、盐酸胍及其他因素研究酶学性质.结果木瓜凝乳蛋白酶有较高的热稳定性,盐酸胍对其有抑制作用,葡萄糖对其有激活作用.结论离子交换层析是简单有效的分离纯化木瓜凝乳蛋白酶的方法,木瓜凝乳蛋白酶值得进一步开发利用.
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Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗纯化工艺的建立
目的 建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)纯化工艺.方法 采用Sepharose CL-6B凝胶过滤和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析两步纯化法纯化脊髓灰质炎病毒,进行各项检定后再经除菌过滤和灭活.结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒纯化后的蛋白去除率均不低于98.81%,病毒滴度分别为8.75、8.50和8.63 IgCCID_(50)/ml,DNA残留量均＜100 pg/ml.除菌过滤和灭活后,D抗原含量略有下降.结论 已建立了Sabin株IPV的纯化工艺,纯化后制备出了高纯度的Sabin株IPV.
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梅花鹿鹿茸活性多肽的提取及免疫功效的初步研究
目的 提取并分离纯化不同加工方法处理的梅花鹿鹿茸活性多肽(PAP),并对其免疫功效进行初步研究.方法 以不同工艺处理的鹿茸为原料,应用分子排阻层析和离子交换层析提取鹿茸活性多肽,通过淋巴细胞增殖、细胞因子产生等试验,检测PAP对淋巴细胞的免疫功效.结果 所提取的梅花鹿鹿茸活性多肽蛋白含量分别为:冻干茸9.20 mg/ml;冷冻鲜茸1.30 mg/ml;热炸茸1.10 mg/ml.鹿茸多肽可以促进小鼠T、B淋巴细胞的增殖,活化巨噬细胞分泌IL-12,对机体有免疫增强作用.结论 梅花鹿鹿茸活性多肽对机体的细胞免疫有显著增强作用.
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重组人尿激酶原纯化工艺病毒去除效果验证
目的 验证重组人尿激酶原(Prourokinase,Pro-uk)纯化工艺的病毒去除效果.方法 采用模拟Pro-uk纯化工艺中阴离子和阳离子交换层析的scale-down模型,以水泡性口炎病毒(Vesivular stomatitis virus,VSV)、脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)、人单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type-1,HSV-1)为指示病毒.采用细胞病变法评价离子交换层析的病毒去除效果.结果 阴离子交换层析对脂包膜病毒VSV和HSV-1的去除能力强,对无脂包膜病毒EMCV的去除能力较弱;阳离子交换层析对VSV和HSV-1的去除能力较弱,对EMCV的去除能力较强.经离子交换层析纯化后,3种指示病毒的累计去除效率均＞99.99%(大于4 log10).结论 Pro-uk纯化工艺中的离子交换层析是控制病毒安全性的有效步骤,其去除效率达到了<生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则>规定的安全标准.
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人表皮丝集蛋白的纯化和鉴定
丝集蛋白是类风湿关节炎相关的自身抗体. 利用乙醇沉淀、HiPrep 16/10 QXL凝胶结合高效液相色谱离子交换层析(HPLC)纯化人表皮丝集蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳确定相对分子质量,并采用免疫印迹法(Western blot)、用抗丝集蛋白单克隆抗体进行鉴定. 所获得的表皮细胞丝集蛋白相对分子质量44 000,纯度达到电泳纯,经免疫印迹法鉴定,抗原性良好. 表明利用乙醇沉淀法结合HPLC系统,可高效、简便、快速地分离和纯化人表皮丝集蛋白.
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C1q、C1r和C1s的快速分离
建立了一种同时快速分离纯化C1q及酶原形式C1r和C1s的方法.用IgG-Sepharose 4B亲和层析将C1q与C1r2s2分离,接着用DEAE-Sephacel离子交换层析将C1r和C1s分离,用C1q McAb-Sepharose 4B亲和层析将C1q进一步纯化.在分离C1r和C1s的整个过程中加入蛋白水解抑制剂PMSF和NPGB,并控制温度在4℃、pH 6.1、无二价阳离子的条件下,得到高度纯化的C1q、Clr和C1s.
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尿8-羟-2'-脱氧鸟苷与恶性肿瘤相关性的研究
目的用电化学法测定人尿中8-羟-2′-脱氧鸟苷(OH8dG)浓度,并探讨其与癌症的关系.方法尿液依次通过阳、阴离子交换层析后,采用HPLC-ECD检测其中的OH8dG浓度.结果该法线性范围为1～100 μg/L,低检出限为1 μg/L,癌症患者尿中排出的OH8dG明显高于健康成年人(P<0.01).结论该方法灵敏度高,尿液中OH8dG的浓度与恶性肿瘤呈正相关,为肿瘤研究提供一条全新途径.
关键词： 8-羟-2'-脱氧鸟苷 离子交换层析 高效液相色谱法 癌症 -
酸性成纤维细胞生长因子的分离纯化及活性鉴定
目的:从牛脑中分离纯化酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)并鉴定生物活性.方法:根据Denis GOSPODAROWICZ的方法,新鲜牛脑匀浆,三步硫酸铵盐析,后沉淀物溶解透析后予离子交换层析及琼脂糖凝胶亲和层析.促3T3细胞DNA合成率鉴定生物活性.结果:用1.0 mol/L NaCl的缓冲液洗脱得到分子量为13 600的多肽,得率为610 μg/kg牛脑.氨基酸组成分析与已知的aFGF相同.促3T3细胞DNA合成的低浓度为0.5 ng/ml,大效应浓度50 ng/ml,ED50值为8 ng/ml.结论:aFGF具有强烈的促细胞增殖作用.
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门冬酰胺酶用DEAE-Sephadex A-50层析法纯化的研究
采用DEAE-Sephadex A-50层析纯化门冬酰胺酶,HPLC检测结果表明,产品纯度和收率均有提高.
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层析法去除基因重组 125Ser-IL-2产品中细菌内毒素
针对细菌内毒素的化学性质,比较了用亲和层析法、离子交换层析法和疏水相互作用层析法等3种层析法去除基因重组 125Ser-IL-2产品中细菌内毒素的效果.结果表明,亲和层析法的效果好,但综合各方面的因素,离子交换层析法更实用.
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一种分离纯化透明质酸的新型离子交换剂
以含有多个氮原子的组氨酸对强碱型阴离子树脂进行修饰,获得一种新型的离子交换剂.用该离子交换剂对透明质酸粗品进行离子交换层析,使透明质酸与蛋白质、核酸达到有效的分离.
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透明质酸的离子交换层析纯化
采用强酸型阳离子树脂为交换剂的离子交换柱,和经组氨酸基团修饰的强碱型阴离子树脂为交换剂的离子交换层析柱串联,以氯化钠溶液为洗脱剂,对透明质酸粗品进行分离和纯化.得到的透明质酸精品的蛋白质含量低于0.075%,平均分子量大于9.41×105,纯化收率为58%～61%.并对洗脱剂的流速、浓度、pH等条件进行比较,确定了佳洗脱条件.
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山羊β-酪蛋白的分离和抗体的制备
目的纯化山羊奶中的β-酪蛋白,并制备多克隆抗体.方法用DEAE阴离子交换层析分离羊奶中的β-酪蛋白,将其免疫新西兰兔,免疫印迹分析分离的兔血清.结果测序结果验证了分离产物为山羊β-酪蛋白,ELISA检测表明获得了高效价的抗血清,免疫印迹分析表明,制备的抗血清可与羊奶中的β-酪蛋白发生特异的免疫反应.结论获得了兔抗山羊β-酪蛋白的特异性多克隆抗体.
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重组猪胰蛋白酶突变体基因在大肠杆菌中的克隆、表达与活性分析
胰蛋白酶是肽链内切酶,专一性水解多肽链中赖氨酸和精氨酸羧基端形成的肽键.胰蛋白酶切割胰岛素原生成胰岛素,在胰岛素的生产中发挥着重要作用,但由于胰蛋白酶对赖氨酸和精氨酸的切割选择性差别不大,会在切割反应中产生副产物.所以研究开发对底物切割选择性增强的胰蛋白酶,减少胰岛素生产过程中副产物的产生具有较高的应用价值.以猪源胰蛋白酶原基因为模板,通过重叠延伸产生特异位点突变的方法扩增突变胰蛋白酶原(TgM)基因,该基因编码猪胰蛋白酶的Ser172Ala突变体.将TgM基因插入到表达载体pET28a中,转化E.coli DH5α,利用卡那霉素抗性筛选出构建成功的重组质粒pET28a-TgM并将其转化E.coli BL21(DE3),构建含TgM基因的工程菌株并诱导表达.14％ SDS-PAGE显示,重组菌经乳糖诱导后表达了目的蛋白,并以包涵体形式存在.包涵体经尿素裂解液变性后,通过稀释法复性,复性液超滤处理并用胰蛋白酶切割,经DEAE-FF离子交换层析分离纯化.纯化蛋白经SDS-PAGE分析,结果表明与胰蛋白酶条带位置相同;用紫外分光光度法检测酶活力,测得突变胰蛋白酶的酶活力为1 300 U/mL,比活力为1 566.27 U/mg.将终纯化获得的突变胰蛋白酶用于胰岛素原的切割,HPLC检测分析结果表明,突变胰蛋白酶对底物中Arg的切割选择性大于Lys,因此在对胰岛素原的切割反应中,副产物的量明显减少.
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SP-sephadex C25离子交换层析纯化细胞色素C的工艺研究
目的:研究SP-sephadex C25离子交换层析纯化细胞色素C的工艺.方法:用SP-sephadex C25树脂取代Amberlite IRC-50树脂对细胞色素C进行纯化.结果:SP-sephadex C25离子交换纯化细胞色素C一次层析收率达85%以上,纯度达98%左右.结论:SP-sephadex C25树脂用于细胞色素C的纯化,与用Amberlite IRC-50树脂相比,大大提高了层析得率和产品的纯度,提高了产品合格率.
